专利名称：一种角膜缘干细胞无血清培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及干细胞体外培养基领域，具体涉及一种角膜缘干细胞无血清培 养基及其应用。
背景技术：
细胞培养是生产基因工程产品的重要环节。由于传统的含血清的细胞培养会给生产及科研带来许多不利因素，因此自50年代以来，国外就开始研制无血清 培养基。80年代末90年代初，有商业应用价值的无血清培养基纷纷上市，而无 血清培养基的一个主要特点是适用的细胞系谱窄，对特定的细胞株需自己摸索 新的配方或最优条件。角膜缘干细胞是角膜细胞增殖和更新的源泉，研究角膜 缘干细胞的增殖分化规律不仅为治疗角膜疾病开辟新的途径，而且将为体外构 建具有生理功能的人工角膜指明方向。因此，建立角膜缘干细胞无血清培养基 是实现这一目标的关键。然而，长期以来，角膜缘干细胞体外扩增培养是借助 有血清培养基实现的(Kim HS et al. Exp Eye Res， 2004 ,79:41 - 49. Tseng SC et al. Curr Eye Res， 1996,15:973 -984)，且大多需要以成纤維细胞作饲 养层。经检索国外虽有专用于培养正常人表皮角化细胞和角膜上皮细胞的基础 培养基EpiLife，但EpiLife它适用于已分化的角化细胞的培养，而且EpiLife必须加入角膜细胞培养基补剂才能支持角膜细胞的长期增殖。因此，国内外还 没有适用未分化的角膜缘干细胞长期扩增培养的无血清培养基。发明内容针对现有技术角膜缘干细胞传代培养仍需血清或成纤维细胞予以维持其干
细胞状态的缺点，本发明的目的是根据角膜缘干细胞在体微环境对角膜缘干细 胞增殖分化的调控规律，建立一种不需饲养层细胞、无血清的角膜缘干细胞培 养基。培养的细胞需要多种微量元素才能支持其生长和维持活性，这些元素通常 来自血清，而本发明的无血清培养基中，是靠添加下以几种微量元素来实现的 霍乱毒素可增加上皮细胞CAMP合成，促进上皮细胞快速生长。胰岛素能够刺激葡萄糖和氨基酸的利用及冊A、蛋白和磷脂的合成。转铁蛋白是一种结合铁的糖蛋白，在无血清培养基中是一种重要的生长刺激蛋白还可作用于细胞表面的相 应受体，促进铁的穿膜传递，也可以降低氧自由基对细胞产成的细胞毒性。亚 硒酸钠中的硒作为一种微量元素，是一种谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，具有 抗过氧化物的能力。本发明突破传统培养基只添加各种生长因子的局限，添加 了霍乱毒素、转铁蛋白和亚硒酸钠，并摸索出这些因子的适宜比例。本发明的角膜缘干细胞无血清培养基是由下列质量比的原料制成的每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F (Dulbecco， s Modified Eagle's Medium :F12 Medium 1:1) 60 ml 90 ml、牛血清 白蛋白(BSA) 0. 5g 4g、表皮生长因子(EGF) 1(^g 4Pg、胰岛素(insulin) 0. 1mg lmg 、氢化可酸松20ug 100ug、霍乱毒素lug 10ug、转铁蛋白0. lmg lmg、 亚硒酸钠O. lug lug、山羊成纤维细胞条件培养基(GCLCM) 10 m1 40 ml，青霉 素和链霉素各5X103IU 2X10"IU。制备本发明角膜缘干细胞无血清培养基的配方优选质量比范围是 每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 70 m1 90 ml、 BSA 1 g 3g、 EGF 1Pg 2l^g、 i謂lin 0. 2mg 0. 8mg 、氢化可酸松40ug 60ug、
