在具有恒定pCO₂含量的培养基中制备重组蛋白质的方法

专利名称：在具有恒定pCO₂含量的培养基中制备重组蛋白质的方法
在具有恒定PCO2含量的培养基中制备重组蛋白质的方法本发明涉及在柠檬酸循环经修饰的真核宿主细胞中重组制备多肽的方法，其中所 述细胞在具有维持在10%至20%范围内的恒定值的溶解CO2(PCO2)含量的培养基中培养。用于特定疗法的治疗蛋白质的吨级规模制备对表达和制备系统提出了新要求。在 目前使用的主要表达系统中，值得一提的是动物细胞培养系统。动物细胞正确折叠和翻译 后修饰蛋白质的能力对人的临床应用是首要的。目前，制药工业中全部重组蛋白质的几乎 70%是在动物细胞中制备的，大多数在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中(Wurm，2004)制 备。然而与微生物系统相比，动物细胞培养过程的特征是较长的传代时间和发酵中较低的 最终细胞密度。因此，产物滴度和空间时间产量(space-time yield)低于微生物培养过 程。补偿这一缺点的一种可能性是代谢改造工程，即通过对生产细胞的遗传修饰，控制细胞 生长和最小化凋亡、程序性细胞死亡。除了遗传手段之外，已证明培养控制策略为合适的优 化手段，其潜力往往被低估。例如，通过使用过程(process)监控和控制策略以及培养基组 成，有可能有效影响糖基化、碳代谢、细胞生长和细胞死亡。因此，过程改进的目的不仅在于代谢优化的细胞系的改进，而且在于对现存细胞 系的最优培养基条件和最优过程控制潜力的最大化利用。在易于控制的过程参数例如氧 气含量和温度以外，还考虑了更为复杂的影响因素例如溶解二氧化碳的含量以用于过程 控制。在动物细胞培养过程中，CO2作为终产物以物理上溶解的形式积聚，并在水性培养 基中化学解离为碳酸氢盐。目前，针对高细胞密度过程进行研发，该过程使用动物细胞的 补料分批过程和工业上使用的大容量发酵罐及其中广泛应用的流体静力压，此研发取得 150-200mmHg的CO2分压，是细胞CO2分压生理值31_54mmHg的5倍高。例如，对使用重组CHO 细胞进行的多肽(细胞因子)制备，所述细胞培养于37°C和5%C02(36mmHg pC02)以表达重 组细胞因子(US6406888B1)。Fogolin 等人，Journal of Biotechnology, 2004，109，179-191 显示，遗传修饰的CHO-K 1-hGM-CSF细胞系在37°C和5% CO2中表达重组酵母丙酮酸羧化酶 (PYC2)。此研究结果揭示，PYC2的表达和降低的培养温度对遗传修饰的CH0-Kl-hGM-CSF 细胞系的细胞特异生产率具有加性效应(additive effect)。此外，Kimura和Miller, Biotechnology andBioengineering, 1996,52，152—160 研究了在重组 CHO 细胞系中，升高 的PCO2和渗透性对生长率和特异性人tPA生产率的影响。在此研究中实验用的培养基包 含36mmHg pC02 (5% CO2)、140、195和250mmHg pC02。不管怎样，这些作者认为最高的重组蛋 白质生产率产生于37°C和36mmHgpC02(5% CO2)。以前已有报导，这样高的pC02浓度对杂交 瘤细胞、NS0、CH0、BHK和昆虫细胞的生长和生产率具有不利影响。在工业大规模发酵罐中， CO2的积聚是限制性因素。从培养基中释出溶解的CO2是对过程改造的一项挑战。因此，必 须提供培养细胞的氧气供给。用于增强氧气转移至液相的校正变量有，例如搅拌器速度和 体积气体流量。然而，因为破坏细胞的部分剪应力和发泡，这些不能被随意修改。因此，本发明的根本技术问题是提供一种克服上述缺点的用于在真核宿主细胞中 重组制备蛋白质的优化方法，即所述方法自始至终提供了培养基中物理性溶解CO2的最优 含量。此技术问题的解决方案由专利权利要求书所描述的实施方案提供。本发明的策略是基于控制反应器中的PCO2设定值的方法，同时控制溶解的氧气、PH值和超压。