一种野大麦成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法与流程

本发明涉及属于农业栽培中通过组织培养技术的植物再生领域，具体涉及一种野大麦成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法。

背景技术：

野大麦又称短芒大麦，为禾本科大麦属多年生草本植物，是一种具短根茎的多年生牧草，无性繁殖力较强，经常以株丛形式分布于盐生植物群落中，在松嫩平原碱化草甸可形成大面积的单优群落。野大麦具有草质好，营养丰富，干草中蛋白质及脂肪含量较高，适口性好，抗恶劣环境，耐践踏等优良特性，是人工栽培草地和草地改良过程中的优选良种。

随着草场的退化和耕地面积的日益减少，不断培育优质、高产、多抗的牧草新品种成为国内外牧草研究工作者关注的热点问题。就育种而言，除了传统的育种手段，结合基因工程技术来培育新品种能加速育种进程，更有效地选育出目标品种。而野大麦组织培养是利用基因工程技术进行基因改良的基础，只有建立了稳定、高频的再生体系，才能构建较好的遗传转化体系，提高转化效率，获得转基因植株，进而获得改良新品种。

目前，国内野大麦离体再生体系研究还不完善，朱进等以野大麦的成熟胚为外植体诱导愈伤组织，在含 NaCl的MS培养基上筛选到的耐盐变异体具有一定的耐盐性且较稳定，并分化出了再生植株。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种野大麦成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法。本发明公开了一种通过野大麦成熟胚为外植体，构建愈伤组织诱导、植株再生获得再生体系，为探索其细胞工程育种和遗传改良研究提供可靠的技术支持。

本发明提供一种野大麦成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法，步骤如下：

（1）选择野大麦种子并消毒；

（2）诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的筛选：

诱导培养基：基础培养基+0.1-0.5 mg·L^-1 6-BA +1.0-2.0 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培养基：基础培养基+0.5-1.5mg/L 6-BA + 0.2-0.4mg/L NAA，

生根培养基：1/2基础培养基；

所述基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g·L^-1+琼脂10g·L^-1；

（3）成熟胚的处理和诱导分化：取步骤（1）中消毒的野大麦种子，置于诱导培养基中培养，继代几次后转入分化和增殖培养基中继续培养，继代几次后转入生根培养基中进行培养，待分化苗的根长4-6cm时，将瓶苗移出培养室，自然光下闭瓶炼苗，2d后注入自来水，自然光下开瓶炼苗3d，然后洗净根部，灭菌，用基质培养，获得完整的再生植株。

作为优选，步骤（2）中，

所述诱导培养基为：基础培养基+0.3 mg·L^-1 6-BA +1.5 mg·L^-1 2,4-D；

所述分化增殖培养基为：基础培养基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

所述生根培养基为：1/2基础培养基；

所述基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g·L^-1+琼脂10g·L^-1。

作为优选，步骤（3）中所述诱导培养的条件为：于恒温25±2℃条件下黑暗培养30d。

作为优选，步骤（3）中所述分化增殖培养的条件为：光照培养，光照强度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培养温度为25℃。

作为优选，步骤（3）中所述生根培养的培养条件为：在 25±2℃、光照强度为2000-3000lx、光照时间16h·d^-1条件下培养。

本发明的有益效果为：

（1）本发明公开了一种野大麦成熟胚愈伤组织诱导培养及再生体系的构建方法，以采集临泽的野大麦成熟胚为外植体，通过不同生长调节物质对愈伤组织的诱导、分化、生根等步骤的影响，进行愈伤组织诱导培养基的筛选，获得出愈率较高的培养基为：基础培养基+0.3mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D,诱导率为50%；分化和植株再生培养基为基础培养基+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，分化率为80%，生根成苗培养基为：1/2基础培养基，生根率达100%；其中，基础培养基为MS培养基加蔗糖30g·L^-1和琼脂10g·L^-1。提供了一种高效效野大麦成熟胚组织培养方法。与已有的野大麦再生体系报道相比，本发明的植株再生率显著提高。

（2）本发明选用野大麦成熟胚为外植体，进行组织再生培养，不受取材材料时空限制。本发明为野大麦愈伤组织诱导的组培方法，操作简单，成本廉价；建立的野大麦成熟胚培养植株再生方法体系，为探索其细胞工程育种和遗传改良研究提供可靠的技术支持。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为成熟胚诱导愈伤组织；

图2为愈伤组织分化绿苗；

图3为生根的幼苗；

图4为移栽后的再生植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本发明的方法具体步骤如下：

（1）植物材料选取及处理：选择色泽、大小均匀的野大麦成熟种子，去除外稃后在流水下冲洗30分钟，然后用75%酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3-5次，将种子置于无菌滤纸，直至种子水分吸干后待用；所述的野大麦种子指的是：采集于甘肃临泽野大麦野生种子。

