化合物潜在的抗hRSV的效力，在斑点计数时选 择斑点数在50-100个之间的孔进行计数。在对化合物的测试过程中，可以在4 °C条件下对 病毒吸附阶段用化合物处理1小时，以分析化合物在病毒入侵过程中的作用，可以在37°C条 件下对病毒吸附后的阶段用化合物处理72小时，以分析化合物在病毒复制过程中的作用， 可以在病毒感染的全程阶段进行化合物处理，以分析化合物在病毒感染全过程中的作用。 达到抑制50%病毒复制功效的化合物浓度(IC 5Q)的计算是由斑点计数(病毒吸附阶段分析） 或斑点尺寸测量(病毒复制阶段分析)并借助GraphPad Prism软件(GraphPad Software，美 国加利福尼亚的拉霍亚市)经非线性回归分析确定。在评估化合物的细胞毒性时，我们使用 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊的 Promega公司制造)并按照试剂盒操作说明来分析在上述试验条件下待检化合物对细胞活 力的影响。
[0087]详细的操作步骤如下：
[0088]第一天:细胞接种-将Hep2细胞以2E5/孔的密度接种在24孔板中，使用0.5ml的含 10%胎牛血清的DMEM培养基培养，培养条件37°C，5%C02，培养时间16~24h。
[0089]第二天:药物处理和病毒感染。
[0090] 1.药物稀释:稀释液是含有25%DMS0的DMEM，将药物浓度稀释到800μΜ和200μΜ;
[0091] 2.病毒稀释：稀释液是含有2%胎牛血清的DMEM，hRSV病毒毒种是hRSV Long-P9 (2.9E7pfu/ml)，保存在-80°C，毒种的融化和使用均在冰上进行，MOI = 0.1;
[0092] 3.药物处理和病毒感染:将24孔板中原有培养基弃掉，PBS清洗细胞一次，加入稀 释的病毒液〇. 5ml，稀释的药物5μ1，使得病毒感染复数Μ0Ι = 0.1，并且药物的终浓度是8μΜ 或 2μΜ;
[0093] 4.将上述细胞板置于37°C，5%C02条件下培养3天，并观察细胞病变；
[0094]第四天:使用新的Hep2细胞铺板用于滴度检测。
[0095] 将HEp-2细胞以1.5E5/孔的密度接种在24孔板中，在37°C，5%C02条件下培养16~ Mlo
[0096]第五天:收集病毒并进行病毒滴度检测。
[0097] 1.将第二天处理的24孔板放置于_80°C超低温冰箱lh，然后置于冰上融化，将孔中 的病毒液收集到离心管中（冰上进行）。将以上离心管进行8000rpm离心5min，然后取出50μ1 上清液用于病毒滴度检测，剩余的病毒样本保存在_80°C超低温冰箱中；
[0098] 2.病毒稀释:准备6个1.5ml的离心管，标记后置于冰上，加入270μ1的含2%胎牛血 清的DMEM培养基，从待检病毒样本原液开始，30μ1加入到270μ1的稀释液中，以此方式继续 稀释，获得10-1到10-6的病毒稀释液；
[0099] 3.弃掉细胞培养基，PBS清洗细胞1次；
[0100] 4.将200μ1的病毒稀释液对应地加入到单层的ΗΕρ-2细胞中；
[0101] 5.在37°C，5%C02条件下孵育1.5h，并且每15min振荡细胞培养板一次；
[0102] 6.期间将含0.8 % CMC，2 %胎牛血清的DMEM培养基置于37 °C水浴锅中lh，当病毒感 染1.5h后，弃掉病毒液，PBS清洗细胞2次，最终加入500μ1的0.8 % CMC，2 %胎牛血清的DMEM 培养基，在37 °C，5 % C02条件下培养3天。
[0103] 第八天：
[0104] 1.弃掉含CMC的培养基，在冰上使用PBS清洗细胞1次；
[0105] 2.使用4%的多聚甲醛固定液固定细胞20min，之后用PBS清洗1次，风干；
[0106] 3 ·使用含0 · 25 % tritonX-100的PBS处理细胞20min，之后用PBS清洗3次，每次 4min；
[0107] 4.在孔中加入200μ1的稀释后的一抗(hRSV-F抗体，1:1000)，一抗用含有5%脱脂 奶的PBS进行稀释，室温孵育lh;
[0108] 5.使用含有0.02 % Tween20的PBS进行孔板的洗涤，共洗3次，每次4min;
[0109] 6 ·在孔中加入200μ1 的稀释后的二抗（HRP-conjugated goatanti-mouse，1: 6000 )，二抗用含有5 %脱脂奶的PBS进行稀释，室温孵育lh;
[0110] 7.使用含有0.02 % Tween20的PBS进行孔板的洗涤，共洗3次，每次4min;
[0111] 8.在孔中加入200μ1 True Blue substrate，室温避光反应超过lOmin，直至蓝色 斑点出现；
[0112] 9.使用流水冲洗孔板；
[0113] 10.将孔板干燥，并进行蓝色斑点的计数。
[0114] 参见附图4,可知化合物S1-2对呼吸道合胞病毒(RSV)复制能力的抑制比率的最大 值为99 %。
