基的能力，且具有剂 量依赖关系。通过计算可知，本发明黄酬类化合物清除径自由基的IC50值分别为771.02yg/ rnL ο
[0086] 3)ABTS自由基清除能力测定:7mM的ABTS和2.45mM的过硫酸钟等体积混合，于暗处 室溫反应16h，用pH7.2的憐酸缓冲液稀释50倍，至吸光度值0.7左右(734nm)。再吸取此稀释 液10化L加入含1(Κ)化不同浓度的样品，室溫反应5min，734nm测定吸光度值。
[0087] 清除率 ％ = 1-(A1-A2)/A0
[0088] A1:样品+ABTS的吸光度值;A2:样品+溶剂的吸光度值;AO: ABTS的吸光度值
[0089] 结果如图9显示，本发明黄酬类化合物具有清除ABTS自由基的能力，且具有剂量依 赖关系，在浓度30yg/mL时，对ABTS自由基的清除率接近100%。通过计算得，本发明黄酬类 化合物清除ABTS的IC5Q值分别为4.1祉g/血。
[0090] 4)还原能力测定：2扣L样品加入50化0.2M抑6.0PBS和25化的1%铁氯化钟，于45 。(:反应30min。再加入40μΙ 10%Ξ氯乙酸和60μΙ 0.1%Ξ氯化铁，700nm处测定吸光度值。
[0091] 结果如图10显示，本发明黄酬类化合物具有一定的还原能力，且具有剂量依赖关 系。
[0092] 2、抗肿瘤活性和免疫增强活性
[0093] W促RAW264.7巨隧细胞增殖、吞隧及产NO，抗HGC-27肿瘤细胞增殖，W及小鼠体内 抑瘤试验为试验平台，评价本发明黄酬类化合物的抗肿瘤活性和免疫增强活性。
[0094] (1)对巨隧细胞产NO的影响
[0095] RAW264.7 细胞培养：
[0096] RAW 264.7细胞^10%胎牛血清的3?]\〇-1640培养液培养于371：5%〇)2饱和湿度 空气的细胞培养箱中，每隔Id传代一次。传代时，用0.25%膜蛋白酶液消化贴壁的细胞60s 左右，倾倒出酶液，加入新鲜的含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培养液，并用吸管吹吸数次， W1:4比例传代培养。
[0097] NO的诱生：
[009引按1 X 106个/孔将对数生长期的RAW264.7巨隧细胞加入24孔板中。培养过夜后，将 样品按实验设计，加入24孔培养板，并WPB巧h足至终体积为1000化;每种浓度设3个平行 孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10,20，100,200yg/mL。同时，做阳性对照孔(加入终浓度 为lOyg/mL的LPS)。在37°C5%C02饱和湿度空气条件下培养2d。培养结束后，分别吸取培养 上清液，立即进行NO检测。
[0099] NO 检测：
[0100] 采用Griess法测定体系中NO的含量。NO不稳定，Griess法是测定由NO分解而成的 Ν0-2/Ν0-3的比例来反应其含量。
[0101] 标准曲线的绘制：
[0102] 准确称取NaN〇26.9g，Wdd出0定容至lOOmL，并进一步梯度稀释为浓度为100μΜ的工 作液。利用d地2〇将工作液稀释至终浓度50μΜ，40μΜ，30μΜ，20μΜ，1 ΟμΜ，5μΜ，2μΜ，ΟμΜ。于每孔 中加入等体积混合后的Griess试剂A液和Β液lOOyL。室溫反应20min后，于酶标仪上测定 540nm处吸光度。W标准品浓度和吸光度值为横纵坐标，绘制标准曲线。
[0103] 样品检测：
[0104] 在酶标板中准确加入样品作用后的培养上清液l(K)yL。于每孔中加入等体积混合 后的Griess试剂A液和B液l(K)yL。室溫反应20min后，于酶标仪上测定540皿处吸光度。利用 标准曲线方程求出上清液中NO的浓度。
[0105] W标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图11)，推导出标准曲线 方程为Υ = 0.0068X+0.0428(R2 = 0.9985)。将样品各浓度的吸光度数据带入标准曲线方程， 求得样品各浓度细胞液上清中NO的浓度。
[0106] 实验结果如图12显示，RAW264.7巨隧细胞自身产生的NO量较少，但在受到WS刺激 后，NO大量产生(P<0.01)。本发明黄酬类化合物在l(K)yg/mL能够促进巨隧细胞产生N0(P< 0.01)。
[0107] (2)对巨隧细胞吞隧能力的影响
[010引按1 X 105个/孔将对数生长期的RAW264.7巨隧细胞加入96孔板中。培养过夜后，将 Ξ个化合物按实验设计，加入96孔板中，并WPB巧h足至终体积为每种浓度设3个平 行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，20化g/mL。同时，做阳性对照孔(加入终浓 度为 lOyg/mL 的 LPS)。
[0109] 细胞在37°C5%C02饱和湿度空气条件下培养2地。培养结束后，轻轻吸去上清液， 加入Img/血中性红溶液100化。30min后，吸去中性红染液，并W 37 °C的PBS洗板数次，直至细 胞外染料全部洗净。离屯、并小屯、吸去PBS后，加入细胞裂解液（乙醇：乙酸= 24:1)100化，4°C 放置化，至细胞全部裂解。震荡混匀后，在酶标仪上测定波长540nm处0D值。
