专利名称：：通过邻氨基苯甲酸合酶的叶绿体靶向表达产生高色氨酸玉蜀黍的制作方法通过邻氨基苯曱酸合酶的叶绿体靶向表达产生高色氨酸玉蜀黍
背景技术：
：本申请要求于2006年8月11日提交的美国临时专利申请系列号60/837,200的优先权，所述专利申请的完整公开内容特别引入本文作为参考。1.发明领域本发明涉及用于表达和定位植物细胞中的邻氨基苯曱酸合酶的方法和纟且合物。2.相关技术的描述在玉蜀黍中，邻氨基苯曱酸合酶作为2亚基酶存在，其催化叶绿体中从芳族氨基酸途径到色氨酸的生物合成的第一个反应分支。它已显示是植物中的色氨酸产生调节中的重要酶。Anderson等人(美国专利号6,118,047)证实来自玉蜀黍的邻氨基苯甲酸合酶的色氨酸不敏感性a亚基的超表达导致转基因玉蜀黍植物中增加水平的色氨酸。近来，已显示来自原核来源的邻氨基苯甲酸合酶的单体形式能够增加转基因大豆和玉米中的色氨酸水平(美国专利申请系列号10/138,927，作为美国专利7,217,865授权,和10/430,0U,作为美国专利申请公开20030213010公开)。参与叶绿体内的生物合成途径的大多数蛋白质是核编码的且在细胞溶胶中合成。这些蛋白质对于质体的正确靶向因此对于其生物合成功能是必需的。在大多数情况下，这种靶向通过称为叶绿体转运肽(CTP)或质体转运肽的N末端延伸的存在来达到。来自细菌来源的转基因必须具有与编码所表达的多肽的序列融合的编码CTP序列的序列，如果所表达的多肽待区室化在叶绿体中的话。因此，外源多肽至叶绿体的转运借助于使编码CTP序列的多核普酸序列与编码外源多肽的多核苷酸的5'区域可操作地连接来实现。对于利用单体邻氨基苯甲酸合酶的植物细胞的操作和转化中的许多用途，将希望被引入植物细胞内的基因导致转运至质体且在质体中起作用的产物。然而，并非所有CTPs都能够以相同功效实现这种转运。用于邻氨基苯甲酸合酶在单子叶植物且特别是玉蜀黍植物中的成功表达和定位的有效和有用CTPs的鉴定是本领域需要的。发明概述在一个方面，本发明提供了编码包含与单体邻氨基苯甲酸合酶(AS)融合的叶绿体转运肽(CTPs)的多肽的多核苷酸，其中叶绿体转运肽能够使邻氨基苯甲酸合酶区室化在植物细胞的质体级分中。当此种邻氨基苯甲酸合酶核酸在转基因植物中表达时，升高水平的色氨酸可以在植物的细胞内达到。在本发明的一个实施方案中，提供了包含这些多核苷酸的表达载体和构建体。包含此种表达载体和构建体的重组植物细胞也是本发明的部分。通过使用本发明的序列、构建体和方法表达蛋白质获得的转基因植物细胞、种子和饲料产物进一步视为本发明的部分。在另一个方面，本发明提供了用于增加单子叶植物中的游离色氨酸含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括用编码包含与单体邻氨基苯甲酸合酶融合的叶绿体转运肽的多肽的多核苷酸转化单子叶植物，其中叶绿体转运肽作用于使邻氨基苯甲酸合酶活性定位或区室化在植物细胞的质体中。在另外一个方面，本发明提供了编码来自土壤杆菌属(爿^Y)Z^"enww)和中华根瘤菌属(S/"c^/z/zo6nw)来源的单体邻氨基苯曱酸合酶的新型分离的多核普酸。在本发明的一个实施方案方面中，提供了包含这些新多核苷酸的表达载体。在另外一个实施方案中，包含这些表达载体的宿主细胞、转基因植物细胞、转基因植物、来自转基因植物的种子和所得到的饲料产物也视为本发明的部分。附图简述图l描述了质粒pMON66560的限制性酶切图图2描述了包含植物转化载体pMON66560的转基因玉米细胞的质体级分的蛋白质印迹分析图3描述了质粒pMON78824的限制性酶切图图4描述了质粒pMON78832的限制性酶切图图5描述了质粒pMON69765的限制性酶切图图6描迷了质粒pMON69755的限制性酶切图图7描述了质粒pMON82561的限制性酶切图5图8描述了质粒pMON78152的限制性酶切图图9描述了质粒pMON78153的限制性酶切图图10描述了质粒pMON82560的限制性酶切图图ll描述了质粒pMON69779的限制性酶切图图12描述了质粒pMON78137的限制性酶切图图13描述了质粒pMON78140的限制性酶切图图14描述了质粒pMON78143的限制性酶切图图15描述了质粒pMON78142的限制性酶切图图16描述了质粒pMON78139的限制性酶切图图17描述了质粒pMON69774的限制性酶切图图18描述了质粒pMON69775的限制性酶切图图19描述了质粒pMON69777的限制性酶切图发明详述依照本发明，提供了用于表达单体邻氨基苯曱酸合酶且将单体邻氨基苯甲酸合酶转运至植物细胞的质体的组合物。本发明特別提供了将在增加转化植物的细胞中的游离色氨酸含量中找到用途的新多核苦酸序列。此外，提供了编码来自土壤杆菌属和中华根瘤菌属的单体邻氨基苯甲酸合酶多肽的新多核苷酸。本发明提供了编码包含与单体邻氨基苯甲酸合酶(AS)融合的叶绿体转运肽(CTPs)的多肽的多核苷酸，其中叶绿体转运肽能够使邻氨基苯曱酸合酶区室化在植物细胞的质体级分中。当此种邻氨基苯甲酸合酶核酸在转基因植物中表达时，升高水平的色氨酸可以在植物的细胞内达到。在本发明的一个方面，提供了包含这些多核苷酸的表达载体和构建体。包含此种表达载体和构建体的重组植物细胞也是本发明的部分。通过使用本发明的序列、构建体和方法表达蛋白质获得的转基因植物细胞、种子和饲料产物进一步视为本发明的部分。在本发明的另外一个方面，提供了增加单子叶植物中的游离色氨酸含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括用编码包含与单体邻氨基苯甲酸合酶融合的叶绿体转运肽的多肽的多核苷酸转化单子叶植物，其中叶绿体转运肽能够使邻氨基苯曱酸合酶活性区室化在植物细胞的质体中。本发明另外涉及编码来自土壤杆菌属和中华根瘤菌属来源的单体邻氨基苯甲酸合酶的新型分离的多核苷酸。在本发明的一个方面，提供了包含这些新多核苷酸的表达载体。在另外一个实施方案中，包含这些表达载体的宿主细胞、转基因植物细胞、转基因植物、来自转基因植物的种子和所得到的祠料产物也视为本发明的部分。显示本发明所需性状例如增加的色氨酸水平的转基因植物或种子包含赋予所需性状的插入转基因植物的基因组内的特定外源DNA。性状是与对照植物中天然存在的性状可测量的变化，所述对照植物例如具有基本上相同基因型的缺乏特定外源DNA的植物或种子。增强的所需性状可以通过使转基因植物或种子中的'性状与对照植物或种子的性状相比较进行测量，所述转基因植物或种子具有与增强的所需性状相关的特定外源DNA。"高色氨酸玉蜀黍"因此指在任何植物部分优选种子中具有增加的色氨酸水平的玉米(玉蜀黍)植物；种子在本文中也可以称为仁或谷粒。邻氨基苯甲酸合酶(AS;EC4丄3.27)催化植物、真菌和细菌中从芳族氨基酸途径到色氨酸的生物合成的第一个反应分支。在植物中，关于色氨酸的生物合成的化学过程被区室化在叶绿体中。因为邻氨基苯曱酸合酶是在细胞溶胶中合成的核编码的蛋白质，所以它必须通过一些方式转运到叶绿体内以参与色氨酸的生物合成。此外，对于野生型或非转基因植物天然的内源性邻氨基苯曱酸合酶通过在生物合成过程中积聚色氨酸对于反馈抑制敏感。以这种方法，非转基因植物细胞的色氨酸含量限制于相对低的水平。例如，在非转基因玉米中，色氨酸水平在植物的种子中一般小于百万分之25(ppm);通常为8-10ppm范围。本发明提供了编码与能够使邻氨基苯甲酸合酶靶向质体的叶绿体转运肽融合的来自土壤杆菌属和中华根瘤菌属的反馈不敏感的单体邻氨基苯甲酸合酶多肽的新多核普酸。本发明进一步提供了DNA构建体和在其基因组中包含本发明的DNA构建体的至少一个植物表达盒的种子，其中种子具有比不包含构建体的种子更高的色氨酸含量。增加的色氨酸可以通过在仁中积聚增加量(超过25ppm)的氨基酸显示于植物细胞中，且可以通过任何合适的方法进行测量，例如适当提取的组织的质谱分光光度法或高效液相层析的那种。具有增加的色氨酸的本发明的转基因玉米仁特别用作饲料或食物产物、膳食或膳食产物、7或蛋白质产物、或由包含比类似变种的非转基因仁更高的色氨酸含量的仁加工的其他产物的来源。本发明的任何才直物或其部分都可以进^亍加工以产生饲碑+(例如青贮饲料)、膳食、蛋白质或油制剂。用于这种目的的特别优选的植物部分是种子。在优选实施方案中，饲料、膳食、蛋白质或油制剂被设计用于在喂养家畜(牲畜)中使用。产生饲料、膳食、蛋白质和油制剂的方法是本领域已知的，例如整体引入本文作为参考的美国专利4,957,748;5,100,679;5,219,596;5,936,069;6,005,076;6,146,669;和6,156，227。在优选实施方案中，蛋白质制剂是高蛋白制剂。高蛋白制剂优选具有超过5%w/v、更优选10%w/v和甚至更优选15%w/v的蛋白质含量。分离的多核苷酸和多肽在一个实施方案中，本发明提供了编码与单体邻氨基苯甲酸合酶融合的叶绿体转运肽(CTPs;质体转运肽)的分离的多核苷酸。术语"质体"意指包含前质体、白色体、造粉体、色质体和叶绿体的一类植物细胞器。在本发明的背景中，短语"转运肽"意指指导将核编码的蛋白质转运至质体的多肽。一般地，CTP或转运肽序列位于多肽的N末端处。编码单体邻氨基苯甲酸合酶的多核苷酸和编码CTPs或质体转运肽的多核普酸是"分离的"，因为它们已基本上与核酸在其中核酸天然存在的生物的细胞中通常与之结合的其他核酸序列分开或从其纯化出来，所述其他核酸序列即其他染色体或染色体外DNA。该术语包含生物化学纯化以便基本上去除污染核酸和其他细胞组分的核酸。该术语还包含重组核酸和化学合成的核酸。如本文所使用的，术语"基本上纯化的"指与以化的^子是在制^中存在的占优势的种类。'基本上纯化的分子S以超过60%不含、优选75%不含、更优选90%不含天然混合物中存在的其他分子(溶剂不计)。术语"基本上纯化的，，不意欲包含以其天然状态存在的分子。此种分离的多核苷酸还可以是"重组的"，因为它们已与外源多核苦酸组合。例如，重组DNA分子可以是与外源启动子、或与对于宿主细胞内源的启动子可操作地连接的分离的多核苦酸。如本文所使用的，"外源"多核苷酸是已引入宿主细胞内，且优选与序列。"内源"或"天然"多核苷酸是天然存在于宿主细胞或生物中的DNA序列。同样地，"外源"多肽是由已引入宿主细胞内，且优选与其天然、码的蛋白质序列。"内源"或"天然"多肽是天然存在于宿主细胞或生物中的蛋白质。特别重要的是代表能够使单体邻氨基苯甲酸合酶多肽正确区室化在转化的植物细胞的质体中的本发明的CTP序列的多肽。CTP序列可以衍生自编码来自玉蜀黍或来自其他植物物种的质体靶向蛋白质的基因，所述其他.植物物种包括<旦不限于芸香(graveo/e朋)、稻((>>^)和鼠耳芥(Jra6/J(/wW/^/ia"a)。叶绿体转运肽序列是本领域已知的且包括下述的耙向序列鼠耳芥核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶(核酮糖二磷酸羧化酶-力。氧酶)小亚基l(At-CTPl;Silva-Filho等人，(1996);Schnell等人，(1991);鼠耳芥5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(5-(enolpyruvyl)shikimate-3-phosphatesynthase)(At-CTP2;Archer等人，(1990);玉蜀黍(Zeama")邻氨基苯甲酸合酶-al(Zm-ASAl-CTP)和a2(Zm-ASA2-CTP)亚基；玉蜀黍二氢吡啶二羧酸合酶(Zm-DHDPS-CTP);稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶(Os-蜡质的(Waxy)(Os-Wx)-CTP;和芸香邻氨基苯甲酸合酶a亚基(Rg-ASA短-CTP和Rg-ASA长-CTP)。关于叶绿体转运肽的用途的描述，参见都引入本文作为参考的美国专利号5,188,642和5,728,925。