此合理方 法对尽可能多的参数(其与PCO2相关的难题相关联)进行分离(decouple)控制，导致下 述惊人发现当PCO2值在10%至20%溶解CO2范围内维持恒定时，重组制备蛋白质的产量 出人预料的增加了。此外，在发酵整个过程中对PCO2浓度的控制对培养物生存力具有积极 作用，并使高细胞密度稳定期延长。当应用于动物细胞培养时，本发明策略得到的结果分别 总结如下(a) pC02 控制基于原位灭菌PCO2探针，已开发了可满足工业需要并已在改进的发酵中成功实施 的PCO2控制器。通过对p02和pH的同步独立控制，此pC02控制器允许pC02静态培养和 PCO2设定值谱的产生。以补料分批模式和恒化器模式进行的应用已在IL和IOL规模上成 功建立。控制范围为1. 5-25. 0% pC02。因此，有可能解决小规模工业中的CO2参数问题。(b)超压控制已开发了用于IL(高达150毫巴超压)和IOL(高达1000巴超压)规模的超压 阀门，其可独立于pC02、p02*pH的控制使用。因此，工业生物过程中的规模传送(scale transmission)问题(流体静力压、混合时间)可用小规模代表。(C)PH 调节剂可以显示，使用Na2CO3进行碱性pH调节在CHO培养中导致存活细胞密度的提高、 存活培养期的延长和因此而致的单克隆抗体融合蛋白的空间时间产量的提高。(d)压力控制采样压力控制采样系统允许在生物反应器条件(温度、超压和PCO2)下处理发酵样品。 这是首次可以在生物过程条件下研究细胞内过程(例如细胞内PH)。(e)pC02对CHO细胞内pH值的影响开发的pC02控制器和压力控制采样首次允许观察与培养基中PCO2值变化相关的 细胞内PH值的双相反应。由于水溶液中CO2的解离平衡，作为直接影响的“化学效应”引 起了细胞内PH值的暂时性变化(PCO2增多时胞浆酸化，pC02中和时胞浆碱化)。与此影响 相反，在细胞中还存在长期和永久的反应，即“生理效应”。首次有可能在体外和原位(恒化 器)通过由“化学效应”导致的细胞内PH偏离观察此超补偿。PCO2梯度越高，细胞内pH变 化越大。(f)来自重组CHO细胞系pC02受控的生物过程的发现·静态pC02设定值控制提高了过程稳健性。·在生物过程条件下，PCO2设定值谱可与细胞生理学研究组合用于生物过程的合 理开发。· pC02水平与细胞内pH值直接相关。·细胞内pH值与细胞周期阶段分布相关。·细胞外pH值和细胞内pH值梯度的增加促进乳酸的形成和外运。·除了培养基pH控制以外，在pH固定的生物过程中的pC02控制可通过细胞内pH 值影响乳酸形成，甚至在葡萄糖受限的过程条件下亦可。·表达胞质丙酮酸羧化酶的重组细胞系CH0-hGM-CSF_PYC2展示了 pC02敏感的能 量代谢。通过提高受控的静态PCO2水平，可能通过培养过程中细胞内pH值的提高增强氧化代谢。另外，在静态受控PCO2水平的提高下，观察到延长的存活培养期、细胞周期在Gl GO 期的有效维持、提高的细胞特异性生产率和100%的空间时间产量的提高。 在静态受控PCO2生物过程中，必须将延长的培养期主要归功于提高的pC02水平， 而不是重量摩尔渗透压浓度。·受控pC02水平的最优过程值为15% pC02。.pC02的控制和其导致的生物过程水性培养基中对CO2积聚的抑制允许也在 HCO3-缓冲的培养基中通过废气分析进行细胞培养过程的呼吸商RQ的可信联机测定，。附图描述

图1 开发的级联pC02控制器的图解控制环路。低于PCO2 PID 1设定值时控制以比率模式安装的CO2-MFC (O-SL-tT1)的开放宽 度直至达到设定值。超出PCO2 PID 1设定值时一开始关闭CO2-MFC,并在连续的设定值 正偏离后通过PID 2打开另外的N2-MFC (O-lSL-tT1)(控制器级联)。图2 通过比率充气控制的溶解PO2和pC02的气体浓度，通过提高充气比率最大化 CO2排放，在IOL搅拌槽反应器中进行50毫巴超压，0. 15M NaCl，37°C，200rpm，未控制pH。图3 通过比率充气控制的的溶解PO2和pC02的气体浓度，通过提高充气比率最大 化CO2排放，在IOL搅拌槽反应器中进行，750毫巴超压0. 15M NaCl，37°C，200rpm，未控制 pH。