专利名称：一种转基因大豆的检测方法及所用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因大豆产品的检测方法，具体为一种是根据转基因时用的CaMV35s启动子序列及EPSPS序列，设计引物对其进行扩增，依据能否扩增出特异片断，确定其是否为转基因大豆的检测方法及所用引物，国际专利主分类号拟为Int.CL7C12Q 1/68。
背景技术：
中国是世界第四大豆生产国，每年产量达到1500-1800万吨，均为传统的非转基因大豆。但每年还需要从国外进口大量的大豆。而进口的大豆几乎100％是转基因大豆。据报道，转基因大豆的出油率可达20-21％，与之对比国产的大豆出油率只有17％，而价格却比进口的高，据估算，平均每桶5升国产非转基因大豆油要比进口转基因大豆油的成本高出2-3元，因此，大多数厂家都会使用进口转基因大豆做原料。实际上，国际市场上的非转基因大豆价格也要比转基因大豆价格高，一般可高出15-20％。因此，我国传统的非转基因大豆出口具有相当大的国际竞争力。也因此，转基因大豆的检测具有非常重要的意义。目前国内外检测转基因大豆的通用方法是根据转基因时用的CaMV35s启动子序列或Nos终止子序列及EPSPS基因，设计引物对其进行扩增，依据能否扩增出特异片断，确定其是否为转基因大豆及其转入的基因。但这种检测方法耗时费力，甚至检测出的结果有时被提出质疑，诸如病毒感染等也常会扩增出特异片断，使检测准确度降低，甚至无法做出正确鉴别。例如，中国专利CN02131297.4号文献介绍了一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列及试剂盒，但该方法只能检测出大豆是否含有35S启动子，并不能知道此大豆转了什么基因，预知转移的目的基因还需另外检测，检测效率低下；中国专利CN02131299.0号文献介绍了一种利用荧光PCR定量检测含有EPSPS基因转基因大豆的探针序列及试剂盒，但该方法也只能检测转基因大豆中的EPSPS基因，功能不全。转基因大豆的检测一般都要先检测CaMV35s启动子或Nos终止子，进而检测目的基因以确定是否为转基因大豆及其转入基因的种类。更重要的是，目前转基因大豆的检测方法一般需要较长时间，费时耗力，费用很高，更不能适应根据市场变化，快速反应的需要，不利于国内大豆加工和贸易企业的国际竞争。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是设计一种转基因大豆的检测方法及所用引物，该检测方法及所用引物可一次同时检测出大豆的两个基因，提高了检测效率，降低了检测成本，方便实际应用。
本发明的技术方案是设计一种转基因大豆的检测方法，该检测方法包括1.提取大豆DNA采用酚仿抽提法提取大豆DNA。
2.PCR扩增反应PCR扩增反应体系的总体积为25μl，其各种成分终浓度分别为10mM缓冲液，0.2mM dNTP，1.5mM Mg2+，上下游引物各0.2mM，1UTaq，50ngDNA，用ddH2O补齐到25μl；所述上下游引物序列为F5’-CACTGACGTAAGGGATGA-3’18nt Tm55.0，R5’-TGTGCTGTAGCCACTGAT-3’18nt Tm55.0，PCR反应条件是
PCR反应结束后，取体系液10μl，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外透射反射分析仪或UVI凝胶成像系统照相记录。
3.转基因大豆判定，根据所述照相记录是否能显示扩增出一个337bp的特异带来判定是否为转基因大豆。
与现有技术相比，本发明转基因大豆的检测方法由于设计了PCR扩增反应条件和特殊的引物，使检测时的一次PCR扩增反应即可同时检测出转基因大豆的35s启动子序列和EPSPS基因的两个片断，因此可大大节约时间，提高检测效率，降低检测成本，特别便于在实际中推广应用，提高工作效率。我国目前进口的转基因大豆主要是美国孟山都公司申请的转基因抗农达大豆GST40-3-2，针对该品种的快速准确检测方法意义重大。本发明就是一种针对该转基因品种的简捷、快速、高效和准确的检测方法及所用引物。