编码本发明的叶绿体转运肽(CTPs)的示例性分离的多核苷酸包括包含下述核苷酸SEQIDNOs的DNAs:SEQIDNO:l:编码具有修饰的切割位点(C/M)的At國CTP2(C/M)(鼠耳芥5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶)的核酸序列；SEQIDNO:2:编码具有天然的切割位点(E/K)的At-CTP2(E/K)的核酸序列；SEQIDNO:3:编码At-CTP2(E/K)+来自成熟的鼠耳芥属EPSPS合酶的10个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:4:编码At-CTP2(E/K)+来自成熟的鼠耳芥属EPSPS合酶的5个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:5:编码Zm-ASAl-CTP(玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶al亚基)的核酸序列；SEQIDNO:6:编码Zm-ASAl-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶al亚基的20个氨基酸的核酸序列；SEQIDN0:7:编码Zm-ASA2-CTP(玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶a2亚基)的核酸序列；SEQIDNO:8:Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶a2亚基的5个氨基酸；SEQIDNO:9:编码Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a2亚基的18个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:10:编码Os-Wx-CTP(稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶)的核酸序列；SEQIDNO:ll:编码Os-Wx-CTP+来自成熟的稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶的5个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:12:编码Os-Wx-CTP+来自成熟的稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶的20个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:13:编码Rg-AS短-CTP(芸香邻氨基苯甲酸合酶a亚基；Metl至Ser72)的核酸序列；SEQIDNO:14:编码Rg-AS长-CTP(芸香邻氨基苯甲酸合酶a亚基；Metl至Ser92)的核酸序列；SEQIDNO:15:编码Zm-DHDPS-CTP(玉蜀黍二氬吡啶二羧酸合酶)的核酸序列；SEQIDNO:16:Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氬吡。定二羧酸合酶的9个氨基酸；SEQIDNO:17:编码Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氬吡啶二羧酸合酶的20个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:18:编码Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氬吡咬二羧酸合酶的3个氨基酸的核酸序列；和SEQIDNO:19:编码鼠耳芥核酮糖二磷酸羧化酶-加氬酶小亚基基因叶绿体转运肽，CTP1的核酸序列。本发明还预期编码包含例如下述氨基酸序列中的任何一个的叶绿体转运肽(CTP)的任何分离的核酸SEQIDNO:20:具有修饰的切割位点(C/M)的At-CTP2(C/M)(鼠耳芥5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶)；SEQIDNO:21:具有天然的切割位点(E/K)的At-CTP2(E/K);SEQIDNO:22At-CTP2(E/K)+来自成熟的鼠耳芥属EPSPS合酶的IO个氨基酸；SEQIDNO:23At-CTP2(E/K)+来自成熟的鼠耳芥属EPSPS合酶的5个氨基酸；SEQIDNO:24Zm-ASA1-CTP(玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶al亚基)；SEQIDNO:25Zm-ASA1-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶al亚基的20个氨基酸；SEQIDNO:26Zm-ASA2-CTP(玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a2亚基)；SEQIDNO:27Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶a2亚基的5个氨基酸；SEQIDNO:28Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a2亚基的18个氨基酸；SEQIDNO:29Os-Wx-CTP(稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶)；SEQIDNO:30Os-Wx-CTP+来自成熟的稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶的5个氨基酸；SEQIDNO:31Os-Wx-CTP+来自成熟的稻ADP葡萄糖焦磷酸化酶的20个氨基酸；SEQIDNO:32Rg-AS短-CTP(芸香邻氨基苯甲酸合酶a亚基；Metl至Ser72);SEQIDNO:33Rg-AS长-CTP(芸香邻氨基苯曱酸合酶a亚基；Metl至Ser92);SEQIDNO:34Zm-DHDPS-CTP(玉蜀黍二氢吡啶二羧酸合酶)SEQIDNO:35Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氬吡咬二羧酸合酶的9个氨基酸；SEQIDNO:36Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氬吡啶二羧酸合酶的20个氨基酸；SEQIDNO:37Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氢吡啶二羧酸合酶的3个氨基酸；和SEQIDNO:38鼠耳芥核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因，CTP1。编码与绿色焚光蛋白(GFP)、与邻氨基苯曱酸合酶、或与和GFP融合的邻氨基苯甲酸合酶融合的本发明叶绿体转运肽(CTPs)的分离的多核苷酸包括包含下述核苷酸SEQIDNOs的DNAs:SEQIDNO:39编码与绿色荧光蛋白(GFP)融合的At-CTP2的核酸序列；SEQIDNO:40编码与绿色焚光蛋白(GFP)融合的Zm-ASA2-CTP的核酸序列；SEQIDNO:41编码与绿色荧光蛋白(GFP)融合的Os-Wx-CTP的核酸序列；SEQIDNO:42编码与绿色荧光蛋白(GFP)融合的Rg-AS短-CTP的核酸序列；SEQIDNO:43编码与绿色焚光蛋白(GFP)融合的Zm-DHDPS-CTP的核酸序列；SEQIDNO:44编码与GFP融合的Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氢吡啶二羧酸合酶的5个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:45编码与苜蓿才艮瘤菌(A/nzo6,wmme/〃o")邻氨基苯曱酸合酶融合的具有天然的切割位点E/K的At-CTP2的核酸序列；SEQIDNO:46编码与苜蓿根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶融合的At-CTP2+来自成熟的鼠耳芥属633合酶的10个氨基酸的核酸序列；SEQIDNO:47编码与苜藉根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶融合的Zm-ASA2-CTP的核酸序列；SEQIDNO:48编码与苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶融合的Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a2亚基的18个氨基酸的核酸序列；和SEQIDNO:49编码与根癌土壤杆菌(々ro6a"m'騰f騰e/腦'e"s)单体邻氨基苯甲酸合酶融合的Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a2亚基(由Zm-ASA2基因编码的前65个氨基酸)的18个氨基酸的核酸序列，所述根癌土壤杆菌单体邻氨基苯曱酸合酶与绿色荧光蛋白融合。与绿色荧光蛋白(GFP)或邻氨基苯甲酸合酶融合的本发明的叶绿体转运肽(CTPs)的代表性序列包括包含下述多肽SEQIDNOs的氨基酸SEQIDNO:50与绿色荧光蛋白(GFP)融合的At-CTP2;SEQIDNO:51与绿色焚光蛋白(GFP)融合的Zm-ASA2-CTP;SEQIDNO:52与绿色荧光蛋白(GFP)融合的Os-Wx-CTP;SEQIDNO:53与绿色荧光蛋白(GFP)融合的Rg-AS短-CTP;SEQIDNO:54与绿色焚光蛋白(GFP)融合的Zm-DHDPS-CTP;SEQIDNO:55与GFP融合的Zm-DHDPS-CTP+来自成熟的玉蜀黍二氢吡啶二羧酸合酶的5个氨基酸；SEQIDNO:56与苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶融合的具有天然的切割位点E/K的At-CTP2;SEQIDNO:57与苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶融合的At-CTP2+来自成熟的鼠耳芥属EPSPS合酶的IO个氨基酸；SEQIDNO:58与苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶融合的Zm-ASA2-CTP;SEQIDNO:59与苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶融合的Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基笨曱酸合酶a2亚基的18个氨基酸；和SEQIDNO:60与根癌土壤杆菌单体邻氨基苯曱酸合酶融合的Zm-ASA2-CTP+来自成熟的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a2亚基(由Zm-ASA2基因编码的前65个氨基酸)的18个氨基酸，所述根癌土壤杆菌单体邻氨基苯甲酸合酶与绿色荧光蛋白融合。某些寡核苷酸对于本发明的实践也有用，例如包含SEQIDNOs:61-198的寡核苷酸在用于瞬时原生质体测定的转染载体构建中有用；以及包含SEQIDNOs:226-231的寡核苷酸作为PCR引物有用。本发明的另一个方面涉及分离的单体邻氨基苯甲酸合酶(AS)及其片段；以及它们在用于获得产生升高水平的游离L-色氨酸的植物的方法中的用途。游离L-色氨酸在包含此种多肽的转基因植物中的超量产生起因于编码邻氨基苯甲酸合酶或其结构域的核酸的引入和表达。此种邻氨基苯甲酸合酶核酸包括野生型或突变a-结构域，或单体形式的邻氨基苯曱酸合酶。单体形式的邻氨基苯曱酸合酶包含在单条多肽链中的至少2个邻氨基苯甲酸合酶结构域，例如与|3-结构域连接的a-结构域。天然的植物邻氨基苯甲酸合酶一般对于经由L-色氨酸及其类似物的反馈抑制非常敏感。此种抑制构成了用于调节色氨酸合成途径的关键机制。因此，高活性、更有效或被色氨酸或其类似物抑制至较低程度的邻氨基苯曱酸合酶或其结构域将可能产生升高水平的色氨酸。根据本发明，来自根癌土壤杆菌和苜蓿中华根瘤菌(S/鮮/n油讓舰/"0〃)的邻氨基苯甲酸合酶对于产生高水平的色氨酸特别有用。本发明的分离的单体邻氨基苯曱酸合酶另外包括失调(deregulated)形式及其片段。此种失调形式包括如本文所描述的中华根瘤菌属的S51C等位基因；如美国专利申请2003097677中描述的土壤杆菌属邻氨基苯曱酸合酶的F298W、V48F、V48Y、S51F和S51C等位基因；和如名称为"HighTryptophanMaize"的美国专利申请11/503,532中描述的土壤杆菌属邻氨基苯甲酸合酶S51C等位基因的密码子最优化形式，所述专利申请各自整体引入本文作为参考。这些等位基因对于来自色氨酸的反馈抑制是失调的。为了在植物或所选择的宿主细胞中产生高水平的色氨酸，分离所选择的邻氨基苯甲酸合酶核酸，且可以在体外进行操作以包括在植物细胞或其他细胞类型中基因表达所需的调节信号。因为植物中的色氨酸生物合成途径被报道存在于质体内，所以外源邻氨基苯曱酸合酶核酸被？I入质体内或通过添加编码氨基末端质体转运肽的核酸区段进行修饰。此种质体转运肽可以将邻氨基苯曱酸合酶基因产物指导入质体内。为了改变色氨酸的生物合成，编码邻氨基苯曱酸合酶活性的核酸必须被引入植物细胞或其他宿主细胞内，并且这些转化的细胞必须直接或间接进行鉴定。可以使用完整的邻氨基苯曱酸合酶或其有用部分或结构域。邻氨基苯甲酸合酶被稳定地掺入植物细胞基因组内。控制邻氨基苯曱酸合酶的表达的转录信号必须由植物细胞或其他宿主细胞识别且在植物细胞或其他宿主细胞中起作用。即，邻氨基苯曱酸合酶必须被转录成信使RNA(mRNA)，并且mRNA必须在植物细胞核内是稳定的且被完整转运至细胞质用于翻译。邻氨基苯曱酸合酶mRNA必须具有由植物细胞核糖体识别且正确翻译的合适的翻译信号。多肽基因产物必须基本上逃避细胞质中的蛋白酶解攻击，被转运到正确的细胞区室内(例如质体)且能够采取将赋予酶促活性的三维构象。邻氨基苯曱酸合酶必须进一步能够在色氨酸及其衍生物的生物合成中起作用；即，它必须定位于催化生物合成中的侧面步骤(推测在质体中)的天然植物酶的附近，以获得所需底物和传递合适的产物。即使所有这些条件都被满足，色氨酸的成功超量产生也不是可预测的事件。一些转基因的表达可能受附近的染色体元件负面影响。如果高水平的色氨酸通过突变而达到以减少反馈抑制，那么可能存在补偿邻氨14基苯曱酸合酶步骤处减少的调节的其他控制机制。可能存在增加积聚的氨基酸的分解速率的机制。