[0070]Aux/IAA-f-2:5’-CTGGTTGGAGATGTTCCGTGGGA[0071 ] Aux/IAA-r-2:5’ -CTGGGTTGCTGTGAGTTGTAGGT
[0072]Aux/IAA-f-3:5’-CAGGCTGAGGCTGCTGGTATTTA
[0073]Aux/IAA-r-3:5’-ATTCCGACCCCTTGTAGCCTTCC
[0074]Primer premier 5.0软件设计引物:
[0075]a-F (Cc-act in 内参引物)5，-GCTGAACGGGAAATTGTC
[0076]a-R( Cc-act in 内参引物)5，-AGAGATGGCTGGAAGAGG
[0077]3)合成cDNA第一链:反转录反应体系为1ul体系，所述的反应体系如下:在200ul反应管中加入模板RNA 1.0ul,OligdT 1.0111，双蒸水6.0111，反应条件为701€51^11，冰浴1min;然后在该反应管中加入5 XReverse Transcript1n M-MLV Buffer 2.0ul,dNTP
0.5111，1?熟酶抑制剂0.25111和逆转录酶(]\1-]\0^)0.25111，反应条件为421€60111丨11，70°(:1511^11;
[0078]4)验证模版与引物:以反转录好的cDNA为模板，挑选一对合适的目的基因引物进行荧光定量RT-PCR。反应体系为25ul体系:内含上下游引物各2.5ul，10 X Buffer 2.5ul，dNTP 2ul，Mg2+l.5ul，rTaq酶0.2ul，双蒸水10.8ul，反转录好的cDNA模板3ul ICR扩增反应条件:941€31^11;941€308，601€308，721€308，共30个循环;然后72°(:延伸51^11，1%琼脂糖凝胶电泳检测；
[0079]5)实时荧光定量PCR:采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime)试剂盒，编号TaKaRa Code:DRR041A。以反转录好的cDNA为模板，反应体系为1ul体系:内含上下游引物各0.2ul，SYBR Premix Ex TaqTM(5 X )5ul，R0X Reference DyeII (50X )0.2ul，双蒸水3.4ul，反转录cDNA模板Iul。荧光定量PCR反应条件:95°C30s; 95°C 15s，60°C 15s,共40个循环，在B1-RAD荧光定量PCR仪上进行。
[0080]步骤八、CcIAA基因在翻译水平上的表达分析:对不同时期山核桃嫁接茎上的总蛋白进行提取并检测，然后通过Western blot技术了解CcIAA基因在山核桃嫁接过程中的翻译水平表达情况。
[0081]作为优选，所述的步骤三中的总RNA的提取步骤和步骤七中山核桃不同嫁接时期嫁接茎的总RNA的提取步骤如下:
[0082]I)在1ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4ml CTAB，然后放入65°C的水浴锅中预热；
[0083]2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀(Imin)，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混勾(每隔1min)加热30min，混合均勾后4°C，12000rpm，离心lOmin;
[0084]3)将离心后的上清液转入新的1ml离心管里面，再加入等体积的24:1(氯仿:异戊醇)上下颠倒混勾后4°C，12000rpm，离心1min;
[0085]4)重复第3)步，直至中间层消失；
[0086]5)将离心后的上清液转入新的1ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20°C冰箱中静置30min?Ih;
[0087]6)将冷冻的离心管在4°C，12000rpm，离心lOmin，离心完成后将液体倒掉；
[0088]7)再加入65°C预热好的SSTE 0.3ml，待沉淀溶解完全后转入1.5ml离心管中，加入Iml Trizol，在冰上放置3min，再加入氯仿0.2ml，冰上静置5min，混合均勾后4°C，12000rpm，离心 15min;
[0089]8)将离心后的上清液装入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上放置1min，混勾后4°C，12000印111，离心10111；[11;
[0090]9)将收集到的沉淀加入处理的75 %乙醇Iml，将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子，4°C，12000rpm，离心3min;
[0091]10)将液体倒掉，再加入Iml 75%乙醇洗涤一次；
[0092]11 )4°C，12000rpm，离心5min，将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，再依据沉淀加入合适的DEPC水来溶解沉淀(50ul)，然后保存备用。
[0093]作为优选，所述的步骤三中的总RNA的提取步骤如下:
[0094]I)在1ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4ml CTAB，然后放入65°C的水浴锅中预热；
[0095]2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀(Imin)，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混勾(每隔1min)加热30min，混合均勾后4°C，12000rpm，离心lOmin;
[0096]3)将离心后的上清液转入新的1ml离心管里面，再加入等体积的24:1(氯仿:异戊醇)上下颠倒混勾后4°C，12000rpm，离心1min;
[0097]4)重复第3)步，直至中间层消失；
[0098]5)将离心后的上清液转入新的1ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20°C冰箱中静置30min?Ih;
[0099]6)将冷冻的离心管在4°C，12000rpm，离心lOmin，离心完成后将液体倒掉；
[0100]7)在沉淀中加入600ul裂解液RTL Plus，4°C，13000rpm，离心30s，收集上清液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
[0101]8)将混合物加入到吸附柱RA中，4°C，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；
[0102]9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置lmin，13000rpm离心30s，