图1为本发明转基因大豆的检测方法实施例的检测结果照片图。在图中，0为空白对照(水)，H为河北大豆；Dq为东北大青豆；D为东北大豆(黄豆)；Z为美国转基因大豆；M为Marker，自下而上分子量依次为100，250，500，750，1000，2000；Z所扩增出的条带即为337bpDNA片段。表明美国转基因大豆含有CaMV35s启动子和EPSPS基因。
图2为利用现在通用检测方法检测上述四个大豆品种实施例的检测结果照片图。图中，Z所扩增出的条带即为195bpDNA片段，只能表明该转基因大豆含有CaMV35s启动子。
图3利用现在通用检测方法检测上述四个大豆品种实施例的检测结果照片图。图中，Z所扩增出的条带即为320bpDNA片段，只表明该检测样品为转入了EPSPS基因的大豆。
具体实施例方式
下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明本发明设计的一种转基因大豆的检测方法，包括1.提取大豆DNA采用酚仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月)提取大豆DNA。该方法为现有技术。
2.PCR扩增反应PCR扩增反应体系的总体积为25μl，其各种成分及终浓度分别为缓冲液10mM，dNTP0.2mM，Mg2+1.5mM，上下游引物各0.2mM，Taq 1U，DNA50ng，用ddH2O补齐到25μl；所述上下游引物序列为F5’-CACTGACGTAAGGGATGA-3’18nt Tm55.0，R5’-TGTGCTGTAGCCACTGAT-3’18nt Tm55.0，所述的PCR反应条件是本发明经大量研究后的独特设计。这些反应条件，专用于转基因大豆检测PCR反应，并与所述的引物配合。所述的PCR反应条件是
PCR反应结束后，取体系液10μl，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外透射反射分析仪或UVI凝胶成像系统照相记录；3.转基因大豆判定，根据所述的照相记录是否能显示扩增出一个337bp的特异带(DNA片段)来判定是否为转基因大豆。如能显示扩增出一个337bp的特异带(参见图1)，即为含有35s启动子、转入了EPSPS基因的转基因大豆；如没有扩增出该特异带的即为非转基因大豆。
本发明转基因大豆检测方法所述的PCR反应引物，其序列为F5’-CACTGACGTAAGGGATGA-3’18nt Tm55.0，R5’-TGTGCTGTAGCCACTGAT-3’18nt Tm55.0。
所述引物也是本发明的独创设计。它们是根据CaMV35s启动子序列和EPSPS基因序列，利用专业引物设计软件Primer 5.0创新设计的。该引物合成简单，成本低廉，专用于本发明的转基因大豆检测方法，与所述的PCR反应条件配合，可高效地判定检测样品是否为含有CaMV35s启动子并转入了抗草甘膦基因的转基因大豆。
本发明检测方法利用PCR扩增反应可从转基因大豆中扩增出一条大小为337bp的DNA片断，并依此来判定是否为转基因大豆。所述的337bp片断既包括有35s启动子的序列，也包括EPSPS基因片断的序列，可以同时检测大豆的35s启动子序列和EPSPS基因，因此效率大为提高，成本也大幅降低，优势突显。
下面给出本发明的具体实施例。
实施例1本发明实施例所用的转基因大豆(Z)来自美国进口，非转基因大豆由天津市农业科学院提供，分别为东北大豆(D)、东北大青豆(Dq)和河北大豆(H)(所述的Z、D、Dq、H分别代表所述的四个品种，参见图1)。
本发明实施例所用的仪器主要包括PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)仪(GeneAmp PCR System 9700)；DNA电泳仪(北京六一，DYY-III 31B)；紫外透射反射分析仪(ZF型，上海康华生化仪器制造厂)；UVI凝胶成像系统(三菱，BTS-20-M)。
本发明转基因大豆的检测方法，包括1.提取大豆DNA。