图4 在Biostat ES中应用的受控超压系统的过程图解图5 溶解二氧化碳PCO2 (连续线)和超压ρ (间断线)的控制因子浓度的动态设 定值控制，在IOL搅拌槽反应器中进行(Biostat ES, B. Braun International ；工业制备培养基，标准发酵参数)，通过改 进的PID控制器使用过程控制软件LabView进行。图6 用IM NaOH将pH控制为ρΗ7· 2的滴定谱，设定值从5% pC02增至15% pC02。Biostat ES,比率充气SOL-h—1，IOL工作体积，与工业制备培养基类似的NaHCO3/ NaH2P04/Na2HP04水性缓冲溶液，37 °C，750毫巴超压。图7 用IM Na2CCMfpH控制为pH7. 2的滴定谱，设定值从5% pC02增至15% pC02。Biostat ES,比率充气SOL-h—1，10L工作体积，与工业制备培养基类似的NaHCO3/ NaH2P04/Na2HP04水性缓冲溶液，37 °C，750毫巴超压图8 用于pH控制的IM碱的累积引入(entry)，设定值从5% pC02增至15% pC02。Biostat ES,比率充气SOL-h—1，10L工作体积，与工业制备培养基类似的NaHCO3/ NaH2P04/Na2HP04水性缓冲溶液，37 °C，750毫巴超压。图9 补料分批发酵，在充气混合物中具有恒定5% (ν/ν)的CO2，分别使用pH调节 剂 NaOH 和 Na2CO3。存活细胞密度ZDL，存活率VIA，产物滴度PR0(1L，CH0-MUC1，150毫巴超压，pH 7. 2，200rpm，膜充气)图10 补料分批发酵，在充气混合物中具有可变的CO2比率，分别使用PH调节剂 NaOH 和 Na2CO3。存活细胞密度ZDL，存活率VIA，产物滴度PR0(1L，CH0-MUC1，150毫巴超压，pH 7. 2，200rpm，膜充气；也参见图11)。
图11 =CHO-MUCl细胞系的补料分批培养中的葡萄糖和乳酸浓度，在充气混合物中 具有PH依赖的可变的CO2比率1L, CHO-MUCl, 150m 巴超压，pH 7. 2，200rpm，膜充气；也参见图 10图12 补料分批发酵的重量摩尔渗透压浓度OSM和存活细胞密度ZDL1L， CHO-MUCl, 150 毫巴超压，pH 7. 2，200rpm，膜充气图13 表征Biostat ES中不同采样方法的组合参数(10 □开、关贮存反应管完 全装满培养基(50ml，Falcon)；开发的采样仪器气密、关闭的注射器，无超压，完全装满培养基。图14 =Biostat ES中大气压下不同采样类型的COgJoss (0. 15M NaCl, 630毫巴超 压)，原位和脱机CO2测量YSI和AVL Compact3 ；反应管(50ml，Falcon)，完全装满培养基。图15 不同超压下的原位CO2平衡浓度(Biostat ES) (A)，样品中的时间依赖性CO2 浓度，样品通过气密注射器收集并贮存，无超压(B)O. 15M NaCl，37°C，否则在搅拌槽中为标 准发酵条件图16 =Biostat ES压力控制采样单元的照片，关于文中描述的部件图17 压力控制采样装置的透明支架元件(1)开发了用于不同样品体积的3种不 同注射器(2-4)和用于将注射器精确插入支架的紧固套(adapter sleeve) (5)。样品体积 可通过将后面的止动板(stop plate) (6)放置到位进行预选择。图18 开发的安装注射器的压力维持采样装置支架元件的俯视图。图19 =CHO-MUCl细胞系在750毫巴超压下发酵结束后，包含细胞的制备培养基中 的原位CO2浓度(原位YSI 脱机AVL Compact 3)的比较。样品贮存在37°C，在测量期间未搅动；反应管(50ml，Falcon)完全装满培养基。图20 用荧光染料SNARF-I分别无压孵育25min(A，B)和50min(C)后的流式细胞 PK测量；荧光(FL2，FL3)及其各自的强度比(比率)解释见文中。图21 在开发的压力受控的采样装置中与荧光染料SNARF-I等压孵育25min后的 流式细胞PH测量⑶，以及在等压贮存(25min)、随后与荧光染料SNARF-I无压孵育25min 后的流式细胞PH测量(E)；焚光(FL2，FL3)及其各自的强度比(比率)解释见文中。