(规定对照组细胞活力为100%)相比，模型组细胞活力 显著降低(P<〇.〇5)，细胞活力52%，表明PC12细胞对200μΜ的也〇2非常敏感，造模成功。与模 型组相比，本发明黄酬类化合物浓度lOOyg/mL~200yg/mL范围内，具有显著差异性（Ρ< 0.05 )，说明其能减轻也化对PCI 2细胞的损伤，作用具有剂量依赖性。200yg/mL时，本发明黄 酬类化合物的PC12细胞存活率为为73.14%。
[0133] (2)细胞内MDA、L畑含量，W及SOD、CAT、GSH-Px酶活力的测定
[0134] 样品准备：
[0135] 取对数生长期的PC12细胞，按5.0 X 10 V孔加入24孔板中，37 °C 5 % C〇2培养箱中解 育过夜。加入10化g/mL的样品后，与细胞共同解育化，然后加入终浓度200ιχΜ的也化进行细胞 损伤，同时做不加样品和也〇2的对照孔，W及只加也〇2的模型组。将细胞板置于37°C5%C〇2培 养箱中继续解育1她，收集上清液用于LDH含量测定，细胞沉淀中加入10化1 1%化iton溶 液，将细胞板置于-80°C条件下，裂解细胞比，即得检测样品，用于丙二醒(MDA)、乳酸脱氨酶 (LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷脫甘肤过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氨酶(CAT)含量的测 定。
[0136] ]\?^、0)山500、65护9义、〔41'的含量测定：
[0137] 参考试剂盒说明书对样品进行MDA、LDH含量，W及SOD、GSH-Px、CAT酶活进行测定。 [013引结果如图17所示，与对照组相比（规定对照组MDA水平为100% )，模型组中MDA含量 明显升高(P<0.05);而与模型组相比，本发明黄酬类化合物给药组中MDA的含量明显降低(P <0.05)，说明其能够降低PC12细胞中由也02损伤引起的MDA含量升高。
[0139]样品对LDH释放量的影响如图18所示，与对照组相比（规定对照组LDH释放量为 100%)，模型组中LDH含量明显升高(P<0.01);而与模型组相比，本发明黄酬类化合物给药 组中LDH的含量明显降低(P<0.05)。结果表明本发明黄酬类化合物能减少PC12细胞的LDH释 放量。
[0140] 结果如图19所示，与对照组相比（规定对照组SOD酶活力为100% )，模型组中SOD酶 含量明显降低(P<〇.05);而与模型组相比，本发明黄酬类化合物给药组中SOD的活性明显升 高(P<0.05)，说明其能提高PC12细胞内SOD的活力。
[0141] 样品对CAT酶活力影响图20所示，与对照组相比（规定对照组CAT酶活力为100%)， 模型组中CAT酶含量明显降低(P<0.01);而与模型组相比，本发明黄酬类化合物给药组中 CAT酶的活性明显升高(P<0.05)。说明其能提高PC12细胞内CAT酶的活力。
[0142] 本发明黄酬类化合物对GSH-Px酶活力影响如图21所示，与对照组相比（规定对照 组G甜-Px酶活力为100%)，模型组中GSH-Px酶含量明显降低(P<0.01);而与模型组相比，本 发明黄酬类化合物给药组中GSH-Px酶的活性明显升高(P<0.05)。说明其能提高PC12细胞内 G甜-Px的活力。
[0143] (3)细胞内活性氧(R0S)的测定
[0144] 取对数生长期的PC12细胞，按1.0 X 106/孔加入6孔板中，37°C解育过夜。随机分 组：正常组、300ιχΜ此化组、300ιχΜ出化+样品组。用10化g/mL的样品预处理细胞2地，后加入 SOOiiM出化诱导3小时。细胞内活性氧检测按照活性氧试剂盒进行。悬浮PC12细胞，用浓度10 μΜ的活性氧巧光探针，在避光条件下反应，对细胞进行染色，37°C解育30分钟后，3000转/ 分，离屯、5分钟，弃上清。利用PBS液洗涂细胞3次，把细胞外残留的巧光试剂洗干净，去掉背 景巧光的干扰。在多功能酶标仪上，使用激发波长488nm，发射波长525nm，测定细胞R0S的巧 光强度，胞内R0S含量与巧光强度成正比，可通过测得的巧光值反应细胞内R0S的含量。
[0145] 样品对细胞内R0S含量的影响如图22所示，与对照组相比，模型组中R0S含量明显 升高(规定模型组中R0S含量为100% )(P<0.01);而与模型组相比，本发明黄酬类化合物给 药组中R0S含量明显降低(P<0.05)，说明其能抑制由出化损伤引起的细胞内R0S含量升高。
[0146] (4)PC12细胞线粒体膜电位的测定
[0147] JC-1染料染色细胞后，线粒体膜电位完全丧失，染色后呈绿色巧光。正常细胞呈红 色巧光。
[014引取对数对数生长期的PC12细胞，按5X105/孔加入24孔板中，37°C解育过夜。随机 分组:正常组、300ιχΜ此化组、300μΜ此化+样品组。lOOyg/mL的样品与细胞共同解育化，然后 加入终浓度300ιχΜ的出化进行细胞损伤。将细胞板置于37 °C 5 % C02培养箱中继续解育1她，在 培养结束时，离屯、收集细胞，用0.5ml细胞培养液重新悬浮细胞，然后加入扣g/mL的JC-1染 料，于37°C中反应20min，用PBS洗涂细胞3次。利用倒置巧光显微镜观察巧光。
[0149] 结果如图23显示，正常组中多数细胞呈红黄色巧光。而出化模型组细胞几乎呈绿色 巧光，只有少数细胞依稀可见黄色巧光，表明细胞线粒体膜电位下降甚至丧失。与模型组相 比，本发明黄酬类化合物能使细胞中红黄色巧光比例增加，表明其能够稳定线粒体膜电位。
【主权项】