色氨酸和相关的氨基酸必须也在对植物无毒的水平上进行超量生产。最后，引入的性状必须是稳定的和可遗传的以允许商业开发和使用。编码邻氨基苯曱酸合酶的多核苦酸的分离和鉴定在美国专利申请系列号10/138,927和10/430,011中得到描述,所述美国专利申请系列号10/138,927作为美国专利申请公开20030097677公开且作为美国专利7,217,865授权；所述美国专利申请系列号10/430,01l作为美国专利申请公开20030213010公开，所迷专利整体引入本文作为参考。编码本发明的邻氨基苯甲酸合酶的示例性分离的DNAs包括包含下述核普酸SEQIDNOs的DNAs:SEQIDNO:199根癌土壤杆菌野生型邻氨基苯甲酸合酶；SEQIDNO:201根癌土壤杆菌F298W突变等位基因；SEQIDNO:203根癌土壤杆菌S51F突变等位基因；SEQIDNO:205根癌土壤杆菌S51C突变等位基因；SEQIDNO:207根癌土壤杆菌密码子最优化的S51C突变等位基因；SEQIDNO:209苜蓿中华根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶野生型；和SEQIDNO:211苜蓿中华根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶S51C突变等位基因。本发明还预期编码包含例如下述氨基酸序列中的任何一个的邻氨基苯曱酸合酶的分离的核酸SEQIDNO:200根癌土壤杆菌野生型邻氨基苯曱酸合酶；SEQIDNO:202才艮癌土壤杆菌F298W突变体；SEQIDNO:204根癌土壤杆菌S51F突变体；SEQIDNO:206根癌土壤杆菌S51C突变体；SEQIDNO:208根癌土壤杆菌密码子最优化的S51C突变体；SEQIDNO:210苜蓿中华根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶野生型；SEQIDNO:212苜蓿中华根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶S51C突变体。如本文就邻氨基苯曱酸合酶而言使用的，术语"单体"意指2个或更多邻氨基苯曱酸合酶结构域以功能方式并入单条多肽链内。单体邻氨基苯甲酸合酶可以在体内装配成二聚体形式。单体邻氨基笨甲酸合酶多核苷酸和多肽可以从各种生物中进行分离，例如根癌土壤杆菌、鱼腥藻属(勘幽謹)M22983、巴西固氮螺菌(爿z一n'〃廳6画7e廳)、马尔他布鲁氏菌(Srwce〃"me/^"ws)、小眼虫(五wg/e""grac//^)、百脉才艮中'f曼生根瘤菌(A/MoWz/zo&wm/o")、念珠蓝细菌属(A^Woc)物种PCC7120或苜蓿根瘤菌(飾油'謂me///"/)(苜蓿中华根瘤菌)。可替代地，单体邻氨基苯甲酸合酶核酸和多肽可以由选自任何方便的单体或多聚体邻氨基苯曱酸合酶基因的结构域组合进行构建。此种生物包括例如根癌土壤杆菌、鱼腥藻属M22983、鼠耳芥、巴西固氮螺菌、马尔他布鲁氏菌、百脉根中慢生根瘤菌、念珠蓝细菌属物种PCC7120、苜蓿根瘤菌(苜蓿中华根瘤菌)、血色红，支单胞菌(尺/zcxio/^ei/Jomo"w;^/wWns)、芸香、石危,黄矿石危化叶菌(Sw/yb/o6z^50//aton'c^)、鼠伤寒沙门氏菌)、大豆、稻、棉花、玉蜀黍、或编码邻氨基苯甲酸合酶的亚基或结构域的任何基因。编码所选择的结构域的核酸可以进行重组连接。例如，编码a-结构域的C末端的核酸可以通过形成磷酸二酯键与编码p-结构域的N末端的核酸进行连接，或反之亦然。作为替代方案，此种单结构域多肽可以进行化学连接。例如，a-结构域可以通过形成肽键经由其C末端与卩-结构域的N末端进行连接，或反之亦然。如本文所使用的，"对经由色氨酸的反馈抑制失调的"邻氨基苯曱酸合酶是，当失调的和"野生型"邻氨基苯甲酸合酶暴露于等量色氨酸或色氨酸的氨基酸类似物时，保留比相应的"野生型"或天然易感的邻氨基苯曱酸合酶多大于约10%活性的邻氨基苯曱酸合酶。优选地，失调的邻氨基苯曱酸合酶保留比相应的"野生型"或天然易感的邻氨基苯曱酸合酶多大于约20%的活性。多肽的片段和变体也视为本发明的部分。片段是变体多肽，其具有与先前描述的多肽的氨基酸序列的部分而非全部完全相同的氨基酸序列。片段可以是"独立式的"或包含在片段形成部分或区域的较大多肽内，最优选地作为单个连续区域。优选的片段是生物学活性片段，其是介导本发明的多肽的活性的那些片段，包括具有类似活性或改善的活性或具有减少的活性的那些。还包括的是在动物中是抗原性或免疫原性的那些片段，目的是为了产生在检测法例如酶联免疫吸附测定中有用的抗体。多肽的变体还包括通过保守氨基酸置换(残基由具有类似特征的另一个置换)与序列表中所示的序列不同的多肽。一般而言，此种置换在Ala、Val、Leu和Ile中;在Ser和Thr之间；在Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在Lys和Arg之间；或在Phe和Tyr之间。特别优选的是以任何组合其中5-10;1-5;l-3或l个氨基酸是被置换、缺失或添加的变体。显示与本文明确描述的DNA序列和氨基酸序列80%、更优选85%、甚至更优选90-95%和最优选96%-99%序列同一性的功能性邻氨基苯曱酸合酶DNA序列和功能性邻氨基苯曱酸合酶多肽也在本发明的范围内。例如，85%氨基酸同一性意指当2个序列就最大匹配进行比对时，85%的氨基酸是相同的。在使匹配达到最大中允许缺口(在匹配的2个序列的任何一个中)；5或更小的缺口长度是优选的，而2或更小是更优选的。本发明的多核苷酸可以例如用于构建用于转化植物宿主细胞的重组表达载体，如本文进一步讨论的。植物转化栽体在本发明中重要的是多核苷酸序列或多核苷酸在重组表达载体中的使用，以指导编码与CTP融合的单体AS的多核苷酸序列在植物宿主细胞中的转录和翻i奪。如本文所使用的，"重组"包括提及已通过引入异源核酸序列进行修饰的细胞或载体或衍生自如此修饰的细胞的细月包。因此，例如重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内以相同形式未发现的基因，或由于有意的人为干预表达以其他方式异常表达、表达不足或根本未表达的天然基因。术语"可操作地连接地"指启动子和第二种序列之间的功能键，其中启动子起始且介导与第二种序列对应的DNA序列的转录。如本文所使用的，"可操作地连接地"还指2个或更多不同的核苷酸序列之间的功能键，从而使得被连接的核酸序列是邻接的，且当必须连接2个蛋白质编码区时，是邻接的且在相同阅读框中。例如，使CTP编码序列与编码单体邻氨基苯甲酸合酶的核香酸序列可操作地连接可能需要一个或多个DNA序列的操作，例如方便的限制位点或可以允许氨基末端转运序列的更好识别的接头序列。此种多核苷酸可以根据标准PCR扩增技术使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物进行扩增。可替代地，它们可以使用标准合成技术例如自动化DNA合成仪进行合成。表达载体最低限度包含编码在宿主细胞中表达的多肽的多核苷酸序列。一般地，表达载体置于某些调节元件的控制下，所述调节元件包括启动子、组织特异性调节元件和增强子。此种表达载体被说成与调节元件"可操作地连接"。本发明的表达载体一般包含在植物细胞中起作用的启动子，其与编码与本发明的叶绿体转运肽(CTP)融合的邻氨基苯甲酸合酶的核酸序列和在植物宿主细胞中起作用的转录终止区可操作地连接。本发明的示例性表达载体包括具有下述SEQIDNOs的DNAs:SEQIDNO:213,编码pMON68065的核酸序列，用于Zm-ASA2-CTP+18::AgroAS(S51C)非最优化的突变等位基因的表达载体；SEQIDNO:214,编码pMON68066的核酸序列，用于Zm-ASA2-CTP+18::AgroAS(S51C)非天然最优化的(nno)突变等位基因的表达载体；SEQIDNO:215,编码pMON69757的核酸序列，用于包含AgroAS(F298W)突变等位基因的构建体的表达载体；SEQIDNO:216,编码pMON69770的核酸序列，用于包含具有可变3'UTR的AgroAS(S51C)非最优化的突变等位基因的构建体的表达载体；SEQIDNO:217,编码pMON69768的核酸序列，用于包含AgroAS(S51F)突变等位基因的构建体的表达载体；SEQIDNO:218,编码pMON78850的核酸序列，用于包含苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶野生型等位基因的构建体的表达载体；SEQIDNO:219，编码pMON78851的核酸序列，用于包含苜蓿根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶S51C等位基因的构建体的表达载体。"宿主细胞"意指包含载体且支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译(表达)的细胞。用于在本发明中使用的宿主细胞可以是单子叶植物细胞或细菌细胞。本发明的细菌宿主细胞的例子是土壤杆菌属。在优选实施方案中，宿主细胞是玉蜀黍细胞。如本文所使用的，"转基因植物"是具有稳定引入其基因组内的外源多核苷酸的植物，例如来自另一个生物的核或质体多核苷酸。术语"种子"和"仁，，理解为在含义中是等价的。术语仁经常用于描述18玉米或稻植物的种子。在所有植物中，种子是由种皮、胚、糊粉和胚乳组成的成熟的胚珠。特别重要的是本发明的多核苷酸用于制备重组表达载体以编码在宿主植物细胞中与CTP融合的单体AS的用途，其中CTP将AS的定位指导到植物宿主细胞的质体级分。植物表达构建体一般包含与本发明的核酸序列和在植物宿主细胞中起作用的转录终止区可操作地连接的在植物宿主细胞中起作用的启动子。如本文所使用的，"启动子"意指对于从DNA的RNA转录起始所必需的DNA序列的区域。启动子位于待转录的DNA上游，且具有充当关于RNA聚合酶的结合位点的区域，且具有与其他因子一起作用以促进RNA转录的区域。更具体而言，植物中的基本启动子包含与转录起始相关的规范区域，例如CAAT和TATA框。在本发明中，优选的启动子分子和5'UTR分子允许以超过植物的其他细胞和组织的速率或水平在种子细胞或组织中转录。本领域技术人员将认识到存在在植物细胞中起作用的许多组成型和组织特异性启动子，且已在文献中得到描述。例如，启动子在下述专利中得到描述美国专利6，437，217(玉蜀黍RS81启动子)；美国专利5，641,876(稻肌动蛋白启动子);美国专利6,426,446(玉蜀黍RS324启动子)；美国专利6,429,362(玉蜀黍PR-1启动子)；美国专利6,232,526(玉蜀黍A3启动子)；美国专利6,177,611(组成型玉蜀黍启动子)；美国专利5，322,938,5,352,605、5,359，142和5,530,196(35S启动子)；美国专利6，433,252(玉蜀黍L3油质蛋白启动子，P-Zm丄3);美国专利6,429,357(稻肌动蛋白2启动子以及稻肌动蛋白2内含子)；美国专利5,837,848(根特异性启动子)；美国专利6,294,7M(光诱导型启动子)；美国专利6，140,078(盐诱导型启动子)；美国专利6，252,138(病原体诱导型启动子)；美国专利6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；美国专利6,635,806(，薏苡辛启动子，P-Cl.Gcx);美国专利申请系列号10/732,721(玉蜀黍胚特异性启动子ZmEM;emb5);美国专利7,151,204(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)；SEQIDNO:220(大麦Perl启动子)；SEQIDNO:221(玉蜀黍B32启动子)；SEQIDNO:222(玉蜀黍Z27启动子)；SEQIDNO:223(玉蜀黍球蛋白l启动子；Bdanger和Kriz,1991);和SEQIDNO:224(薏苡辛L-3启动子)，所有这些专利都引入本文作为参考。组成型启动子例如衍生自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子(美国专利号5,858,741和5,322,938)或衍生自玄参花叶病毒的FMV35S启动子(美国专利号5，378,619)在大多数植物器官中产生高水平的表达。增强或重复形式的CaMV35S和FMV35S启动子在本发明的实践中有用，例如增强的CaMV35S(e35S)(Odell,等人,1985);美国专利5,378,619)。此外，还可以优选造成目的蛋白质在植物的特定组织中的表达，所述植物的特定组织例如叶、茎、根、块茎、种子胚乳、种子胚、果实等，并且所选择的启动子应具有所需组织和发育特异性。区可^由内;、邻氨基苯°曱酸合酶的基因序列或衍生自不同、基因1源的方便的转录终止区提供。这些转录终止区通常称为3'非翻译区或3'UTRs。3'UTRs区域的例子是胭脂氨酸合酶3'区域(nos3';Fraley等人,1983)、小麦热激蛋白hsp17(T-Ta.Hsp17)、稻的谷蛋白基因的3'区域(Os-gtl;SEQIDNO:225)、来自玉米醇溶蛋白基因的3'UTR例如Z273'UTR(Lopes等人,1995)、玉蜀黍球蛋白l(T-Zm.Glbl)和T誦Ps.RbcS2:E9(豌豆核糖体二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基)、WO0011200A2中公开的那些和本领域已知的其他3'UTRs,其可以与和叶绿体转运肽融合的邻氨基苯曱酸合酶编码区组合进行测试且使用。