图22 培养基中不同PCO2消耗对培养基中培养的CH0-MUC1细胞系的暂时性细胞 内碱化作用。通过在不同孵育时间将SNARF-I染色的细胞悬浮物在体外充入空气进行pC02 消耗。在用流式细胞术评估细胞内PH前，所有样品孵育的总持续时间与通过充入空气进行 中和的持续时间是一样的。图23 培养基中溶解的CO2的消耗对其中培养的CH0-MUC1细胞系的初始细胞内碱 化作用(< 5min)和随后由生理效应(< 40min)引起的胞质酸化。通过在不同孵育期将 SNARF-I染色的细胞悬浮物在体外充入空气进行CO2消耗。在用流式细胞术评估细胞内pH 前，所有样品孵育的总持续时间与通过充入空气进行中和的持续时间是一样的。图24 不同pC02起始浓度(5%、7%和10% )的双相PHi曲线。培养基中溶解的 CO2消耗对CH0-MUC1细胞系的初始细胞内碱化作用(化学效应)和随后由于低于初始pH 的生理效用对碱化的超补偿，通过在不同孵育期将SNARF-I染色的细胞悬浮物在体外充入
6空气进行CO2消耗。在用流式细胞术评估细胞内PH前，所有样品孵育的总持续时间与通过 充入空气进行中和的持续时间是一样的。图25 连续 pC02 受控过程(1. 0L. D = 0. 8d = 1. pH 7. 0.调节剂 Na2CO3IM)，分别使 用从2. 5%增至5. 0%和从5. 0%增至10%的PCO20图26 :pC02分别为5%、15%、25%和5-15%的存活细胞数ZDL和存活率VIA。CHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图27 不同pC02设定值控制过程中的细胞周期分布的GOGl期部分CH0-MUC1，IOL 补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图28 细胞周期GOGl期部分的转折点，对应的pC02值和工业pC02谱的细胞内PHi
值5% -15% pC02, CHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图29 =GOGl期部分和细胞内pH值ρΗ ;25% pC02CHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图30 不同pC02设定值谱的谷氨酰胺消耗特异速率qGLNCHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图31 谷氨酸GLT/谷氨酰胺GLN相关的特异产率系数CHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图32 不同pC02设定值谱的细胞特异性乳酸形成率gLACCHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图33 不同pC02设定值谱的乳酸形成LACCHO-MUCl, IOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图 34 产物滴度 I3RO MUCl-IgGIOL补料分批，750毫巴超压，标准发酵条件。图35 葡萄糖受限的CHO-MUCl细胞系恒化器过程(IL)细胞特异性乳酸形成qLAC分别被pH控制和pC02设定值提高所提高，特异生长率 μ，流速D图36 葡萄糖受限的CHO-MUCl细胞系恒化器过程(IL)分别为葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺浓度曲线(GLC、LAC和GLN)。图37 (a)经丙酮酸至乳酸的底物葡萄糖的传统代谢途径；(b)使丙酮酸和碳水化 合物转化为草酰乙酸，并通过胞质丙酮酸羧化酶PYC2将随后的苹果酸转移至三羧酸循环 (TCA)；根据 Irani (1999)修改图38 :CH0-hGM-CSF-PYC2细胞系的补料分批培养存活细胞密度(实心符号)和 PCO2浓度(空心符号)曲线，PCO2分别被调节至5%和15%，和/或不调节PCO2图39 :CH0-hGM-CSF-PYC2细胞系的IL补料分批中，存活细胞密度ZDL和存活率 VIA,分别在未控制和5%和15%受控pC02浓度下pC02受控使生产期延长，并具有高存活 率细胞图40 重量摩尔渗透压浓度OSM和累计碱液引入(1M Na2CO3)，分别在未控制pC02、 5%和 15%受控 PCO2T与PCO2受控过程相比，未控制pC02的指数生长期具有更多的碱液引入；所有过程