[0115] 4)测试S1-2对Hn信号通路的抑制作用。提前一天将NIH3T3细胞接种于6孔板(3X 1〇5细胞/孔），或12孔板（1.5 X 105细胞/孔），用含5%胎牛血清且不含抗生素的DMEM培养基 培养，以确保在转染时达到90-95%的汇合。将无血清培养基稀释的脂质体2000与稀释后的 质粒混合均匀（总容量lOO-lOOOul)，孵育后将其添加到含细胞和培养基的孔中，然后将孔 板放入C0 2培养箱中在37°C条件下孵育48h。在转染48h后，加入SAG直至其浓度达到0.5μΜ， 同时添加各种浓度的环杷明（CPM)类似物。继续培养48h后，将细胞清洗、裂解后转移到一个 96孔的白板上。添加 LAR II试剂(Promega，双荧光素酶报告系统，E1910)并在发光阅读器中 读取样本的数值。
[0116] 详细的操作步骤如下：
[0117] 第一天:在转染前一天，将NIH3T3接种于12孔板中，细胞密度为1.5E5cell/well， 培养基为含有5 % FBS的DMEM，无双抗，培养至转染时细胞密度在90-95 %。
[0118]第二天:按照Lipofectamine 2000的操作说明书进行转染试剂和质粒的准备：
[0119] 1 ·使用 250μ1 的 Opti-MEM 稀释 DNA(包括 Gli-bindingsite-luciferase 表达质粒和 Reni 1 la的表达质粒pRL-TK，二者比例为50:1)，轻柔混匀；
[0120] 2 ·将Lipofectamine 2000轻柔混勾，并在新的无菌离心管中使用250μ1的Opti-MEM稀释，轻柔混匀；
[0121] 3.当Lipofectamine 2000的孵育时间在5-30min范围内时，将稀释后的DNA与稀释 后的Lipofectamine 2000轻柔混勾，室温作用20min，使二者形成稳定的复合体；
[0122] 4.将DNA-Lipofectamine 2000复合体加入到细胞中，并将板轻柔地前后振荡混 匀；
[0123] 5.复合体与细胞孵育4_6h后，将培养基弃掉，加入生长培养基，并在37 °C，5 %⑶2 条件下培养48h。
[0124] 第四天：在转染48h后，进行药物的稀释，稀释液是含有0.5 %FBS、0.25 %DMS0的 DMEM培养基。将SAG化合物稀释至浓度为ΙμΜ，将CPM及其类似物稀释至浓度为20μΜ。取250μ1 ΙμΜ SAG和250μ1 20μΜ CPM(或其类似物）至同一个孔中，使得SAG终浓度是0.5μΜ，且CPM或 其类似物终浓度是1〇μΜ。
[0125] 第五天：
[0126] 1.弃掉生长培养基，PBS清洗细胞1次，弃掉；
[0127] 2.按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Pr〇mega，E1910)说明书进行细胞裂解， 每孔加入1〇〇μ1裂解液，室温晃动培养板15min;
[0128] 3.取20μ1裂解产物至96孔白板中，并加入50μ1 LAR II，读取萤火虫荧光素酶的信 号值；
[0129] 4.再加入50ul stop&Glo试剂，读取海参荧光素酶的信号值。
[0130]记录以上数据，并进行比值的计算。将所有数值扣除空白孔的背景值之后，将仅含 SAG(DMS0对照）的组别中萤火虫荧光素酶的信号值看做1，其他组计算比值，标记为比值1， 将仅含SAG(DMS0对照）的组别中海参荧光素酶的信号值看做1，其他组计算比值，标记为比 值2,最后计算比值1与比值2的比值，得到数据为该组处理的萤火虫荧光素酶的相对表达水 平(百分比）。
[0131] 参见附图5,可知环杷明（CPM)的类似物S1-2对基因表达的抑制作用并不显著，抑 制率仅为36%。这些数据表明，衍生于环杷明（CPM)的留体生物碱分子的抗呼吸道合胞病毒 (RSV)活性可以与Smo依赖引起的对Hh信号通路的抑制活性相分离。
[0132] 5)计算化合物S1-2的呼吸道合胞病毒复制和Hh活性抑制系数。参见附图6,可知化 合物S1-2的呼吸道合胞病毒复制和Hh活性抑制系数为1.44596,大于1，所以具有有利的抑 制特性。
[0133] 6)筛选化合物S1-2。参见附图6,可知化合物S1-2具备有利的抑制特性，因此可以 作为治疗呼吸道合胞病毒感染的化合物。
[0134] 实施例2
[0135] 制备一种环杷明（CPM)类似物S1-4,参见附图1、附图2和附图3,制备过程如下：
[0136] 1)制备中间物。制备过程同实施例1。
[0137] 2)制备化合物S1-4。制备过程同实施例1。
[0138] 3)测试S1-4对呼吸道合胞病毒复制的抑制作用。测试过程同实施例1。参见附图4， 可知化合物S1-4对呼吸道合胞病毒(RSV)复制能力的抑制比率的最大值为88%。
[0139] 4)测试S1-4对Hn信号通路的抑制作用。测试过程同实施例1。参见附图5,可知环杷 明（CPM)的类似物S1-4对基因表达的抑制作用并不显著，抑制率仅为5%。这些数据表明，衍 生于环杷明（CPM)的甾体生物碱分子的抗呼吸道合胞病毒(RSV)活性可以与Smo依赖引起的 对Hh信号通路的抑制活性相分离。
[0140] 5)计算化合物S1-4的呼吸道合胞病毒复制和Hh活性抑制系数。参见附图6,可知化 合物S1-4的呼吸道合胞病毒复制和Hh活性抑制系数为1.6172823，大于1，所以具有有利的 抑制特性。
[0141 ] 6)筛选化合物S1-4。参见附图6