霍乱毒素lug 5ug、转铁蛋白0. lmg 0. 5mg、亚硒酸钠0. 2ug 0. 5ug、GCLCM 10 m1 30 ml、青霉素和链霉素各8X1()3IU 1X104IU。本发明角膜缘干细胞无血清培养基的最佳质量百分比是每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 80ml、 BSA 2g、 EGF 2Pg、 insulin 50Qug 、氢化可酸松50ug、霍乱毒素2ug、转铁蛋白500ug、亚 硒酸钠500ng、 GCLCM 20ml、青霉素1X104IU 、链霉素1 X 104 IU。本发明采用在培养基添加成纤维细胞条件培养液的办法，替代用成纤维细 胞共培养的方法。此外，该发明用激素、细胞因子组合及成纤维细胞条件培养 液和BSA补充了因不添加血清而导致的营养因子的不足，完全满足角膜缘干细 胞体外长期扩增培养的营养需求，是一种理想的可商品化生产的无血清培养基。
图1角膜缘干细胞在有血清培养基和无血清培养基中的生长曲线图。 图2角膜缘干细胞在无血清培养基中克隆生长图。 图3无血清培养基培养角膜缘干细胞Ps3免疫组化染色阳性图。 图4无血清培养基培养的角膜缘干细胞具有高核质比，细胞器不发达等干 细胞特性图。图5无血清培养基培养的角膜缘干细胞RT-PCR检测曲线图。'具体实施方式
结合附图和发明人给出的具体具体实施例、试验例来进一步说明本发明培 养基的有益效果。实施例1成纤维细胞条件培养基的制作本发明的关键是成纤维细胞条件培养基的制作，现以关中奶山羊角膜缘干 细胞无血清培养基制作为例予以说明。成纤维细胞条件培养基的制备在眼科手术显微镜下，无菌剪取关中奶山羊角膜上皮组织(深约200 yni)，将角膜上皮组织块切割成5mmX5mm的小块， 上皮面朝上贴于皿底，每皿3-4块，加培养基(DMEM/F12+2腿SA+10ng/ml EGF+10ug/ml insulin+青链霉素各100 IU /ml)进行培养。当成纤维细胞铺满 平皿后，去组织块，将成纤维细胞消化传代以lX105/ml，接种在50mm平皿中， 培养48小时后收集培养基，离心(4000r/分30分钟)，0. 22um滤膜过滤除菌， 一2(TC保存备用，标为GCLCM。 实施例2培养基配方，每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 60ml、BSA 0. 5g、 EGF 1Pg、 insulin 100ug 、氢化可酸松20ug、霍乱毒素lug、转铁蛋白100ug、亚 硒酸钠100ng、 GCLCM 40ml、青霉素2X104工U 、链霉素2X104 IU。实施例3培养基配方每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 70ml、 BSA lg、 EGF Dg、 insulin 300ug 、氢化可酸松40ug、霍乱毒素lug、转铁蛋白300ug、 亚硒酸钠300ng、 GCLCM 30ml、青霉素1X10411]、链霉素1X104 IU。实施例4培养基配方每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 80ml、 BSA 2g、 EGF 2Pg、 insulin 500ug 、氢化可酸松50ug、霍乱毒素2ug、转铁蛋白500ug、亚 硒酸钠500ng、 GCLCM 20ml、青霉素1X10411]、链霉素1X104 IU。实施例5培养基配方每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 90ml 、 BSA 4g、 EGF #g、 insulin lmg 、氢化可酸松100ug、霍乱毒素10ug、转铁蛋白lmg、亚硒 酸钠lug、 GCLCM 10ml、青霉素5X103111 、链霉素5X103 IU。 试验例1本发明无血清培养基效果试验下面部分大写字母所代表的意思MTT (噻唑兰)、SDS(十二烷基磺酸钠)、 细胞OD值(细胞光密度值)、PCM(增殖细胞核抗原)、ABCG2 (the ATP-binding cassette transporter) 、 Cx43(连接因子43)、 CK3 (细胞角蛋白3) 、 CK12 (细胞 角蛋白12)。首先，比较了角膜缘干细胞在有血清培养基和无血清培养基中的增殖活性。 