7中的渗透性曲线类似。图41 单独生物过程中的乳酸浓度LAC。pC02受控避免了快速和高水平乳酸形成图42 细胞特异性乳酸形成率gLAC在未控制pC02 (彡180h)和5%受控pC02 (彡220h)时可观察到乳酸代谢，在15% 受控PCO2时未观察到乳酸代谢。图43 在不同pC02过程条件下，重组生长因子hGM-CSF的细胞特异性产物形成率 SPR与pC02受控过程相比，未控制pC02的过程中的活性相反在未控制PCO2时，进入 稳定生长期后SPR降低；相反的，在将PCO2分别控制在5%和15%时，进入稳定生长期后 SI3R大大提高。图44:在相关pC02谱下发酵结束后(培养物存活率为80%)产生的生长因子 hGM-CSF的绝对终浓度图45 :pC02未受控的CH0-hGM-CSF_PYC2细胞系补料分批培养过程中的细胞周期 分布比率S/ (GOGl)，细胞特异性产物形成率Sra和细胞内PH值PH进料开始后pH降低约0. 3，在进入生长期后pH升高。图46 受控pC02的CH0-hGM-CSF_PYC2细胞系补料分批培养过程中的细胞周期 分布比率S/ (GOGl)，细胞特异性产物形成率Sra和细胞内PH值pH进料开始后PH降低约0. 4，在进入稳定生长期后PH升高。图47 受控pC02的CH0-hGM-CSF_PYC2细胞系补料分批培养过程中的细胞周 期分布比率S/(GOGl)，细胞特异性产物形成率Sra和细胞内PH值pH进料开始后pH没有降低，pH有初始微小降低，在进入稳定生长期后PH升高，随后 SI3R提高。图48 补料分批过程的细胞特异性生产率和细胞周期GOGl期部分，未控制pC02和 /或达5%和15%的受控PCO20IL规模，细胞系CH0-hGM-CSF_PYC2，标准发酵条件。图49 受控pC02的补料分批过程的OUR、CPR和RQ。CH0-hGM-CSF-PYC2, IL补料分批，标准发酵条件。图50 受控pC02的补料分批过程的OUR、CPR和RQ。CH0-hGM-CSF-PYC2, IL补料分批，标准发酵条件。因此，本发明涉及在柠檬酸循环经修饰的真核宿主细胞中重组制备多肽的方法， 其中所述方法包含下述步骤(a)在允许表达多肽的条件下在合适的培养基中培养真核宿主细胞，其中培养基 中溶解的CO2(PCO2)的含量维持在10%至20%范围内的恒定值；和(b)从细胞或培养基中回收多肽。由于本发明的方法，得到非常高的产物浓度，导致回收成本的降低。因此，产物滴 度的提高允许在小体积培养中制备期望量的产物，这导致较低的投资成本。其产物参与柠檬酸循环的基因是本领域技术人员所熟知的，因此技术人员能够制 备柠檬酸循环修饰的、适用于本发明方法的真核宿主细胞(参见，例如Irani等人，(1999)，Chen等人，(2001) ；Paredes等人，(1999)，Bell等人，(1995))。此外，本领域技术人员可 使用公众可得的现有的、展示上述修饰的宿主细胞。另外，本领域技术人员也熟知用于培 养这些细胞的合适培养条件和培养基，以及以高表达水平表达预期重组蛋白质的基因的条 件。为了在培养基中得到恒定的溶解的CO2含量，本领域技术人员可优选的利用下述实施 例中描述的控制单元。如此处使用的术语“恒定值”或“稳定值”是指溶解的CO2含量偏离预期或预置的 设定值不超过20 %，S卩，例如，对10 %设定值来说，在8-12 %范围内。本发明的方法可使用不同真核生产细胞系进行。