（2）诱导和分化增殖培养基筛选：基础培养基为MS培养基加蔗糖30 g·L^-1和琼脂10 g·L^-1；

诱导培养基和分化增殖培养基为基础培养基附加不同处理激素。

诱导培养基是在基础培养基的基础上添加6-BA和2,4-D。设置6-BA浓度为0.1 mg·L^-1、0.3 mg·L^-1、0.5 mg·L^-1；2,4-D的浓度为1. 0 mg·L^-1、1.5 mg·L^-1、2.0 mg·L^-1（表1）；

分化和增殖培养基是在基础培养基的基础上添加6-BA和NAA。设置6-BA浓度为0.5 mg·L^-1、1.0 mg·L^-1、1.5 mg·L^-1；NAA的浓度为0.2 mg·L^-1、0.4 mg·L^-1（表2）；

生根培养基为1/2基础培养基。

以上培养基pH均调至5.8～6.0，在121℃下高压湿热灭菌20min。

（3）成熟胚的处理和诱导分化：本步骤对各部分的培养条件进行了优化选择，在以下培养条件时能够取得最佳的培养效果。具体培养方法如下：取步骤（1）中消毒处理好的种子，置于含有不同浓度的诱导培养基中，于恒温培养箱(25±2)℃条件下黑暗培养30d，期间将意外染菌重复除去，统计出愈率和生长状况。并将愈伤组织转入最优的诱导培养基进行继代增殖，继代周期为15d，继代三次后转入含有不同浓度的分化和增殖培养基进行光照培养，光照强度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培养温度为25℃，每2周继代一次，继代3次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率；

（4）待分化苗长至2-3cm时，将应用最优分化和增殖培养基培养的分化苗转入生根培养基，在 (25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间16 h·d^-1条件下培养。待分化苗的根长5cm左右，将瓶苗移出培养室，自然光下闭瓶炼苗，2d后注入自来水，自然光下开瓶炼苗3d后统计生根率。洗净根部后，移入高压蒸汽灭菌后基质（珍珠岩：蛭石：营养土（购自杭州瑞波园艺资材部）=2:3:1）培养，获得完整的再生植株。

表1 不同浓度6-BA 和2,4-D组合对野大麦愈伤组织形成的影响

由表1可知，当培养基中添加0.1mg/L6-BA + 1.5mg/L2,4-D时，诱导率达75%，但愈伤组织质地较松散，不利于后期的分化组织的形成；添加0.3mg/L6-BA + 1.5mg/L2,4-D诱导率为49.72%，愈伤组织为淡黄色，质地致密，增殖速度快。总体而言，愈伤组织的诱导率在6-BA的浓度为0.1-0.3mg/L之间，随着2,4-D浓度的增加呈先升高后下降，但是差异性不显著。因此，最佳诱导培养基为：基础培养基+0.3 mg·L^-1 6-BA +1.5 mg·L^-1 2,4-D。

表2不同浓度6-BA和NAA组合对野大麦愈伤组织分化能力的影响

由表2可知，在培养基中加入不同激素及其浓度组合，分化率存在明显差异。当NAA浓度相同时，随着6-BA浓度的升高，愈伤组织的分化率呈先升高后下降的趋势，激素为1.0mg/L6-BA + 0.4mg/L NAA 和1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA组合，愈伤组织的分化率最高，分别达到93.33%和86.66%，但是分化苗后期生长状况不是很好，死亡率较高。当激素浓度为0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA时，愈伤组织的分化率为80%，分化苗后期成活率高，生长较旺盛。因此，野大麦愈伤组织分化的最佳培养基为基础培养基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA。

实施例1

本发明的方法具体步骤如下：

（1）植物材料选取及处理：选择色泽、大小均匀的野大麦成熟种子，去除外稃后在流水下冲洗30分钟，然后用75%酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3-5次，将种子置于无菌滤纸，直至种子水分吸干后待用；所述的野大麦种子指的是：采集于甘肃临泽的野生野大麦种子。

（2）诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的配方如下：

基础培养基为MS培养基加蔗糖30g×L^-1和琼脂10 g×L^-1；

愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+0.3 mg·L^-1 6-BA +1.5 mg·L^-1 2,4-D；

分化增殖培养基为：基础培养基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；

生根培养基为：1/2基础培养基。

以上培养基pH均调至5.8～6.0，在121℃下高压湿热灭菌20min；

（3）成熟胚的处理和诱导分化：取步骤（1）中消毒处理好的种子，置于诱导培养基中，于恒温培养箱(25±2)℃条件下黑暗培养30d，期间将意外染菌重复除去，然后进行继代增殖，继代周期为15d，继代三次后，测得诱导率为50%；转入分化增殖培养基进行光照培养，光照强度1500-2000Lux，每天光照16 h·d^-1，培养温度为25℃，每2周继代一次，继代3次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，增殖率为80%；

（4）待分化苗长至2-3cm时，转入生根培养基，在 (25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间16 h·d^-1条件下培养，生根率为100%。待分化苗的根长5cm左右，将瓶苗移出培养室，自然光下闭瓶炼苗2d后注入自来水，自然光下开瓶炼苗3d后统计生根率。洗净根部后，移入高压蒸汽灭菌后基质（珍珠岩：蛭石：营养土（购自杭州瑞波园艺资材部）=2:3:1）培养，获得完整的再生植株。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。