将lml原代角膜缘干细胞悬液，以每孔5.0乂103细胞数接种于96孔培养板，再 分别加入有血清培养基和无血清培养基，每组24孔，标准条件下培养并于倒置 相差显微镜下观察细胞的形态和生长情况。培养24h后，每天各组取3孔，加 入MTT液(50 mg MTT溶于IO mlPH7. 2的PBS中，过滤除菌)，37。C孵育6 h， 然后吸出100 W液体，再加100 W甲月赞溶解剂十SDS十二烷基磺酸钠液SDS10 g溶解于100 ml的四蒸水中，用10 mol/L HQ调至为0. 01 mol/L的HC1 ) 37 。C过夜，在酶标仪(型号Elx800UV)上测OD值(双波450 nm、 490 nm),持 续8d，纵坐标为每天所测OD值的平均值，横坐标为天数，绘制细胞生长曲线， 对各组OD值进行差异显著性检验。结果表明，在两种培养基中所测平均细胞光 密度值无显著差异(P>0.05)，在两种培养基中细胞均保持很强的增殖能力， 细胞在两种培养基中的生长趋势保持一致(图1)，在两种培养基中细胞均保持 很强的增殖能力，细胞在两种培养基中的增殖能力没有显著差异。再者，将角膜缘干细胞接种在无血清条件培养基中，4-5天后角膜缘干细 胞呈铺路石样生长，这些细胞体积小，胞体透亮，折光性强，核质比高(图2)。
高核质比细胞器不发达是干细胞的基本特性，在无血清培养基中培养的角 膜缘干细胞很好地维持了干细胞高核质比细胞器不发达等相关特性。具有干细 胞的基本特征。这些细胞在铺有明胶的培养皿中，能够形成全克隆(图3)，根据细胞形成克隆的不均一性将细胞分为三类，①在培养皿中形成面积10 30 mm2 、含有2 5 X104个细胞的细胞团块的全克隆(holoclone),所含终末分化 细胞〈5 % ，此类细胞体积小，但具极强的增殖、分化潜能；②形成〈5 mm2面积 的细胞克隆的流产克隆(paraclone)，此类克隆面积小，不规则，几乎均为终末分 化细胞，这类细胞外形大而扁平，具短暂的增殖、分化潜能，细胞分裂增殖少于15 次，便逐渐丧失增殖能力；③介于全克隆与流产克隆之间的部分克隆 (meroclone)，所含终末分化细胞比例为5 % 100 %;此类克隆形成的面积也介 于全克隆与流产克隆之间，细胞大小不一，具有较强的增殖、分化潜能。全克隆 细胞即为干细胞，而部分克隆细胞又被命名为短暂扩充细胞(BarrandonJC, et al. Proc Vatl Acad Sci USA， 1987， 84:2302-2306)。角膜缘干细胞在无血清 培养基中能够快速增殖，3天左右即出现多个小的片状克隆，几天后克隆逐渐扩 增面积增大，边缘大致呈圆形，克隆内部细胞大小较均一，大部分细胞核质比 较高，为Bairandon等定义的全克隆，具有很强增殖潜能。其次，将原代角膜缘干细胞以1X104接种于4孔板，用无血清培养基培养， 细胞生长到80%融合连生时用狄多聚甲醛固定15 min， PBS冲洗，然后按 Histostain PTimP-Plus kits免疫组化染色试剂盒程序分别进行Pe3抗体的染色， DAB显色，Leica倒置显微镜下观察照相。免疫组化结果显示，在这些细胞核中 角膜缘干细胞阳性标记^呈强阳性表达(图4)， Pe3是目前角膜缘干细胞公认的 特异性标记,对无血清培养基中培养的角膜缘干细胞进行P63免疫组织化学染色， 结果呈强阳性，说明无血清培养基能够维持角膜缘干细胞处于未分化状态。最后，提取无血清培养基培养的角膜缘干细胞RNA并进行RT-PCR。总RNA 的提取参照裂解液(Sidest印 Lysis and Stabilization Buffer，购自Merck 公司，CatNo. 400901〕的说明书进行，逆转录采用TaKaRa公司的RNA PCR Kit (Code No.DRR019A)进行。P63、 ABCG2、 PCNA、 CK3、 CK12、 Cx43等引物由上 海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物的序列及产物长度见表1表l引物的序列及产物长度Accession no.Sense primerAntisense primerPCRproductP63NM—003722CAGACTCMTTTAGTGAGAGCTCATGGTOGGGCAC440 bpCK3NM一。