技术人员将认识到能够在单建体中使用。此外，转录增强子或增强子的重复可以用于增加来自特定启动子的表达。此种增强子的例子包括但不限于玉蜀黍hsp70内含子(也称为Zm.DnaK)(美国专利号5,424,412Brown，等人)、Adh内含子l(Callis等人，1987)、稻肌动蛋白内含子(McElroy等人，1991;美国专利号5,641,876)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人,1989)、TMVco元件(Gallie等人，1999)和CaMV35S增强子或章鱼氨酸合酶增强子(美国专利号5,290,924)。因为转录起始位点和编码序列的开始之间的DNA序列即非翻译的前导序列可以影响基因表达，所以人们还可能希望采用特定前导序列。可以使用对于本领域技术人员可用的任何前导序列。优选的前导序列指导所附着基因的最佳表达水平，例如，通过增加或维持mRNA稳定性和/或通过阻止翻译的不合适的起始(Joshi,1987)。此种序列的选择任凭本领域技术人员处理。预期了衍生自在单子叶植物且特别是玉蜀黍和稻中高度表达的基因的序列。测定本发明的分离的CTP序列使目的蛋白质靶向质体的效率的测定是本领域众所周知的。例如，报道基因例如P-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或绿色荧光蛋白(GFP)可以与CTP序列可操作地连接。将这种基因融合物置于合适的启动子的控制下，连接到转化载体内，且转化到植物细胞内。在用于表达和定位到质体内的足够时间段后，提取质体级分且测定报道分子活性。分离的CTP序列使报道蛋白质靶向且递送至质体的能力因此得到评估且与其他已知的CTP序列进行比较；参见Silva-Filho等人，(1996)。植物细胞转化本发明的重组表达载体已引入其内的植物细胞、组织、器官或植物被视为转化的、转染的或转基因的。转基因的或转化的植物细胞或植物也包括植物细胞或植物的后代和由育种程序产生的后代，所述育种程序的存在改变的表型。在核酸序列插入细胞内的背景中的术语"引入的"意指"转染"、或"转化"或"转导"，且包括提及核酸序列整合入真核或原核细胞内，在其中核酸序列可以整合入细胞的基因组内(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA),转变成自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。如本文所使用的，术语"植物"包括提及完整植物，植物器官(例如叶、茎、根等)，种子和植物细胞及其后代。如本文所使用的，植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可以在本发明的方法中使用的植物种类一般是单子叶植物。本发明优选的植物是玉蜀黍。如本文所使用的，"转基因植物"包括提及在其基因组内包含异源多核普酸的植物。一般地，异源多核苷酸稳定整合在基因组内，从而使得多核苷酸传递给连续世代。异源多核苦酸可以单独整合到基因组内或作为重组表达载体的部分整合到基因组内。"转基因的"在本文中用于包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已通过异源核酸的存在加以改变，包括最初这样改变的那些转基因生物(transgenics)以及由起始转基因生物通过有性杂交或无性繁殖制备的那些。因此在其细胞内具有异源多核苷酸的植物在本文中称为转基因植物。异源多核苷酸可以稳定整合到基因组内，或可以是染色体外的。优选地，本发明的多核苷酸稳定整合到基因组内从而使得多核苷酸传递给连续世代。多核苷酸单独整合到基因组内或作为重组表达载体的部分整合到基因组内。如本文所使用的，关于核酸"异源的"是源自外来物种的核酸，或如果来自相同物种，那么通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座中由其天然形式相当大地修饰。例如，与异源结构基因可操作地连接的启动子来自与结构基因衍生自其的那种不同的物种，或如果来自相同物种，那么一种或两种由其最初形式相当大地修饰。异源蛋白质可以源自外来物种，或如果来自相同物种，那么通过有意的人为干预由其天然形式相当大地+多饰。转化优选是持久的，即通过所引入的表达构建体整合到宿主植物基因组内，从而使得所引入的构建体传递给连续植物世代。技术人员将认识到本领域存在广泛多样的转化技术。适合于靶宿主植物的任何技术都可以在本发明的范围内使用。例如，构建体可以以多种形式引入，包括但不P艮于DNA链、在质粒中或在人工染色体中。构建体引入粑植物细胞内可以通过多种技术来完成，包括但不限于磷酸钙-DNA共沉淀、电穿孔、显微注射、土壤杆菌属传染、脂质体或微粒转化(即，基因枪)。就微粒轰击(美国专利5,550,318;5,538,880;和5,610,042;所述专利各自特别整体引入本文作为参考)而言，粒子用多核苷酸包被且通过推进力递送到细胞内。示例性粒子包括包含钨、铂和优选地金的那些。用于通过粒子加速将DNA递送到植物细胞内的有用方法是Biolistics⑧ParticleDeliverySystem(BioRad,Hercules,California),其可以用于通过筛例如不锈钢或NYTEX筛将用DNA或细胞包^f皮的粒子推进到用在悬浮液中培养的单子叶植物细胞覆盖的过滤器表面上。微粒轰击技术可广泛应用，且可以用于转化事实上任何植物物种。可以通过微粒轰击转化的物种的例子包括单子叶植物物种，例如玉米(PCT公开WO95/06128)、大麦、小麦(整体引入本文作为参考的美国专利5,563,055)、稻、燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及许多双子叶植物，包括烟草、大豆(整体引入本文作为参考的美国专利5,322,783)、向日葵、花生、棉花、番茄和一般而言的豆科植物(整体引入本文作为参考的美用于在本发明的方法中使用。通常，包括在本发明的表达载体内的将是具有用于在宿主中表达所必需的调节区且为选择转化细胞作准备的结构基因。基因可以提供对于细胞毒剂例如抗生素、重金属、毒素等的抗性，为营养缺陷型宿主互补提供原养型，病毒免疫等。依赖于表达构建体或其组分引入其内的不同宿主物种的数目，可以使用一种或多种标记，其中用于选择的不同条件用于不同宿主。当土壤杆菌属用于植物细胞转化时，可以使用可以引入土壤杆菌属宿主内用于与土壤杆菌属宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri质粒同源重组的载体。包含用于重组的T-DNA的Ti或Ri质粒可以是武装的(armed)(能够引起菌瘿形成)或解除武装的(不能引起菌瘿形成)，后者是允许的，只要Wr基因存在于转化的土壤杆菌属宿主中。武装的质粒可以产生正常的植物细胞和菌癭的混合物。在一些情况下，当土壤杆菌属用作媒介物用于转化宿主植物细胞时，由T-DNA边界区为边界的表达或转录构建体将插入能够在大肠杆菌(Eco/,)和土壤杆菌属中复制的广宿主范围载体内，存在在文献中描述的广宿主范围载体。常用的是pRK2或其衍生物。参见，例如，引入本文作为参考的Ditta等人，(1980)和EPA0120515。可替代地，人们可以将待在植物细胞中表达的序列插入包含分开的复制序列的载体内，其中之一使载体在大肠杆菌中稳定，且另一个使载体在土壤杆菌属中稳定。参见，例如，McBride和Summerfelt(1990),其中利用pRiHRI(Jouanin等人，1985)复制起点且其提供植物表达载体在宿主土壤杆菌属细胞中另外的稳定性。包括在表达构建体和T-DNA内的将是允许选择转化的土壤杆菌属和转化的宿主细胞的一种或多种标记。许多标记已开发用于与植物细胞一起使用，例如对于氯霉素、卡那霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。使用的特定标记对于本发明不是必需的，优选的一种或多种标记依赖于具体宿主和构建方式。对于植物细胞使用土壤杆菌属的转化，外植体可以与转化的土壤杆菌属组合且温育足够时间用于转化，杀死细菌且在合适的选择培养基中培养植物细胞。一旦愈伤组织形成，那么枝条形成可以依照已知方法通过使用合适的植物激素进行促进，且将枝条转移至生根培养基用于植物的再生。植物随后生长至结种并且种子可以用于确立重复世代。存在获得包含多重表达载体的本发明植物细胞的几种可能的方式。用于产生包含本发明的载体或多核苷酸序列的植物的任何方法和具有编码分开的酶的另一种多核苷酸序列的至少一种其他载体由本发明包含。例如，本发明的表达载体可以用于通过下述与第二种构建体同时转化植物，通过在单个植物转化载体(质粒)中包括2种表达载体或通过使用分开的植物转化载体，其各自表达所需基因。第二种载体可以引入已用第一种表达载体转化的植物内，或可替代地，转化的植物，一种具有第一种构建体和一种具有第二种构建体，可以使用标准育种技术进行杂交，以使构建体一起包含在相同植物中。方法
技术领域：
：本发明提供了增加转基因植物的种子中的游离色氨酸水平的方法。在一个实施方案中，增加色氨酸的方法包括将编码与CTP可操作地连接的单体邻氨基苯甲酸合酶的核酸序列引入植物细胞内，所述CTP能够使单体邻氨基苯曱酸合酶靶向或定位至植物细胞的叶绿体。本发明的单体邻氨基苯曱酸合酶是对经由色氨酸的反馈抑制不敏感的失调形式的酶。如本文所使用的，植物细胞、植物组织、植物部分或植物中"增加"或"升高"水平的游离色氨酸是在未转化的植物细胞、植物组织、植物部分或植物中发现的水平的约2-200倍、优选约5-150倍、且更优选约IO-IOO倍的水平，所述未转化的植物细胞、植物组织、植物部分或植物即其中基因组未由编码与单体邻氨基苯曱酸合酶融合的叶绿体转运肽的多核普酸的存在改变的那种。例如，转化的植物种子中的游离L-色氨酸水平与未转化的植物种子("原材料")中的那些进行比较。本发明的进一步方面是提供用于预测CTP使单体AS正确区室化至植物细胞的质体的能力的相对高通量的方法。本发明提供了利用与各种单体AS和各种CTPs融合的绿色荧光蛋白(GFP)在玉蜀黍原生质体或玉蜀黍发育中的胚中的瞬时表达的显现方法。GFP能够产生绿色荧光，在具有在395nm处的峰的UV至蓝色范围中吸收且在具有在510nm处的峰的绿色范围中发射。这种方法允许AS::GFP多肽的定位的显现。其中超过50%的定位在质体中的结果将是CTP使单体AS成功区室化的能力的阳性预示。本发明进一步提供了制备营养上增强的玉米饲料产物的方法，其包括将本发明的玉米植物的种子加工成膳食、蛋白质或油。此外，本发明提供了用于在转基因植物细胞中、或在衍生自此种转基因植物细胞的飼料或膳食产物中检测属于本文描述的任何CTP::AS序列组合的独特DNA序列的方法。当在DNA扩增法中测试以从由此种转基因植物细胞、或衍生自此种转基因植物细胞的饲料或膳食产物中提取的DNA扩增DNA分子时，此种转基因植物细胞、或衍生自此种转基因植物细胞的詞料或膳食产物的基因组，产生对于包含任何独特的CTP::ASDNA序列的表达载体诊断性的扩增子。如本文所使用的，"扩增子"是已使用扩增技术例如PCR或LCR合成的DNA片段。"扩增子"以其通常使用也理解为PCR产物。本发明现在已总地进行描述，它通过参考下述实施例将更更容易理解，包括所述实施例仅用于举例说明的目的且不意欲限制本发明。实施例包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应明的实践中作用良好，且因此可以^皮-魄为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中进行许多改变且仍获得相同或相似结果。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的某些试剂可以替代本文描述的试剂，同时将达到相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此种相似取代和修饰被视为在如附加权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。实施例1包含CTP1叶绿体转运肽的邻氨基苯甲酸合酶的定位这个实施例证实编码与土壤杆菌属邻氨基苯甲酸合酶等位基因的氨基末端融合的CTP1叶绿体转运肽的转基因的蛋白质产物未有效地靶向转基因玉蜀黍中的胚质体。植物转化载体pMON66560(图1)编码融合蛋白，其包含与AgroAS(F298W(由SEQIDNO:201编码)的氨基末端融合的来自土壤杆菌属核酮糖二磷酸羧化酶-力。氧酶小亚基基因的叶绿体转运肽序列CTPl(由SEQIDNO:19编码)，且由玉蜀黍胚特异性启动子(ZmEM)驱动。为了从来自转基因玉蜀黍植物的未成熟的仁的胚中分离质体级分，在授粉后25-27天(DAP)时收获几个谷穗。純合的F3转基因玉蜀黍植物包含植物转化载体pMON66560(图1)。当其从仁中切除时，将约2.5g胚置于水上。胚随后在冷的无菌水中漂洗3次，随后在冷PIM緩沖液(20mMHepes/NaOH、0.5M山梨糖醇、10mMKCl、lmMMgCl2、1mMEDTA、10mMDTT,pH7.4)中漂洗。