柠檬酸循环中的修饰，优选为遗 传修饰，可通过下述方法实现例如将同一生物或其他生物的另外基因插入DNA，或通过载 体，或通过引入更有效的启动子(例如CMV启动子)增强或减弱基因活性或表达，或通过可 导致一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加的基因编码区的相应突变。在本发明方法的优选的实施方案中，宿主细胞为动物细胞，优选的为哺乳动物细 胞或昆虫细胞。这些细胞，特别是用于有效制备重组多肽的细胞是本领域技术人员所公 知的。以示例方式可指出下列细胞系哺乳动物细胞如CHO细胞系例如CH0-K1、BHK例如 BHK-21、杂交瘤细胞、NS/0、其他骨髓瘤细胞和昆虫细胞或其他高等细胞。特别优选使用不 以生长依赖方式进行生产的细胞。在本发明方法的另一个实施方案中，宿主细胞为柠檬酸循环经修饰的宿主细胞。 柠檬酸循环的不同代谢途径、涉及的基因及其调控已经久为人知。因此，本领域技术人员 能够根据标准方法进行想要的修饰。特别优选的柠檬酸循环经修饰的宿主细胞为表达胞 质丙酮酸羧化酶的细胞，优选来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的胞质丙酮酸羧 化酶(PYC2，同工酶2)。编码此羧化酶的基因和用于转化真核细胞的合适表达载体描述于 US 专利号 6，706，524 和 Stucka 等人(1991)；又见 Wagner (1998) ；Irani (1999) ；Bollati Fogolin(2003) ；WO 00/46378。CH0-hGM-CSF-PYC2细胞系特别优选用于本发明的方法，其制备也详细描述于US 专利号 6，706，524。本发明的方法可以以重组方式得到高产量的多肽，如糖蛋白、融合蛋白、抗体及其 片段、干扰素、细胞因子(优选hGM-CSF)、生长因子例如促红细胞生成素(EPO)和激素等等。本发明方法的重要特征在于使用如下列实施例中描述的合适方法，令溶解的CO2 的含量维持恒定。本领域技术人员可通过标准方法根据使用的细胞系在10%至20%范围 内决定特别合适的CO2含量。维持恒定的溶解的CO2的含量(pC02)优选的在10%至20%范 围内，更优选的在11%至19%范围内，更优选的在12%至18%范围内，更优选的在12.5% 至17. 5%范围内，更优选的在13%至17%范围内，更优选的在14%至16%范围内。本发明的方法可使用众所周知的方法进行，例如分批、补料分批、恒化过程或灌 注培养，优选的使用补料分批过程。所有已建立的培养容器类型，如搅拌槽(stirring vessel)，均可用于这些过程。优选的，培养系统应允许高细胞密度的存在。原则上，可使用任意适于真核细胞培养的培养基作为培养基。用于哺乳动物细胞 培养，可使用基于已知配方的培养基，如IMDM、DMEM或Ham' sF12,以及可能经优化以用于 本发明方法的培养基，因此对具体的各个组分没有局限。这可通过例如各个组分的较高浓 度得到。原则上，如果需要也有可能在培养基之外单独调整单个的营养物。
pH范围优选在6. 7-7. 7之间，特别优选在7-7. 3之间。然而，其他pH范围也可以 接受。温度范围优选在35°C -38. 5°C之间，特别优选在37°C，例如用于哺乳动物细胞如CHO 细胞。然而，其他温度范围也可以接受，如例如在非哺乳动物细胞情况下< 35°C。为了维持培养基中溶解的CO2含量恒定，优选的使用经质量流量控制器(MFC)控 制的级联PCO2控制器的控制系统维持恒定，例如以下实施例中描述的。在经MFC控制的方 法中，(a)当培养基中pC02低于pC02设定值时增加供应空气中的CO2比率，(b)当培养基中 PCO2超出pC02设定值时增加供应空气中的CO2比率，和(c)级联控制器打开另外的用于递 送N2WMFC,优选的与步骤(b)组合控制，如果设定值的超出不能通过供应空气中的CO2比 率的降低得到足够的补偿，则步骤(c)是特别优选的和有利的。实施例1材料和方法(A)细胞系所有使用的细胞系均适应于在无血清培养基中悬浮培养。(I)CHO-MUCl本发明使用的CHO-MUCl细胞系是基于ATCC(美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，USA)的 CH0-K1 细胞系(CCL-61)。