，同时铺3板，置于37°(：，5%0)2培 养箱中培养24h待细胞贴壁；（5)24小时细胞贴壁后在超净台中将6孔板分为阴性对照组和 实验组分别予以不同处理，阴性对照组加 lmL培养基，实验组再分为化合物（I)组、PDTC组及 联合用药组3个亚组，每孔加 lmL药物。化合物（I)组终浓度为100ymol/L，PDTC组终浓度为 100μ mol/L，两药联合组终浓度为两种药物各为50ymol/L。每组设2个复孔。（6)置于37°C， 5 % C02的细胞培养箱中继续培养。
[0045] 5.2TUNEL法操作步骤
[0046] (1)细胞爬片加药培养24h时取出6孔板，按照TUNEL说明书依次进行如下步骤；（2) 小心吸弃每孔里的上清液；（3)每个孔加入PBS (4°C ) 2mL，平板摇床冲洗5min X 3次；（4)每孔 加入lmL预冷细胞固定液，4 °C冰箱固定30min。（ 5)吸弃固定液，每个孔加入roS (4 °C) 2mL，平 板摇床冲洗5min X 3次。（6)浸入封闭液中，室温（15 °C~25 °C )封闭1 Omin。（ 7)每个孔加入 PBS(4°C)2mL，平板摇床冲洗5minX3次。样品周围用吸水纸吸干。（8)每个样本滴加50yL TdT酶反应液，37°C，避光湿润反应60min。（9)每个孔加入roS(4°C) 2mL，平板摇床冲洗5min x 3次。样品周围用吸水纸吸干。（10)滴加50yL Streptavidin-HRP工作液，37 °C，避光湿润 反应30min。（ 11)每个孔加入PBS(4°C)2mL，平板摇床冲洗5minX3次。（12)滴加100yL DAB工 作液，室温显色反应1〇11^11。（13)每个孔加入PBS(4°C)2mL，平板摇床冲洗5minX3次。（14)光 学显微镜下观察拍照:随机选取10个高倍（X 100)视野，每个视野计数100个细胞，计算调亡 指数的平均值。凋亡指数(AI)=(阳性细胞数/总细胞数X 100% )。阳性细胞的细胞核呈棕 褐色。
[0047] 6、统计学分析
[0048] 采用SPSS 11.5进行分析，符合JH态分布的计量资料以表示，组间比较用Oneway- AN0VA法进行分析，两两比较采用LSD-t法，P〈0.05为差异有统计学意义。
[0049]三、结果及结论
[0050] 1、MTT检测药物对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制率
[00511 经3次重复MTT，检测结果显示，单个药物作用于胃癌细胞72h后，100μ mol/L的药物 组较50ymol/L的药物组对胃癌细胞的生长抑制率均较高，差异有统计学意义(P〈0.05) ΑΟμ mol/L的化合物（I)对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25ymol/L组差异无统计学意 义(ΡΧλΟδΚδΟμ mol/Ι的TOTC对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25ymol/L组相比， 差异有统计学意义(P〈0.05)。联合用药50/50ymol/L组对胃癌细胞的生长抑制率高于各个 高浓度单药组（100μ mol/L)对胃癌细胞的生长抑制率，差异有统计学意义(P〈0.001)，见表1 (*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01)。
[0052] 2、TUNEL法检测各组凋亡指数
[0053]化合物（I)、PDTC及联合用药组均对胃癌细胞SGC-7901有抑制生长的作用，各组与 阴性对照组比较差异均有统计学意义(P〈〇.001)，阴性对照组有少量细胞的胞核被染成棕 褐色，各个单药组与联合用药组凋亡细胞较阴性对照组相比均有增加，联合用药组细胞的 凋亡指数最高，对胃癌细胞的抑制效果更显著。见表2(**P〈0.01)。
[0054]结论，PDTC与化合物⑴两药单独作用于胃癌细胞均可以抑制癌细胞的增殖，促进 细胞的凋亡，随着浓度的增大，对胃癌细胞的抑制生长作用呈增强趋势，两种药物联合应用 后促进胃癌细胞的凋亡效果更显著，细胞的生长抑制率及凋亡指数均较单独用药组升高。 研究发现totc及化合物（I)两种药物联合应用对胃癌细胞的抑制作用更显著，且两种药物 均为非传统意义的化疗药物，对机体的损害小，而且避免了肿瘤细胞对传统化疗药物的耐 药性，可以为今后胃癌的临床治疗提供参考。
[0055] 表1各药物组不同时间点对胃癌细胞的生长抑制率(n = 5, [±s:)
[0056]
[0057] 表2药物作用24h后各组细胞的凋亡指数(n = 3, S±s)
[0058]
[0059] 实施例3
[0060] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0061] 实施例4
[0062] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0063] 实施例5
[0064] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0065] 实施例6
[0066] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0067] 实施例7
[0068] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0069] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将合子 草的干燥全草粉碎，用80~90 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用15 %乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步 骤(b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、55:1、35:1、15:1和1: 1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依 次用体积比为20:1、15:1和10:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组 分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为80 %的甲醇水溶液等度洗脱， 收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用85%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于:该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化 合物(I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗胃癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的共轭茋化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的共轭茋类化合物，可以从合子草的干燥全草中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可以抑制胃癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，随着浓度的增大，对胃癌细胞的抑制生长作用呈增强趋势，可以用来开发成治疗胃癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, C07C43/23, C07C41/34
【公开号】CN105566075
【申请号】CN201511019270
【发明人】吴金凤
【申请人】吴金凤
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月29日