胚和随后的级分在所有分离步骤中过程保持冷。随后将胚转移至包含5mlPIM的培养皿，且使用单边刀片精细地切碎直至切碎的胚的一致性类似沙子。使切碎的胚通过1层Miracloth(CalbiochemCorporation,LaJolla,CA)过滤到50ml锥形管内，且用PIM达到20ml的总体积。在分析前将这种过滤的匀浆(指定为级分H)的小等分试样贮存于-80。C。随后使过滤的匀浆在750xg下离心5分钟以使质体沉淀。倒去上清液，且将小等分试样(命名为S1)贮存于-80。C。然后向沉淀的质体中加入2.5mlPIM的等分试样，并且使用小的、软毛漆刷使沉淀重悬浮。小等分试样取出且冷冻(命名为P1的级分)后，使2.5ml重悬浮的沉淀在2个不连续的Percoll梯度中的每一个上分层。梯度管由在3ml75%Percoll/PIM上分层的6ml35%Percoll/PIM组成。梯度管随后在lOOOxg下离心8分钟。收集在35%/75%界面处所得到的质体条带且转移至另一个15ml管，并且向每个管中加入5ml1XPIM。在750xg下离心5分钟后，取出上清液，且使2个沉淀在0.25mlPIM中重悬浮。包含纯化的质体的重悬浮的沉淀级分命名为P2且在分析前贮存于-80。C。4种分离的级分(H、Sl、P1和P2)中AS蛋白质的存在通过蛋白质印迹分析进行分析，其中使用本领域众所周知的方法。简言之，蛋白质级分通过SDS-PAGE在4-12。/。Bio-RadCriterionBis-Tris凝月交(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上分离，装载18ing蛋白质/泳道。电泳后，将蛋白质转移至硝酸纤维素，且对一式两份的斑点实施用于蛋白质印迹的标准规程，包括封闭、第一抗体温育(下文描述的第一抗体)、洗涤、26第二抗体温育(与辣根过氧化物酶缀合)、洗涤和化学发光检测。在印迹分析中使用的第一抗体在山羊中抗下述而激起(a)来自玉蜀黍的邻氨基苯甲酸合酶a-2亚基，已知的质体定位蛋白质；(b)豌豆谷氨酰胺合成酶1(GS1)，细胞溶胶形式的谷氨酰胺合酶(GS)(Tingey等人，1987);和(c)土壤杆菌属邻氨基苯曱酸合酶。使用本领域已知的标准方法制备分别命名为抗玉蜀黍ASa、抗豌豆GSl和抗AgroAS的抗体。结果(图2)证实抗玉蜀黍ASa抗体尽管识别对应于所有4个级分中的玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶a-2亚基的条带，但在质体级分P1和P2中富集。相比之下，抗豌豆GS1抗体识别对应于级分H和S1中预期大小的蛋白质的条带，粗P1质体级分中较小量的蛋白质，和纯化的质体P2级分中几乎不能检测的量。谷氨酰胺合成酶的这种分配模式与其至细胞溶胶的定位一致。抗AgroAS抗体识别预期大小的蛋白质，其显示类似在所有4个级分中细胞溶胶标记GS1的模式，指出它也主要定位于细胞溶胶中，不管编码序列包括CTP1序列的事实。结果指出CTP1在使蛋白质区室化在玉蜀黍胚细胞的质体中的表达载体中将是没有用的。此外，结果暗示并非所有叶绿体转运肽都具有使单体AS成功定位至玉蜀黍细胞的质体的能力。实施例2关于邻氨基苯曱酸合酶的定位的另外转运肽序列这个实施例描述了在原生质体转染载体的构建中整合入的各种CTP序列的设计，所述原生质体转染载体包含玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶-绿色荧光蛋白(Zm-AS::GFP)融合物和实施例3中详细描述的对照::GFP融合物；并且其在实施例4中描述的瞬时表达测定系统中进行评估。表1.CTP变体<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>实施例3转化栽体的构建这个实施例描述了包含玉蜀黍邻氨基苯曱酸合酶::绿色荧光蛋白(Zm-AS::GFP)融合物和对照::GFP融合物的原生质体转化载体的构建，其在实施例4中描述的瞬时原生质体和胚测定中使用。2种一般策略用于构建这些载体。第一种策略涉及引入限制位点的CTP-AS编码序列的PCR扩增，以促进GFP编码序列的添加。第一种策略由pMON78824(图3)的构建进行例示。质粒pMON78824通过使用质粒pMON66574作为模板PCR扩增包含Zm-ASA2CTP编码序列的DNA片段进行构建。将BamHI限制位点整合入引物AS25和AS3'(分别为SEQIDNOs:63和61)内，以允许与在质粒pMON30098中包含的GFP编码序列符合读框地插入片段。根据TA克隆试剂盒(Invitrogen)中包含的制造商的说明书，将PCR产物克隆到pCRII载体(InvitrogenCorporation,Carlsbad，CA)内，产生质粒pMON82553。序列完整性通过DNA测序使用本领域众所周知的方法加以证实。随后使用BamHI从pMON82553中切下Zm-ASA2CTP片段，且插入质粒pMON30098的BamHI位点内以生成pMON78824。所得到的质粒pMON78824编码包含下述的融合蛋白(SEQIDNO:60):a)由Zm-ASA2基因编码的前65个氨基酸；b)根癌土壤杆菌单体邻氨基苯曱酸合酶；和c)GFP编码区，全都在e35S启动子的控制下。使用本领域众所周知的标准PCR和克隆法以相似方式构建包含各种GFP翻译融合物的另外的原生质体转化载体。转化载体IDs(pMON编号)、转化载体中包括的融合蛋白的一般描述、使用的PCR引物和PCR模板概括于表2中。表2.构建用于原生质体转染测定的策略l质粒载体的概括转染载体TD融合蛋白的一般描述PCR引物SEPCRQ模板IDNO:pMON30098基本栽体提供用于转染栽体n/a的GFP序列pMON79960CTP1::GFPcm5'61pMON66559CTP13'62pMON79961CTPl::AgroAS(F298W)::GFPcm5'61pMO赐559AS3'63pMON78818无CTP::AS5'64pMON79961AgroAS(F298W)::GFPAS3'63pMON78820Zm-ASA2(包括AS2565pMON64201CTP)::GFPAS2366pMON78822无CTP:成熟的Zm-AS2MAT67pMON64201ASA2::GFPAS2366pMON78824Zm-ASA2-CTP+AS2565pMON6657418::AgroAS(wt)::GFPAS3'63pMO固140Os-Wx-CTP::GFPRW-568pMON66356RW-369pMON78D9Rg-AS短-CTP::GFPRuta-570pMO画575Ruta-37130<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>用于原生质体转化载体构建的第二种策略涉及对应于各种CTPs的序列的装配，和使这些序列与AgroAS(F298W)(SEQIDNO:201)的N末端编码序列融合。CTP编码序列使用基于PCR的装配反应中的重叠引物组来产生，其基于Withers-Martinez等人(1999)的方法。这个第二种策略的例子是包含编码At-CTP2::AgroAS(F298W)::GFP融合蛋白的表达载体的质粒pMON78832(图4)的产生。这个第二种策略的第一个步骤是合成包含AgroAS(F298W)编码序列的穿梭载体，所述编码序列进行修饰用于使各种CTPs与其N末端和GFP与其C末端符合读框地融合。为此，使用pMON79961作为模板和寡核普酸引物AS5A(SEQIDNO:84)和AS3'(SEQIDNO:63)进行PCR扩增反应，其中使用本领域众所周知的方法。所得到的包含AgroAS(F298W)编码序列的2.2kbPCR产物进行琼脂糖凝胶纯化，连接到pCRII载体内，且使用InvitrogenTA克隆试剂盒(Invitrogen)转化到感受态大肠杆菌细胞内。所得到的中间质粒命名为WDRAPP01.0005,且进行测序以证实2.2kbPCR产物的存在。随后使用BamHI从质粒WDRAPP01.0005中切下2.2kb插入片段，且克隆到质粒pBluescriptIISK+中的BamHI位点内，以产生质粒pMON82554。这个第二种策略的第二个步骤涉及At-CTP2-AgroAS(F2卯W)N末端编码序列的合成。为此，制备表3中列出的下述14种寡核苷酸引物。表3.寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>通过将需要量溶解于蒸馏水中对于表5中描述的14种寡核苷酸的每一种制备母液(100pmoles/L)。随后通过使5(il每种个别的寡核苷酸溶液组合来制备寡核苦酸混合物(At-CTP2N1寡核苷酸混合物)。使用下述条件进行PCR扩增。混合物1:1微升CTP2Nl寡核苷酸混合物1微升4dNTP混合物(Roche,各10毫摩尔)23微升水混合物2:6微升25mMMgCl25微升PCR緩冲液(不含MgCl2)0.75微升ExpandHi-Fi酶混合物(Roche)13.25微升水使混合物1和混合物2组合在薄壁PCR管中且如下进行PCR反应:1)94°C/2分钟2)94。C/30秒3)45°C/30秒4)72。C/30秒5)回到步骤2再4次6)72t:/2分钟7)4。C/保持岸二/义尸CW混合物3:1微升第一次PCR反应物1.5微升Nl-l寡核苷酸(10皮摩尔/微升)1.5微升N1-14寡核香酸(10皮摩尔/微升)1微升dNTP混合物20微升水混合物4:6微升25mMMgCl25微升PCR緩冲液(不含MgCl2)0.75樣t升ExpandHi-Fi酶混合物(Roche)13.25微升水使混合物1和混合物2组合在薄壁PCR管中且如下进行PCR反应:33使混合物3和混合物4组合在薄壁PCR管中且如下进行PCR反应1)94°C/2分钟2)94。C/30秒3)55。C/30秒4)72。C/30秒5)回到步骤2再24次6)72tV2分钟7)4"C/保持如上所述所得到的正确大小(0.3kb)的PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化，且连接到pCRII载体(InvitrogenTA克隆试剂盒，Invitrogen)内。证实序列后，用Ncol和BsiWI消化质粒且克隆到pMON82554内，替代先前已在Ncol和BsiWI位点处取出的片段。所得到的中间质粒随后用BamHl进行消化，以产生随后克隆到pMON30098内的片^殳。这种所得到的质粒载体包含e35S启动子::hsp70内含子::At-CTP2:AgroAS(F298W)::GFP::nos3，UTR遗传元件(pMON78832;图4)。每种CTP的几个变体以上文描述的方式通过在CTP的3'末端处添加编码3-20个氨基酸的相应成熟蛋白质的DNA序列进行构建。对于包含CTP变体的每种pCRII载体，随后如上所述从载体中取出pCRII载体的NcoI和BSiWI限制位点之间的片段，且克隆到pMON82554穿梭载体的Ncol和BsiWI位点之间。如上所述这些载体的每一个然后用BamHI进行消化，以产生随后克隆到pMON30098的BamHI位点内的片段，以提供最终质粒载体的剩余遗传元件。包含与GFP融合的这些CTP变体的最终质粒载体和载体的剩余遗传元件连同在其构建中使用的引物一起在表4中列出。表4.