1. 黄酮类化合物，命名为6，8，4'-三羟基黄酮7C-(2' '-E-芥子酰基)吡喃葡萄糖基-4'-〇-(4''吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷，其分子式为C44H5〇024,其结构式如式1:2. 根据权利要求1所述的黄酮类化合物在用于制备具有抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫 增强活性或PC12细胞保护作用的药物或保健食品中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述具有抗氧化活性是指具有清除DPPH自由基的能力； 所述具有抗氧化活性是指清除羟自由基的能力； 所述具有抗氧化活性是指具有清除ABTS自由基的能力； 所述具有抗氧化活性是指具有还原能力。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述抗肿瘤活性是指对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用。5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述具有免疫增强活性是指能够促进巨噬细胞产生NO; 所述具有免疫增强活性是指能促进巨噬细胞的吞噬功能； 所述具有免疫增强活性是指对巨噬细胞的增殖有显著影响。6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述具有PC12细胞保护作用是指能减轻H2〇2对PC12细胞的损伤； 所述具有PC12细胞保护作用是指能够降低PC12细胞中由H2〇2损伤引起的MDA含量升高； 所述具有PC 12细胞保护作用是指减少PC 12细胞的LDH释放量； 所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内SOD的活力； 所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内CAT酶的活力； 所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内GSH-Px的活力； 所述具有PC12细胞保护作用是指能抑制由H2〇2损伤引起的细胞内ROS含量升高； 所述具有PC12细胞保护作用是指能够稳定线粒体膜电位。7. 权利要求1所述黄酮类化合物的制备方法，包括以菥蓂子为原料，经步骤A浸膏提取、 步骤B有机溶剂萃取、步骤C反相硅胶柱层析、步骤D高效液相色谱分离步骤制备而得，其特 征在于： A、 浸膏提取:取菥蓂子，粉碎至20~40目，用90%~100%乙醇回流提取2~5次，每次40 ~80min，合并提取液、过滤，减压浓缩至浸膏； B、 有机溶剂萃取:A步骤浸膏用蒸馏水混悬，加入等体积石油醚萃取5~8次，收集水相 溶液，加入等体积乙酸乙酯萃取5~8次，收集水相溶液，加入等体积正丁醇萃取5~8次，收 集正丁醇相溶液，减压浓缩至浸膏； C、 反相硅胶柱层析:B步骤浸膏用乙醇溶解，进行反相硅胶柱层析；以体积配比为1:9~ 6:4的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩； D、 高效液相色谱分离:C步骤洗脱液的4:6部分进一步用高效液相色谱分离纯化，即得 所述的黄酮类化合物。8. 根据权利要求7所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于:满足以下任意一项： 所述步骤A中的乙醇浓度为90%~100% ;或 所述步骤B中浸膏用蒸馏水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取除杂，取萃取后的水 相溶液，用正丁醇萃取，收集正丁醇相溶液;或 所述步骤C中乙醇-水溶液体积配比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4;或 所述步骤D中高效液相色谱分离纯化是采用20mm X 250mm，5μηι的Cis色谱柱，流速为5~ 20ml/min，流动相为70~100%的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样190~210μ 1，收集8.22~11.6min的色谱峰，多次累加后干燥。
【专利摘要】本发明属于医药领域，具体涉及一种黄酮类化合物TA34a及其制备方法与用途，所述的化合物结构式如式1，命名为6,8,4＇-三羟基黄酮7C-(2″-E-芥子酰基)吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷，呈亮黄色粉末状，化学式为C44H50O24。所述化合物的制备方法，其特征在于以菥蓂子为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、反相硅胶柱层析、高效液相色谱分离纯化。本发明化合物具有明确的抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫增强活性以及PC12细胞保护作用，为临床应用提供了一种新的选择。
【IPC分类】A61P39/06, C07H15/26, C07H1/08, A61P39/00, A61P35/00, A61P37/04
【公开号】CN105669796
【申请号】CN201610006271
【发明人】许晓燕, 罗霞, 江南, 余梦瑶, 魏巍
【申请人】四川省中医药科学院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月6日