采用酚仿抽提法提取大DNA。具体方法是取0.2g在27℃培养箱中培养4d的大豆胚轴于液氮中研磨至粉末，加入2mlDNA提取缓冲液(500mM NaCl、100mMTris·HCl、50mM EDTA)，65℃水浴15min，冰浴10min，3000rpm/m离心15min，除组织块；取上清，加等体积酚3000rpm/m离心10min，除蛋白；取上清，加等体积酚仿3000rpm/min离心10min，除蛋白；取上清，加等体积氯仿3000rpm/min离心10min，除酚；取上清，加2倍体积冷乙醇-20℃沉淀1h以上，有白色悬浮物质DNA；12000rpm/min离心20min，使DNA完全沉淀；弃上清，75％乙醇洗沉淀2～3次，除Tris和EDTA中的盐；晾干，溶于100μl TE(50mMEDTA、100mMTris·HCl)溶液。加1μl 1mg/ml Rnase，37℃水浴保温1h；加等体积酚仿，3000rpm/m离心10min；取上清，加等体积氯仿3000rpm/m离心10min；取上清，加2倍冷乙醇-20℃沉淀10h；12000rpm/min离心5min，使DNA沉淀；75％乙醇洗沉淀2次，晾干溶于20～50μl TE溶液中。样品的OD值应为OD260≥0.46，OD280≥0.26，OD260/OD2801.75-1.862.PCR扩增反应。
按所述的PCR扩增反应条件和独特设计的引物进行PCR扩增反应。PCR反应结束后，取体系液10μl，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外透射反射分析仪或UVI凝胶成像系统照相记录。实施例的4个大豆品种扩增反应的结果如图1所示。
3.转基因大豆判定。
根据所述的照相记录(参见图1)，可以看出，在四份检测样品中，只有转基因大豆样品Z在337bp处扩增出特异带，而其他三个品种大豆样品D、Dq和H均没有扩增出相应片段，说明大豆Z中含有35S启动子序列和EPSPS基因序列，是转基因大豆，而其他三个大豆样品没有扩增出特异带，不是转基因大豆。CaMV35S启动子序列和EPSPS基因序列是高等植物中所没有的序列，这一结果证明美国进口的大豆转入了EPSPS基因，是转基因大豆。
采用本发明的检测方法检测转基因大豆，仅用一次PCR扩增反应扩增出一条337bp的特异片断，该片断既包括有CaMV35s启动子的序列，也包括EPSPS基因片断的序列。而现在通用的检测方法检测转基因大豆却需要两对引物做两次PCR检测试验，得到两个检测结果照片(参见图2、3)，一张照片(图2)说明检测样品含有CaMV35s启动子序列是转基因大豆；另一张照片(图3)说明所转入的目的基因是EPSPS基因。这即是说，利用本发明的检测方法仅做一次检测试验，得到一张检测结果照片，就可以同时检测出大豆的35s启动子序列和EPSPS基因片断序列，效率翻倍提高，成本大幅降低，一石二鸟，突显本发明检测方法的优势和价值，特别适于厂商结交、对外贸易、检验检疫等实际工作中推广应用。
权利要求
1.一种转基因大豆的检测方法，包括(1).采用酚仿抽提法提取大豆DNA；(2).PCR扩增反应，PCR扩增反应体系的总体积为25μl，其各种成分及终浓度分别为缓冲液10mM，dNTP0.2mM，Mg2+1.5mM，上下游引物各0.2mM，Taq 1U，DNA50ng，用ddH2O补齐到25μl；所述上下游引物序列为F5’-CACTGACGTAAGGGATGA-3’18nt Tm55.0，R5’-TGTGCTGTAGCCACTGAT-3’18nt Tm55.0，PCR反应条件是
PCR反应结束后，取体系液10μl，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外透射反射分析仪或UVI凝胶成像系统照相记录；(3).转基因大豆判定，根据所述照相记录是否能显示扩增出一个337bp的特异带来判定是否为转基因大豆。
2.一种用于权利要求1所述转基因大豆检测方法的引物，该引物的序列为F5’-CACTGACGTAAGGGATGA-3’18nt Tm55.0，R5’-TGTGCTGTAGCCACTGAT-3’18nt Tm55.0。
全文摘要
本发明涉及一种转基因大豆的检测方法及所用引物，该检测方法包括1.提取大豆DNA；2.PCR扩增反应，体系的总体积为25μl，其各种成分及终浓度分别为缓冲液10mM，dNTP0.2mM，Mg
文档编号C12Q1/68GK1769488SQ200510015569
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者王景安, 武泰存, 梁晓华 申请人:天津师范大学