构建用于原生质体转染测定的策略2质粒载体的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>pMONCTP::GFP变体引物名称SEQIDNO:CTP2-N1-1094CTP2-N1-1195CTP2-NW296CTP2-N1-1397CTP2-N1-1498pMON78138Zm网ASAl-CTP::AgroAS(F298W)::GFPASA1-1-1T107ASA1-1-2T108ASA1-1-3T109CTP2-N1-791ASA1-1-5B110^SA1-1-4B111ASA1-1-3BmASA1-1-2B113CTP2-N1-892pMON78141Zm-ASA1-CTP十20::AgroAS(F298W)::GFPASA1-1-1T107ASA1-1-2T108ASA1-20-3T114ASA1-20-4T115CTP2-N1-791ASA1-1-5B110ASA1-1-4B川ASA1-1-3B112"SAl-20-3B116ASA1-20-2B117C丁P2-Nl-892pMON69760Zm-ASA2-CTP::AgroAS(F298W)::GFPAS2-5'-l118AS2-5'-41119AS2-5'-81120AS2-5'-121121AS2-5'-161122AS2-3'-208123AS2-3'-168124AS2-3'-128125AS2-3'-88126AS2-3'-48127pMO歸761Zm-ASA2-CTP+5aa::AgroAS(F298W)::GFPAS2-5'-161-5aa128AS2-3'-183-5aa12937<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>pMONCTP::GFP变体引物名称SEQIDNO:pMON78137Os-Wx-CTP+20::AgroAS(F298W)::GFPRW-CM-1T137RW-CM-2T138RW-CM-3T139RW-CM-4T140證-CM-5T141證-CM-6T142RW-20-7T156RW-20-8T157RW-20-9T158RW-CM-8B144RW-CM-7B145RW-CM-6B146RW-CM-5B147RW-CM-4B148RW-CM-3B149RW-5-2B154kw-20-2B159RW國20-1B160pMON69758Zm-DHDPS-CTP::AgroAS(F298W)::GFPDHDPS-5'-l161DHDPS國5'-41162DHDPS-5'陽81163DHDPS-5'-121164DHDPS-5'-161165DHDPS-3'-AgroAS166DHDPS-3'-184167DHDPS-3'-140168pHDPS-3'-99169DHDPS-3'-59170pMON69759Zm-DHDPS-CTP+9aa::AgroAS(F298W)::GFPDHDPS-5'-161-9aa171DHDPS-5'-201-9aa172PHDPS-3'-216-9aa173DHDPS-3'-176-9aa174pMON69765Zm-DHDPS陽CTP+20aa::AgroAS(F298W)::GFPDHDPS-5'-201-20aa175DHDPS-5'-241-20aa176DHDPS-3'-249-20aa177DHDPS-3'-209-17839pMONCTP::GFP变体引物名称SEQIDNO:20aaDHDPS-3'-169-20aa179pMON69764Zm-DHDPS-CTP+5aa::AgroAS(F298W)::GFPDHDPS-5'-161陽5aa180DHDPS-5'-201-5aa181DHDPS-3'-244-5aa182DHDPS-3'-204-5aa183DHDPS-3'-164-5aa184pMO層772Zm-DHDPS-CTP::GFPDHDPSGFP-5'185DHDPSGFP-3'賜pMON69766Zm-DHDPS-CTP+5::GFPDHDPS-N1187DHDPS-N2188DHDPS-N3189DHDPS-N4190DHDPS-N9191DHDPS-N10192DHDPS-N11193DHDPS-N12194DHDPS-N13195DHDPS-N14196DHDPS-N15197DHDPS-画198实施例4AgroAS和变体至质体的定位这个实施例描述了用于预测不同叶绿体转运肽(CTPs)在AS::GFP融合蛋白的质体靶向中的能力的2种瞬时表达测定系统。这些测定利用包含邻氨基苯曱酸合酶-绿色荧光蛋白(AS::GFP)融合物和实施例3中描述的融合物的原生质体转染载体。开发了2种瞬时表达测定法以预测AS::GFP融合蛋白在玉蜀黍细胞中的定位。中等通量玉蜀黍原生质体系统用于就其使AS::GFP融合蛋白靶向变白的玉蜀黍叶细胞的质体的能力筛选许多不同的CTPs。在发育中的玉蜀黍胚中表达蛋白质的较低通量系统用于证实原生质体系统中可见的质体定位模式。来自这2种测定的数据随后用于预测各种CTPs在指导土壤杆菌属和中华根瘤菌属AS蛋白质在转基因玉蜀黍胚中的定位中的能力。40瞬时测定系统中测试的所有构建体用常见的载体主链中相同的遗传元件进行构建，所述常见的载体主链使用e35S启动子、hsp70(DnaK)内含子和nos3，UTR表达每种基因。为了确保瞬时测定系统正确发挥作用，构建了对照质粒。关于胞质定位的对照是包含无CTP的GFP融合物(pMON30098;表2和5)、与GFP的AgroAS融合物(不添力oCTP)(pMON78818;表2和5)和缺乏Zm-ASA2-CTP的截短的Zm-ASA2-CTP::GFP融合物(pMON78822;表2和5)的载体。用于质体定位的对照是与GFP融合的玉蜀黍ASA2(pMON78820;表2和5)和与GFP融合的At-CTP2(pMON53173;表5)。2种另外的对照用于证实来自转基因植物的数据；CTP1::GFP(pMON79960;表2和5)和CTPl::AgroAS(F298W)::GFP(pMON79961;表2和5)。来自这些载体中每一种的GFP或GFP融合蛋白的定位模式在表5中报告。该数据还证实如实施例l中描述的细胞分级分离结果，指出CTPl::AgroAS(F298W)::GFP融合蛋白的胞质定位和CTP1不能使AgroAS(F298W)靶向质体。在大多数实验中，对于测试的每种CTP构建另外的对照。这些对照由与GFP直接融合的测试的CTP组成。例如，Zm-ASA2-CTP与GFP融合(pMON69771)以测试Zm-ASA2::AgroAS::GFP融合物。用于构建测试的所有载体的方法在实施例3中详细描述。对于测试的每一种CTPs进行几个变化。这些变化通过改变对天然宿主蛋白质的CTP添加的N末端氨基酸的数目来区分(表l)。例如，在Zm-ASA2-CTP系列中，使用与GFP直接融合的实验测定的CTP，以及包括来自Zm-ASA2的N末端的5和18个氨基酸的2种另外形式，所述氨基酸从与CTP相邻的成熟的玉蜀黍邻氨基苯甲酸合酶a2亚基的氨基末端的区域中分离。构建体在表1中命名为2111-八3八2-(:丁？+5(SEQIDNO:8)和Zm-ASA2-CTP+18(SEQIDNO:9)。作为初步测试，表1中描述的CTP构建体在变白的原生质体系统中进行评估。使用本领域众所周知的方法由变白的玉蜀黍幼苗制备叶肉原生质体(参见例如Sheen，1993)。使用本领域众所周知的方法将不同的载体电穿孔到原生质体内。约18-24小时后，使用共焦显微镜术就GFP焚光计数原生质体细胞。简言之，使用配备氩离子激光器、绿色和红色氦-氖激光器以及变色二极管激发的激光器(CoherentLaserDivision,SantaClara,CA)的Zeiss激光器扫描显微镜(ZeissLaserScanningMicroscope)LSM510META(CarlZeissMicroimaging,Inc.，Thornwood,NY)进行显微镜术。使用LSM5ImageExaminer,版本3.2.0.70(CarlZeissMicroimaging,Inc.,Thornwood,NY)进行图像采集和分析。使用AdobePhotoshopCS,版本8.0(AdobeSystemsIncorporated,SanJose，CA)进行图像处理。就在下述中具有GFP荧光而言评分关于每种构建体的至少50个細胞；a)仅质体，'b)仅细胞溶胶和c)质体和细力包溶月交。作为次级测试，开发了特异性瞬时测定系统以评估设计为在发育中的玉蜀黍胚组织中表达的构建体。基于在包含仅质体定位的50%或更多转化细胞的原生质体系统中具有得分来选择通过这种测试评估的构建体。还测试了如上详述的另外的对照构建体。在授粉后约14天(DAP)时，从来自玉蜀黍例如HiII或近交亲本的表面灭菌谷穗中分离胚。将约20-30个胚置于包含补加有0.2M山梨糖醇+0.2M甘露糖醇的N6培养基的Petri板上(Chu,1978)。在室温下温育4小时后，使用BiolisticTMPDS-1000/He粒子递送系统(ParticleDeliverySystem)(Bio-RadCorporation)用由DNA包被的0.6pm金颗粒轰击胚。板在从停止屏到靶架9cm处轰击2次，具有1100psi的破裂压和lcm的间隙距离。轰击后，在如前所述通过多光子共焦显微镜术分析前使胚于28。C在黑暗中温育过夜。每种样品计数至少50个细胞且如上文关于原生质体系统所述进行评分。来自定位测定的结果显示于表5中。结果指出基于显现，下述6种CTPs使AgroAS有效把向玉蜀黍生殖细胞中的质体Zm-ASA2-CTP+18(SEQIDNO:9;pMON78824的CTP组分)、Rg國AS长-CTP(SEQIDNO:14;pMON78142的CTP组分)、Rg画AS短画CTP(SEQIDNO:13;pMON78143和pMON78139的CTP组分)、At-CTP2(E/K)(SEQIDNO:2;pMON78833的CTP组分)、At-CTP2(E/K)+10(SEQIDNO:3;pMON78834的CTP组分)和Zm國DHDPS-CTP+20(SEQIDNO:17;pMON69765的CTP组分)。结果还指出并非所有测定的各种CTPs在原生质体或胚瞬时表达测定中就定位AS::GFP的能力都是阳性的。这些结果确证了实施例1中描述的结果，且指出鉴定关于使单体AS蛋白质成功定位在单子叶植物的叶绿体中且因此产生升高的色氨酸水平的有用CTPs42的需要。表5.定位测定的结果pMONIDCTP::AgroAS::GFP变体原生质体%质体定位胚%质体定位78832At-CTP2(C/M)::AgroAS(F298W)::GFP68.6未测试78833At-CTP2(E/K)::AgroAS(F298W)::GFP647978834At-CTP2+10::AgroAS(F298W)::GFP723578835At-CTP2+5::AgroAS(F298W)::GFP60.6未测试53173对照At-CTP2::GFP>808078138Zm-ASA1-CTP::AgroAS(F298W)::GFP0未测试78141Zm-ASA1-CTP十20::AgroAS(F298W)::GFP0未测试69760Zm-ASA2-CTP::AgroAS(F298W)::GFP0未测试69761Zm-ASA2-CTP+5::AgroAS(F298W)::GFP0未测试78824Zm-ASA2-C丁P+18::AgroAS(wt)::GFP1008169771对照Zm-ASA2-CTP::GFP15未测试78135Os-Wx-CTP::AgroAS(F298W)::GFP0表测试78136Os-WxCTP+5::AgroAS(F298W)::GFP0未测试78137Os-Wx-CTP+20::AgroAS(F298W)::GFP72未测试78140对照Os-Wx-CTP::GFP77未测试78143Rg-AS短-CTP::AgroAS(F298W)::GFP87.35478142Rg-AS长-CTP::AgroAS(F298W)::GFP88.65578139对照Rg-AS短-CTP::GFP77.36769758Zm-DHDPS-CTP::AgroAS(F298W)::GFP0未测试69759Zm-DHDPS-CTP+9::AgroAS(F298W)::GFP3未测试69765Zm-DHDPS-CTP+20::AgroAS(F298W)::GFP71在质体和细胞溶胶中91%;胞溶胶中69763Zm-DHDPS-CTP+3::AgroAS(F298W)::GFP03369772对照Zm-DHDPS-CTP::GFP01069766对照Zm-DHDPS-CTP+5::GFP30未测试69774At-CTP2(E/K)::苜蓿根瘤菌邻氨基苯甲酸合酶::GFP64未测试69775Al-CTP2+10::苜蓿根瘤菌邻氛基苯甲酸合酶::GFP72.7未测试69776ZnvASA2-CTP::苜蓿根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶::GFP0未测试69777Zm-ASA2-CTP+18::苜蓿根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶::GFP70.7未测试78818对照无CTP::AgroAS(F298W)::GFP0078820对照Zm-ASA2(包括CTP)::GFP70.385<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*对于这些对照，在原生质体瞬时测定中未观察到质体定位；数据未定量。**对于这种对照，观察到质体和胞质定位但未定量。实施例5转化载体和玉蜀黍转化这个实施例描述了包含核酸序列的转化载体的构建，所述核酸序列编码与各种叶绿体转运蛋白组合的根癌土壤杆菌和苜蓿根瘤菌邻氨基苯曱酸合酶(AS)的野生型(wt)和突变等位基因。这个实施例还提供了用于由本文描述的转化载体转化玉蜀黍的规程。对于包含野生型根癌土壤杆菌AS的转化载体的构建，通过用XhoI消化、使用绿豆核酸酶使末端平端化且随后用BglII切割以分离第一个片段，从质粒pMON66580中切割出AS编码序列。为了分离包含玉蜀黍油质蛋白启动子、hsp70内含子和Tr7-3，UTR的第二个片段，用BglII和SmaI切割质粒pMON69753。将这2个片段连接以产生pMON69754。为了构建包含Zm-ASA2-CTP的最终转化载体，用XhoI消化pMON69754,且分离包含玉蜀黍油质蛋白启动子、hsp70内含子、与-wt融合的Zm-ASA2-CTP和Tr7-3，UTR的纯化片段。随后将这个片段连接到栽体pMON78808中，所述载体pMON78808也已用Xhol进行消化以产生最终转化载体pMO薩755(图6)。对于包含AgroAS(F298W)突变等位基因的转化载体的构建，pMON66869用StuI和RsrlI进行消化，以分离包含部分AgroAS(F298W)编码区的片段。类似地，pMON69754也用StuI和RsrlI进行消化，以分离包含玉蜀黍油质蛋白启动子、hsp70内含子、部分编码区和Tr7-3，-UTR的片段。使所得到的片段连接以产生pMON69756。