57808GGCAGAGATCGAGGGTGTCGTCATCCTTCGCCTGCTGTAG145 bpCK12D78367ACATGAAGAAG亂CACGAGGATGTCTGCTCAGCGATGGTTTCA150 bpABCG2DQ904356TGGAGTCATGMACCTGGCCTCAAAAGGACAGCATTCGCTGTGC474 bpCx43AY074716ATGACAAATCXTTCCCMTCTCGTTCCTCCTCTTTCTTGTTCAGT141 bpPCNAAF416380AGTGGAGMCTTGG嵐TGGAAGAGACAGTGGAGTGGCTTTTGT154 bpP -act inAF481159CACGGTGCCCATCTACGACTTGATGTCACGGACGATTT157 bp结果显示，角膜缘干细胞阳性标记P63、 ABCG2、 PCNA等呈强阳性表达， 角膜缘干细胞阴性标记CK3、 CK12、 C^等未表达(图5):无血清培养基培养的 角膜缘干细胞RT-PCR检领U。 P63、 ABCG2、 PC織是角膜缘干细胞公认的阳性标记， CK3、 CK12、 Cx43是角膜缘干细胞公认的阴性标记，通过RT-PCR的办法进行综 合判定，结果显示P63、 ABCG2、 PCNA等阳性标记呈强阳性表达，CK3、 CK12、 Cx43等阴性标记未表达，说明无血清培养基能够很好地维持角膜缘干细胞处于 未分化状态。综合上述结果，表明无血清条件培养基能很好地促进角膜缘干细胞的快速 增殖，同时维持角膜缘干细胞处于未分化状态。
权利要求
1. 一种角膜缘干细胞无血清培养基，其特征在于它是由下述原料制成每100ml无血清培养基中各种成分的含量，其中各原料的比例是DMEM/F 60 ml 90 ml、牛血清白蛋白0. 5 g 4 g、表皮生长因子11^g 4l"ig、胰岛素0. lmg lmg 、氢化可酸松20ug 100ug、霍乱毒素lug 10ug、转铁蛋白0. lmg lmg、 亚硒酸钠O. lug lug、山羊成纤维细胞条件培养基10ml 40ml，青霉素和链 霉素各5X1()3IU 2X104IU。
2. 根据权利要求1所述的角膜缘干细胞无血清培养基，其特征在于它是由 下述原料制成DMEM/F12 70ml 90ml、牛血清白蛋白1 g 3g、表皮生长因子lPg 2lAg、 胰岛素0. 2mg 0. 8mg 、氢化可酸松40ug 60ug、霍乱毒素lug 5ug、转铁蛋 白0. lmg 0. 5mg、亚硒酸钠0. 2ug 0. 5ug、山羊成纤维细胞条件培养基10 m1 30 ml、青霉素和链霉素各8X1()3IU 1X104IU。
3. 根据权利要求1所述的角膜缘干细胞无血清培养基，其中各原料的比例是每100ml无血清培养基中各种成分的含量为DMEM/F12 80ml、牛血清白蛋白 2g、表皮生长因子2Pg、胰岛素500ug 、氢化可酸松50ug、霍乱毒素2ug、转 铁蛋白500ug、亚硒酸钠500ng、山羊成纤维细胞条件培养基20ml、青霉素1X 104IU 、链霉素1X104 IU。
全文摘要
本发明公开了角膜缘干细胞无血清培养基，由下述质量百分比的原料制成的DMEM/F12 60ml～90ml、BSA 0.5g～4g、EGF 1μg～4μg、insulin 0.1mg～1mg、氢化可酸松20ug～100ug、霍乱毒素1ug～10ug、转铁蛋白0.1mg～1mg、亚硒酸钠0.1ug～1ug、GCLCM 10ml～40ml、青霉素和链霉素各5×10<sup>3</sup>IU～2×10<sup>4</sup>IU。本发明采用在培养基添加成纤维细胞条件培养液的办法，用激素、细胞因子组合及成纤维细胞条件培养液和BSA补充了营养因子，满足角膜缘干细胞体外长期扩增培养的营养需求，是一种可商品化生产的无血清培养基。
文档编号C12N5/06GK101121926SQ200710018160
公开日2008年2月13日 申请日期2007年7月2日 优先权日2007年7月2日
发明者弥胜利, 窦忠英 申请人:西北农林科技大学