[0110] 吞隧作用是巨隧细胞行使其功能的一个重要方式。通过检测巨隧细胞内的中性红 染料，可W反应巨隧细胞的吞隧能力。实验结果如图13表明，本发明黄酬类化合物能促进巨 隧细胞的吞隧功能(P<〇. 05)。
[0111] (3)对巨隧细胞增殖的影响
[0112] 将对数生长期的RAW264.7巨隧细胞按2X104个/孔浓度加入96孔板中。培养过夜 后，将样品按实验设计，加入96孔培养板，并W含PB巧h足至终体积为每种浓度设3个 平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，20化g/mL。同时做空白对照孔（只加细胞 培养液)。
[0113] 细胞加样后在37 °C 5 % C〇2饱和湿度空气条件下培养4她，倒置显微镜下观察细胞 生长状况。于培养结束前地，弃上清。每孔加入10化L的PBS，然后加入化L浓度为5mg/mL的 MTT继续培养，培养结束后，每孔加10 % SDS (用0.01M的肥1配制）100化，37 °C下放置过夜。振 荡混匀，使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔0D值。
[0114] 通过实验如图14发现，本发明黄酬类化合物对单核巨隧细胞株RAW264.7都有明显 的促进或抑制增殖的作用(P<〇.05)，说明其对巨隧细胞的增殖有显著影响。
[0115] (4)抗服C-27细胞增殖的测定
[0116] 细胞培养：
[0117] HGC-27细胞W含10%胎牛血清的DMEM培养液培养于37°C5%C02饱和湿度空气的 细胞培养箱中，每隔Id传代一次。传代时，用0.25%膜蛋白酶液消化贴壁的细胞30s左右，倾 倒出酶液，加入新鲜的含有10 %胎牛血清的DMEM培养液，并用吸管吹吸数次，W1:4比例传 代培养。
[011引细胞增殖实验：
[0119] 将对数生长期的HGC-27巨隧细胞按3000个/孔浓度加入96孔板中。于37°C培养箱 中解育过夜，将样品按实验设计，加入96孔培养板，并W含10 %胎牛血清的无酪红DMEM培养 液补足至终体积为每种浓度设3个平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20， 100，200yg/mL。同时做空白对照孔（只加细胞培养液）。
[0120] 细胞加样后在37 °C 5 % C〇2饱和湿度空气条件下培养4她，倒置显微镜下观察细胞 生长状况。于培养结束前地，弃上清，每孔加入10化L PBS，然后加入扣L浓度为5mg/mL的MTT 继续培养，培养结束后，每孔加10 % SDS (用0.01M的HC1配制）100化，37 °C下放置过夜。振荡 混匀，使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔0D值。
[0121] 结果如图15所示，本发明黄酬类化合物对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用都较 强，具有抗肿瘤作用。
[0122] (5)小鼠体内抑瘤试验
[0123] 取腹腔接种S1807d后的荷瘤小鼠，W注射器在无菌条件下抽取腹水，腹水应为乳 白至淡黄色，无血色。W无菌生理盐水稀释至4 X 107个/ml，置于冰水浴中备用。
[0124] KM小鼠（18-22g)购回后，在每只小鼠右侧蔽窝皮下准确接种瘤液0.2ml，饲养过夜 后，分组。接种次日，小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。其中空白组每日腹腔注射生理 盐水O.lml/lOg，给药组腹腔注射本发明黄酬类化合物0.1ml/10g(2mg/10g)，连续给药7天。 末次给药地后，颈椎脱白处死小鼠，分离蔽下肿瘤并立即称瘤重。
[0125] 结果如表2所示，本发明黄酬类化合物对于S180肿瘤细胞的体内抑瘤率为69.6%， 具有抗肿瘤的作用。
[0126] 表2 KM小鼠体内抑瘤试验
[0127]
[012引 3、PC12细胞保护作用
[0129] (1)细胞活力测定(MTT比色法）
[0130] 细胞存活率用细胞增殖抑制实验(MTT比色法)测定。取对数生长期的PC12细胞，按 40000个/孔加入96孔板中，37 °C 5 % C〇2培养箱中解育过夜。将受试样品按实验设计加入96 孔板中，并W培养基补足至终体积每个浓度设置3个平行孔，共5个浓度梯度，终浓度 分别为0，1，10，20，100，200yg/mL。加入受试样品后，与细胞共同解育化，然后加入终浓度 200ιχΜ的也化进行细胞损伤，同时做不加受试样品和也化的对照孔，W及只加也化的模型组。 将细胞板置于37°C5%C02培养箱中继续解育1她，弃去上清液，加入100化的缓冲液和化L 5mg/mL的MTT，继续培养4h后，每孔加入10化L SDS，过夜培养。于570皿处测定吸光度值。吸 光度值与细胞存活率具有正相关性，因此，吸光度值能反应PC12细胞的存活率。各组细胞存 活率通过下列公式进行计算。
[0131] 细胞活力（％ )=实验组吸光度值/对照组吸光度值X 100
[0132] 从图16可W看出，与对照组