为了构建最终转化载体，用XhoI消化pMON69756,且纯化包含玉蜀黍油质蛋白启动子、hsp70内含子、与AgroAS(F298W)融合的Zm-ASA2-CTP和Tr7-3，UTR的片段。随后将这个片段连接到pMON78808的XhoI位点内，以产生pMON69757;SEQIDNO:215)。类似地构建包含AgroAS(S51F)编码区(SEQIDNO:203)的转化载体。例如，上文描述的质粒pMON69754用BamHI和NcoI进行消化，以取出AgroAS编码区。质粒pMON58121也用BamHI和NcoI进行消化，以分禹AgroAS(S51F)突变等位基因。随后使所得到的片i殳连接以产生中间质粒pMON69767。如上所述通过用Xhol消化pMON69767且在pMON78808的XhoI位点处连接片段来构建最终转化栽体pMON69768。包含AgroAS(S51C)等位基因的转化载体的构建的例子是pMON68065。pMON68063用Xhol限制酶进行消化，在1.0%琼脂糖凝胶上进行分离，且从凝胶分离对应于与Zmhsp70(Zm.DNAK)内含子、AgroAS(S51C)等位基因和Os-gtl-3，UTR融合的玉蜀黍油质蛋白启动子的4569bpDNA片I爻。pMON78808DNA也用XhoI限制酶进行切割，使用碱性磷酸酶(NewEnglandBioLabsInc.)进行去磷酸化，并且使用QIAGENPCR純化试剂盒(QIAGENInc.)纯化DNA。使pMON78808的Xhol消化的DNA和pMON68063的4569bpXhol消化的DNA片段连接在一起以产生pMON68065。包含AgroAS(S51C)密码子最优化的(AgroAS(S51C)-nno)等位基因的转化载体的构建的例子是pMON68066。AgroAS(S51C)突变等位基因的密码子最优化如美国专利申请系列号11/503,532中描述的进行，所述专利引入本文作为参考)。密码子最优化的AgroAS(S51C)-nnoDNA通过BLUEHERONBIOTEC丽OLOGY组(Bothell,WA,USA)进行合成。合成DNA随后用NcoI和BamHI限制酶进行消化，在1.0%琼脂糖凝胶上进行分离，并且如上所述从凝胶切割出对应于AgroAS(S51C)-皿0的2193bpDNA片段且进行纯化。pMON68063的DNA也用NcoI和BamHI限制酶进行切割且在l.O%琼脂糖凝胶上进行分离。分离的5244bpNcoI/BamHI消化的DNA片段包含pMON68063中描述的所有遗传元件，除了AgroAS(S51C)突变等位基因。连接反应通过使NcoI/BamHI消化的AgroAS(S51C)-nnoDNA(2193bp片段)和pMON68063(5244bpDNA片段)的DNA混合来进行，以产生pMON68064。pMON68064随后用XhoI限制酶进行切割，在1.0%琼脂糖凝胶上进行分离，且如上所述纯化包含与hsp70(Zm.DNAK)内含子、AgroAS(S51C)-nno和Os-gtl-3，UTR融合的玉蜀黍油质蛋白启动子的4532bpDNA片段。pMON78808DNA的DNA也用Xhol限制酶进行切割，使用碱性磷酸酶(NewEnglandBioLabsInc.，Beverly,MA)进行去磷酸化，并且使用QIAGENPCR纯化试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)进行纯化。连4妾反应通过1吏去石寿酸化的Xhol-切割的pMON78808D—NA和pMON68064的4532bpbpDNA片段混合来进行，以产生pMON68066。使用类似克隆策略将质粒pMON69769用作基本载体以产生各种其他转化载体，包括pMON82561(图7)、pMON78152(图8)、pMON78153(图9)、pMON82560(图10)、pMO腸779(图11)、pMON78846、pMON78850、pMON78851、pMON68065、pMON69781、pMON94548、pMON94549、pMON97701、pMON97703和pMON97705。玉蜀黍的转化基本上如美国专利申请公开20050005327中所述将上文描述的转化载体转化到玉蜀黍内，所述专利申请整体引入本文作为参考。简言之，在授粉后约10天收获包含未成熟的胚的谷穗且于4。C保持冷冻直至使用(最多至收获后5天)。关于这种转化方法的优选胚大小是1.5-2.0mm。这个大小通常在授粉后10天在温室内达到，其中生长条件为平均温度87°F、日长14小时伴随由GE1000瓦高压钠灯提供的补充照明。从表面灭菌的谷穗分离未成熟的胚且直接投入在1.5-mL微量离心机管中制备的土壤杆菌属细胞悬浮液中。分离连续持续约5-60分钟。可替代地，将胚直接切到接种培养基(不含土壤杆菌属或乙酰丁香酮)内进行5-60分钟，且随后用土壤杆菌属细胞悬浮液接种5-30分钟。使用精细包尖头(tipped)的无菌转移移液管取出土壤杆菌属细胞悬浮液后，将未成熟的胚转移到crn398共培养培养基上(表6)。随后将胚置于培养基上，其中小盾片侧朝上。胚在暗培养箱(23°C)中培养约14-48小时。随后将胚转移到愈伤组织诱导培养基(crn336,表6)上，所述愈伤组织诱导培养基包含O.lmM草甘膦和500mg/L羧千青霉素，以抑制培养亚(100mmx25mm)中的土i裒杆菌属。培养物在暗培养室/培养箱中于30。C温育2周，随后在暗培养室/培养箱中于27。C再温育l周。随后将所有愈伤组织碎片个别转移到第一种再生培养基(crn335,表6)上，所述第一种再生培养基包含O.lmM草甘膦和250mg/L羧节青霉素。培养物在这种培养基上在具有16小时光/8小时暗光周期的27°。培养室中生长7-10天。随后将它们转移到培养皿(100mmx25mm)中的第二种再生培养基(crn333,表6)上，于27。C伴随16小时光约2-3周。然后将具有再生枝条和活组织的所有愈伤组织碎片转移到新鲜的crn333板或crn334PHYTATRAYs(表6)上或直接转移至包含生根培养基(crn366,表6)的圣代(sundae)杯，以在转移至土壤之前进一步生长(约l-3周)。再生培养基(crn335、cra333和crn334)都包含250mg/L羧节青霉素和0.1mM草甘膦。然后将小植抹转移至土壤，在生长室中在27。C、80%湿度和低光强度下使其茁壮(hardenoff)约l-2周，然后转移至温室且在标准温室条件下生长。收集所得到的仁且如下所述进行分析。表6.在玉米转化中使用的培养基的组成(每升)。组分共培养培养基(crn398)愈伤组织诱导培养基—336)第一种再生培养基(crn335)第二种再生培养基(crn333(板)/crn334(PHYTATRAYs))生根培养基(crn366)MS盐2.17g4.33g4.33g4.33g2.17g蔗糖20g30g30g20g麦芽糖20g葡萄糖10g10g1-脯氨酸U5mg1.38g1.38g酪蛋白氨基酸0.5g0.05gIBAnme/mL原液)0.75mL1-天冬酰胺0.15g肌醇0.1gNAA(1mg/mL原液)0.5mL硫胺素-HCl(0.5mg/mlv原液)1.0mL1.0mL2，4-D(1mg/mL原液)3.0mL0.5mL硝酸银(2mg/mL原液)1.7mL1.7mLMS维生素100X10mL10mL5.0mLMSFromm1000X1.0mL1.0mL羧苄青霉素(250mg/mL)2.0mL1.0mL1.0mL草甘膦(0.5M原液)0.2mL0.2m.L0.2mL0.2mLPhytagel10g3.0gBAP(0.5mg/mL原液)0.02raL7.0toL乙酰丁香嗣(l.OM)0.2mL琼脂糖低EEO"g实施例6用于玉蜀黍仁中的AS的免疫定位和色氨酸的定量的方法48这个实施例描述了在来自用实施例5中描述的CTP构建体转化的玉蜀黍事件的仁中的免疫定位研究和游离色氨酸水平的定量中使用的分析程序。在26DAP时分开收获来自具有不同构建体的F1阶段转基因植物的仁。这些构建体包括pMON69755(图6)、pMON69779(图11)、pMON82560(图IO)、pMON82561(图7)、pMON78153(图9)和pMON78152(图8)。从这些构建体的每个转基因系中分离8-10个胚，在3.7%曱搭溶液中固定，且在通过下文描述的免疫标记研究就表达蛋白质的定位进行分析前贮存于4匸。还使用DNeasyTM植物试剂盒(目录号69104,Qiagen，Waltham,MA)从这些转基因仁的胚乳提取基因组DNA。使用在序列表中分别命名为SEQIDNO:226和SEQIDNO:227的寡核苷酸引物玉蜀黍AS2陽5'和玉蜀黍AS2-3'进行PCR扩增以鉴定阳性和阴性仁。上文描述的玉米胚在500nl0.05。/。TritonX-100中温育30分钟。使用配备蓝宝石(sapphire)刀的LeicaVT1000S振动刀片切片机将小盾片组织切片切片成20nm厚的切片，然后在包含10mM甘氨酸的PBS緩冲液(137mMNaCl、3mMKC1、8mMNa2HP04和1.5mMKH2P04)中洗涤3次，每次洗涂10分钟。组织切片随后在酶促緩沖液(4%果胶酶、2%纤维素酶)中于28°。温育40分钟。组织然后用未稀释的血清封闭15分钟，使用山羊血清(Sigma目录号G-9023;SigmaChemicalCompany,St.Louis，MO)用于AgroAS检测和兔血清(SigmaR-9133)用于玉蜀黍AS。组织切片然后在溶于PBS緩沖液的1%兔抗hisAgroAS或山羊抗玉蜀黍AS中于4°C伴随轻轻摇动温育过夜。过夜温育后，组织在包含1OmM甘氨酸的PBS緩沖液中洗涤20分钟，且在分别的未稀释血清中在室温下再次温育15分钟。组织然后在黑暗中与Alexa缀合物第二抗体在室温下温育2小时。稀释因子对于用于AgroAS蛋白质的AlexaFluor532(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR)山羊抗兔缀合物第二体抗为1:1000,和对于用于ZmAS蛋白质的AlexaFluor488(MolecularProbes,Inc.)兔抗山羊为1:1000。温育后，组织在包含10mM甘氨酸的PBS中洗涤3次，每次洗涤10分钟。组织然后用对于细胞壁(Sigma)溶液(在原液中2.5mg/ml，用蒸馏水1:50稀释)的卡尔科弗49卢尔(calcofluor)和对于核的Hoechst染料(MolecularProbesInc.)在黑暗中伴随摇动复染15分钟。染色的组织随后在封固前在蒸馏水中洗涤IO分钟。结果指出当样品用具有合并通道的AgroAS(在543nm处的红色荧光)和对照ZmAS抗体(在488nm处的绿色荧光)进行探测时，黄色的出现暗示蛋白质在质体中的共定位(数据未显示)。为了提取氨基酸级分，将30mg磨碎的仁置于离心机小瓶中。向每种样品中加入1毫升5%三氯乙酸。样品通过涡旋进行混合，且置于4。C过夜。样品然后再次混合且在微量离心机中在14,000rpm下旋转15分钟。随后取出一些上清液，置于HPLC小瓶中且密封。样品在分析前保存于4°C。^口Agilent才支术出片反物,"AminoAcidAnalysisUsingZorbaxEclipse-AAAColumnsandtheAgilent1100HPLC",2000年3月17日中所述进行氨基酸分析。该分析用邻苯二甲醛(o-pthaldialdehyde)(OPA)预衍生氨基酸，然后通过反相层析分离OPA缀合物。分离使用Agilent1100系列HPLC系统(Agilent,PaloAlto，CA)来进行，其使用EclipseXDB-C185|iim、4.6x150mm柱和1.2ml/分钟的流速。氨基酸浓度使用焚光进行测量在340nm处激发、在450nm处发射。洗脱用根据表7的HPLC緩冲液A和B的梯度，其中HPLC緩冲液A是40mMNa2HP04,pH7.8且HPLC緩沖液B是9:9:2::曱醇乙腈水。表7:氨基酸洗脱<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>制备或购买浓度范围为O-IOOpg/ml的氨基酸标准。脯氨酸分析需要使用9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)的另外衍生步骤。如表8中所示的结果以ppm报告。实施例7玉蜀黍中的游离色氨酸水平的分析这个实施例阐述了用实施例5中描述的表达载体转化的玉蜀黍植物中的游离色氨酸水平的分析。Fl仁如实施例6中所述就游离色氨酸进行分析。下表8中所示的来自一些转化的植物的结果指出在瞬时表达测定中证实成功使GFP靶向的能力(表5中所示的数据)的CTPs在转化的植物中具有更高水平的游离色氨酸。此外，未证实使GFP定位在质体中的能力的CTPs具有较低水平的游离色氨酸。这些结果指出并非所有CTPs都可以指导单体AS定位至质体且因此增加游离色氨酸水平。表8.F3纯合转基因玉蜀黍植物中的平均游离色氨酸水平。