将废液倒掉；
[0103]10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；
[0?04] 11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除漂洗液；
[0105]12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ulddH20，室温下放置lmin，12000rpm，离心lmin，获得溶解好的RNA。
[0106]作为优选，所述的步骤八中山核桃嫁接茎上的总蛋白的提取步骤如下:
[0107]I)取700mg的山核桃嫁接部位的新鲜组织，把样品放在研钵中用液氮磨样，把磨碎的样品放在1ml离心管中；
[0108]2)用8ml预冷的沉淀缓冲液(在丙酮中加入1 %的三氯乙酸和0.07 % β-巯基乙醇)
重悬样品；
[0109]3)上下颠倒离心管15s，然后-20°C冰箱中静置lh，在离心机中16000rpm离心15min；
[0110]4)慢慢的倒掉上清液，向沉淀中加入8ml预冷的漂洗液(含有0.07%β-巯基乙醇的丙酮)，-20°C冰箱静置lh，16000rpm离心1min;
[0111]5)慢慢弃掉废液，沉淀部分在蛋白真空冷冻机中干燥2h，然后用玻璃棒轻轻捣碎沉淀；
[0112]6)用溶解缓冲液重悬粉末，一般10?30ul/mg粉末，这种缓冲液包含尿素，去污剂(Triton-X 100)，还原剂(DTT)和IPG缓冲液；
[0113]7)在室温条件下4000rpm离心4min，取上清，重复一遍；
[0114]8)上清液保存在-80 °C冰箱中。
[0115]作为优选，所述的步骤八中山核桃嫁接茎上的总蛋白的检测步骤如下:
[0116]I) SDS-PAGE 凝胶配制；
[0117]2)上样和电泳:取ΙΟμΙ标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10μ1 2倍样品缓冲液，上样量为20μ1。再取10μ1样品蛋白溶液，加入10μ1 2倍样品缓冲液，上样量分别为5μ1和10μ1。电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳；
[0118]3)凝胶板剥离与染色:电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色Ih左右；
[0119]4)脱色:染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
[0120]作为优选，所述的步骤八中Westernblot技术包括蛋白质电泳、转膜、免疫反应、X射线曝光和洗照片。
[0121]本发明的有益效果:与现有技术相比，本发明提供的一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，以山核桃嫁接苗作为分析材料，提取RNA并反转录成cDNA，最终克隆得到山核桃生长素原初响应基因CcIAA。然后利用qRT-PCR以及Western blot技术来了解该基因在山核桃嫁接过程中转录和翻译水平的表达情况，从而来分析CcIAA基因对山核桃嫁接成活的调控机理，从试验结果中发现CcIAA在翻译的水平上表达量和对照相比也是明显增强，通过NPA处理后，IAA氧化酶活性会增强，同时CeIAA的表达会增强，通过对生长素原初响应基因CcIAA的克隆和功能分析，来渗入探索山核桃的嫁接的调控机理以及该基因和生长素信号传导途径的关系，有利于更进一步了解生长素原初响应基因CcIAA对山核桃的嫁接成活的作用机制以及山核桃嫁接过程中生长素的信号。
[0122]本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。
【【具体实施方式】】
[0123]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
[0124]本发明实施例提供一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，包括如下步骤:
[0125]步骤一、仪器准备:液氮罐、高速冷冻离心机、灭菌锅、超级纯水仪、电热恒温水箱、超级低温冰箱、紫外分光光度计、PCR仪、通风橱、电泳槽、小型涡旋仪、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、制冰机、超净工作台、转膜仪、烧杯、天平、移液管、研钵研棒和荧光实时定量PCR仪；
[0126]步骤二、植物材料准备:用于山核桃Aux/IAA基因克隆的实验样品，选取山核桃的嫁接枝条进行采集，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，用作样品并存放入-70°C环境中备用；用于qRT-PCR和Western blot的样品，选取长势相似的两年生的实生苗砧木和留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生苗的接穗，并在实验基地中完成嫁接，采用两种不同的生长激素:IAA 4mg/1，NPA 0.3ug/1来处理山核桃接穗，时间为30miη，站木用蘸有激素的毛笔蘸湿。对照组用清水处理。在山核桃嫁接之后O天，I天，3天，5天，7天，14天采样，共有36个不同的样品，我们对每一个样品准备25个重复并用锡箔纸包好后立即放入液氮中，并存放于-70°C保存后备用。
[0127]样品编号如下:
[0128]对照组接穗:jO，jI，j3，j5，j7，j 14;
[0129]对照组站木:z0，zl，z3，z5，z7，zl4;
[0130]IAA处理接穗:1 j 0，I j I，I j 3，I j 5，I j 7，I j 14;
[0131]1厶厶处理砧木:120，121，123，125，127，121;
[0132]NPA处理接穗:Nj0，Nj I，Nj 3，Nj 5，Nj7，Nj 14;
[0133]NPA处理砧木:NzO，NzI，Nz3，Nz5，Nz7，Nz14;
[0134]步骤二、总RNA提取并检测:在实验室中，对经步骤二米集后的嫁接枝条样品进行总RNA的提取，获得嫁接枝条样品的总RNA提取液，并从总RNA的提取液中吸取2ul进行OD值测定，检测质量与浓度，从总RNA的提取液中吸取4ul与Buffer混匀后进行电泳检测；
[0135]步骤四、Aux/IAA基因的RACE扩增:步骤如下:
[0136]I )RACE引物设计:利用山核桃454测序数据库，找到一个320bp的生长素IAA基因，运用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物如下:
[0137]GSPl:GTTCTTCTCTGTCATCTGTCCCCCG
[0138]GSP2:TCAGAGAGGGAAGGCTACAAGGGGT
[0139]IAA-