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>构建体栽体描述事件ID色氨酸的平均值ppm色氨酸的StdDevppmZMS9967924216ZMS9978731922PMON69768Zm-ASA2-CTP+18:S51FZMS10403722718ZMSI0403812911ZMSI0405217418ZMSI0509125830ZMS10510525453PMON69770Zm-ASA2-CTP+18:S51CZMS102618677174ZMS10263764984ZMS103233585190ZMS103234612197ZMSI03245632160ZMSI03257667106ZMS103261430106ZMS103277684251PMON69779ZM-DHDPS-CTP+20:F298WZMSI1529715016ZMSI1530912932ZMS11531312330ZMS11531414815ZMSI1634614512PMON67146Zm-DHDPS-CTP+3:F298WZMS671924947ZMS672014149ZMS672095148PMON78152Rg长-CTP:F298WZMSI116326812ZMSI127525313ZMSI127776922ZMSI130868936ZMSI1309628043PMON78153Rg短-CTP:F298WZMS11391132614ZMS11392725899ZMSI1394628054ZMS11395324147ZMSI1410527179PMON82560At-CTP2(E/K)+1:F298WZMSI1500935393ZMSI1502734024ZMSI1502939325ZMSI15066358113ZMSI1507036191PMON82561At-CTP2(E/K)+10:F298WZMSI1302615637ZMSI1302919227ZMSl訓314750ZMS11319414540ZMS11383316924PMON66559CTP1:F298WZMS44537102ZMS4453881ZMS44540113ZMS4454280ZMS4682092ZMS468289252<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>实施例8膳食和饲料产物的产生膳食和飼^产物的方法。'々、、''本发明的任何ii物或其部分可以进行加工以产生祠料、膳食、蛋白质或油制剂，包括在总色氨酸含量中高的饲料、膳食、蛋白质和油制剂。用于这个目的的特别优选的植物部分是种子。在优选实施方案中，饲料、膳食、蛋白质或油制剂被设计用于牲畜动物或人或两者。产生饲料、膳食、蛋白质和油制剂的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号4,957,748;5,100,679;5,219,596;5,936,069;6,005,076;6,146，669;和6,156,227。在优选实施方案中，饲料、膳食、蛋白质或油制剂是高色氨酸制剂。此种高色氨酸制剂优选具有超过约200-400ppm、更优选400-600ppm且甚至更优选600-800ppm的色氨酸含量。实施例9用于检测CTP::AS转基因的方法这阐述了可以用于检测在转基因植物细胞、或者衍生自此种转基因植物细胞的祠料或膳食产物中属于包含本文描述的任何CTP::AS序列组合的构建体的独特序列的存在的方法。CTP::ASDNA的PCR扩增来自转基因植物细胞、或者来自衍生自此种转基因植物细胞的祠料或膳食产物的基因组DNA可以根据制造商的规程使用QIAGENDNeasyPlantmini试剂盒(目录#69104;QIAGENInc.)进行提取。PCR反应混合物一般可以包括约100mg提取的基因组DNA、1XPCR反应緩沖液(ExpandHighFidelityPCRSystem,目录#1732641;RocheInc.,Nutley,NJ)、0.2mMdNTP、5皮摩尔每种引物、3.5单位高保真度Taq聚合酶和水至50pl的终体积。例如，SEQIDNO:228和SEQIDNO:229;或SEQIDNO:230和SEQIDNO:231的引物对可以用于扩增提取的DNA,以产生对于来自植物细胞的Zm-ASA2十18-CTP::AgroAS构建体的DNA诊断性的扩增子，所述植物细胞已用pMON68066进行转化。对反应混合物实施各种温度循环，其可以包括于95。C变性、于6(TC退火和于72。C延伸，进行35个循环。在35个PCR循环后，约10pl的反应混合物在1.0%琼脂糖凝胶上分离。2649碱基对片段(具有引物对SEQIDNO:228和SEQIDNO:229)或2735碱基对片段(具有引物对SEQIDNO:230和SEQIDNO:231)的存在指出植物细胞、饲料或膳食产物包含与AS等位基因融合的Zm-ASA2+18-CTP。识别且设计另外的PCR引物对完全在本领域普通技术人员的方法内，所述另外的引物对在检测属于包含本文描述的任何其他CTP::AS序列组合的构建体的独特序列中将是有用的。如由上文公开内容指导的，无需过度实验即可制备且使用本文公开和要求保护的所有材料和方法。尽管本发明的材料和方法已就优选实施方案和举例说明性实施例而言进行描述，但对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文描述的材料和方法应用变化。对于本领域技术人员显而易见的所有此种类似置换和修饰被视为在如附加权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。参考文献下述参考文献特别？1入本文作为参考，其程度至它们提供补充本文阐述的那些的示例性程序或其他细节。美国专利、申请和申请公开美国申请09/757,089;美国申请10/138,927;美国申请10/430,011;美国申请10/732,721;美国申请11/503,532;美国专利4,957,748;美国专利4,957,748;美国专利5,100,679;美国专利5,100,679;美国专利5,188，642;美国专利5,219,596;美国专利5,219,596;美国专利5,290,924;美国专利5,322,783;美国专利5,322,938;美国专利5,322,938;美国专利5,352,605;美国专利5,359,142;美国专利5,378,619;美国专利5,378,619;美国专利5，424,412;美国专利5,530,196;美国专利5,538，880;美国专利5,550,318;美国专利5,563,055;美国专利5,610,042;美国专利5,641,876;美国专利5,728,925;美国专利5,837,848;美国专利5,858，741;美国专利5,936,069;美国专利5,936,069;美国专利6,005,076;美国专利6,005,076;美国专利6,118,047;美国专利6,140,078;美国专利6,146,669;美国专利6,146,669;美国专利6,156,227;美国专利6,156,227;美国专利6，175，060;美国专利6,177,611;美国专利6,232，526;美国专利6,252,138;美国专利6，294,714;美国专利6,426,446;美国专利6,429,357;美国专利6,429,362;美国专利6,433,252;美国专利6,437,217;美国专利6,635,806;美国专利号5,641,876;美国专利7,151,204;美国专利号7,217,865;美国公开20030097677;美国公开20030213010;美国公开20050005327Archer"a/"■/飾e鮮g.飾附e城22:789-810,1990.BelangerandKriz,Ge""/cs129:863-872,1991.Camse/a/.，Ge"^Dev.,1:1183-1200,1987.Chu,In:/Voceed/'"g^o/xS)tw/os,'wwow尸/a"/77^5wweCw//wre,SciencePress,Beijing,China,43-50,1978.DittaWa/.,Ptoc.Ato.爿cadOSL4，77:7347-7351,1980.EPAO120515FraleyWa/.,户roc.Ato/.爿cad80:4803-4807,1983.GallieeM/.,77^P/""/Ce〃，1:301-311,1989.Joshi,M/c/e/Uc/c&i^s.,15:6643-6653,1987.JouaninWa/.,M。/.G饥G麼/"201:370-374,985.Lopes"a/.,Mo/GenG冊A,247:603-613，1995.McBrideandSummerfeit,P/a"Zikfo/.W/o/.,14:269-276,1990.McEJroyWa/.,M>/.Ge".G潔/.,231(1):150-160，1991.Odell,Wa/.JVa加re，313:810-812,1985.PCTAppln.WO0011200A2PCTAppln.WO95/06128Schnelle/a/.，J说o/.CAew.,266(5):3335-3342,1991.Sheen,EMBOJ.，12:3497—3505,1993.Silva-Filho尸/a"/iWo/.历o/.，30:769-780,1996.Silva-Filho"a/.,尸/a",AZo/.5/o/.，30:769-780,1996.TingeyWfl/.,EMBO人6:1-9,1987.VasilWa/.,P/aW尸/;^0/.，91:1575-1579，1989.Withers-Martineze/."/.,/Vo/e/"五"g,'"ee〃."g,12:1113-1120,1999.权利要求1.一种包含编码与单体邻氨基苯甲酸合酶融合的叶绿体转运肽的多核苷酸分子的表达载体，其中a)所述叶绿体转运肽包含SEQIDNO21、22、28、32、33或36的多肽序列；或b)编码所述叶绿体转运肽的多核苷酸分子包含SEQIDNO2、3、9、13、14或17；其中所述叶绿体转运肽提供当与所述邻氨基苯甲酸合酶经由CTP1的靶向相比较时，所述单体邻氨基苯甲酸合酶对于植物细胞的叶绿体增强的靶向，并且其中当与具有相同基因型但缺乏所述多核苷酸分子的植物细胞相比较时，所述多核苷酸分子提供至少一种氨基酸在包含所述多核苷酸分子的转基因植物细胞中增强的水平。2.权利要求1的表达载体，其中所述单体邻氨基苯甲酸合酶对于色氨酸是反馈不敏感的。3.权利要求2的表达载体，其中所述单体邻氨基苯甲酸合酶包含选自SEQIDNOs:200、202、204、206、208、210和212的多肽序列。4.权利要求l的表达载体，其定义为包含SEQIDNO:213或SEQIDNO:214的核酸序列。5.权利要求2的表达载体，其进一步包含与所迷多核苷酸可操作地连接的在植物中起作用的启动子，所述多核普酸编码与单体邻氨基苯曱酸合酶融合的叶绿体转运肽。6.权利要求5的表达载体，其中所述启动子是组成型、诱导型、种子特异性或组织优选的启动子。7.权利要求5的表达载体，其中编码叶绿体转运肽的所述多核苷酸包含SEQIDNO:9，并且编码单体邻氨基苯曱酸合酶的所述多核苷酸包含SEQIDNO:207。8.—种转基因细胞，其用权利要求1的表达载体转化。9.权利要求8的转基因细胞，其定义为植物细胞。10.权利要求9的转基因植物细胞，其定义为单子叶植物细胞。11.权利要求9的转基因植物细胞，其定义为双子叶植物细胞。12.权利要求9的转基因植物细胞，其中所述单体邻氨基苯甲酸合酶包含选自SEQIDNOs:200、202、204、206、208、210和212的多肽序列。13.权利要求9的转基因植物细胞，其进一步包含与所述多核苷酸分子可操作地连接的启动子，所述多核苷酸分子编码与单体邻氨基苯曱酸合酶融合的叶绿体转运肽。14.权利要求9的转基因植物细胞，其中所述启动子选自组成型、诱导型、种子特异性或组织优选的启动子。15.权利要求9的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是玉蜀黍细胞。16.权利要求9的转基因植物细胞，其中编码叶绿体转运肽的所述多核苷酸包含SEQIDNO:9,并且编码单体邻氨基苯曱酸合酶的所述多核苷酸包含SEQIDNO:207。17.—种增加单子叶植物的种子中的游离色氨酸水平的方法，其包括在植物细胞中表达权利要求1的表达载体，其中所述叶绿体转运肽能够使所述单体邻氨基苯曱酸合酶区室化至所述植物细胞中的质体。18.—种转基因植物，其用权利要求1的表达载体转化。19.权利要求18的植物的种子，其中所述种子包含所述表达载体。20.—种产生营养上增强的玉米饲料产物的方法，其包括将权利要求19的种子加工成膳食、蛋白质或油。21.—种饲料产物，其通过权利要求20的方法产生。22.权利要求21的饲料产物，其包含编码选自SEQIDNOs:21、22、28、32、33、36的多肽序列的多核苦酸分子。23.权利要求21的饲料产物，其定义为包含当在DNA扩增法中测试时，产生对于权利要求1的表达载体诊断性的扩增子的核酸。全文摘要提供了编码与单体邻氨基苯甲酸合酶可操作地连接的叶绿体转运肽(CTP)的新表达载体和构建体。此外，提供了编码单体邻氨基苯甲酸合酶的新多核苷酸序列。还提供的是用于增加包含表达载体和构建体的转基因植物中的游离色氨酸水平的方法。文档编号C12N15/82GK101522902SQ200780037918公开日2009年9月2日申请日期2007年8月9日优先权日2006年8月11日发明者G·叶,J·L·温森,M·J·瓦拉戈纳,S·X·纳瓦罗,S·曼朱纳斯,W·D·拉普,X·施申请人:孟山都技术有限公司