在铺满培养 的细胞中使用电穿孔转染重组质粒MUCl-lgG2a-pcDNA3 (Link等人，2004)。除了携带抗生 素遗传霉素(G418)抗性外，在巨细胞病毒启动子(CMV)的组成型控制下的构建体还介导 MUCl-lgG2a融合蛋白的表达。人乳腺癌相关粘蛋白糖蛋白MUCl的胞外区(C端)经肠激酶 切割位点融合至鼠免疫球蛋白2a亚类(IgG2a)的N端，因而被分泌至培养基中。经筛选和 之后的亚克隆得到本发明使用的CH0-MUCl-lgG2a-PH3931-16TR克隆(Link，2003)。此细胞 系展示了对浓度高达400 μ g mL—1的遗传霉素的抗性。(2)CH0-hGM-CSF-PYC2重组CH0-hGM-CSF-PYC2 细胞系克隆承蒙 M. Bollati Fogolin(GBF mbH, Braunschweig)提供。该细胞系由重组 CHO-Kl-hGM-CSF 细胞系(BollatiFogolin，2001) 通过包含编码酵母胞质丙酮酸羧化酶基因的质粒PCMVSHE-PYC2 (Wagner，1998 ；Irani, 1999)和编码潮霉素抗性的质粒PHMR272的共转染生成。使用CH0-hGM-CSF-PYC2_4D5克 隆(BollatiFogolin，2003)用于本发明进行的研究。该细胞系分泌重组的糖基化“人粒细 胞_巨噬细胞集落刺激因子”(hGM-CSF)至培养基，并展示浓度高达250 μ g mL—1的潮霉素 抗性。(3) CHO-hGM-CSF该细胞群体由CHO-hGM-CSF细胞系通过仅用质粒pHMR272的类似转染及随后的筛 选得到，作为表达PYC2的克隆的对照。不同个体克隆的该混合群体展示浓度高达250 μ g ml/1 的潮霉素抗性(Bollati Fogolin, 2003) (B)培养基用于细胞株维持和筛选，以合适浓度使用上面提及的抗生素。(l)ProCH04-CDM使用可购买到的无血清和蛋白质的培养基ProCH04-CDM(Biowhittaker Europe) 用于细胞株维持和用于初步研究PH滴定剂作用的小规模发酵罐系统(1L，Applikon)中的 CH0-MUC1细胞系培养。该培养基具有4. SOgL"1的葡萄糖含量和5. OOgL—1羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。其中添加了 NaHC03(终浓度3. iSgL—1)、谷氨酰胺(终浓度4. ImM)、次黄嘌呤(终 浓度0. ImM)和胸苷(终浓度0. ImM)。pH值调整为pH 7. 0。(2)工业制备培养基(Roche Diagnostics GmbH)根据说明书使用超纯水(SQ，Millipore)配制此培养基并针对所有细胞系进行添 加。所有培养基通过4M NaOH滴定调整为pH 7. 0。经无菌过滤(0. 2 μ m)和无菌检测(72h， 室温)之后，这些无血清培养基保存达1个月(4°C )。主要发酵培养基中的葡萄糖浓度为 8. OgL—1。用于补料方法，使用高葡萄糖浓度的浓缩培养基。(C)脱机分析(1)细胞数、存活率和无菌评估每日从合适的悬浮培养物中收集的样品经显微镜检查污染物(细菌和真菌)。 细胞数和存活率通过人工(光学显微镜)和自动化评估(ViCeII XR, Beckman Coulter, Krefeld)。使用0.5% (w/v)台盼蓝溶液的排除法测定活细胞的比率。为了辨别死细胞， 0.2%台盼蓝溶液以1 1的混合比率加入细胞悬浮物，小心的混合，在100倍放大的光学 显微镜下对Neubauer计数室(深0. 100mm，血球计数器)中8个大方格计数测定染色细胞 数。将得到的死细胞数浓度从总细胞浓度中减去以测定悬液中存活细胞的浓度。其对应于 总细胞浓度的比率即存活率。此测量过程在ViCeII XR中自动进行。通过对比率实现细胞 与台盼蓝的混合及活细胞和死细胞的鉴别。为此，集成相机提供用于计算机辅助分析的相 应图像。(2)培养基分析使用下述方法可从培养物的无细胞培养基上清中(10min，200g)得到培养基包含 的底物、代谢物和产物浓度。无细胞上清在-80°C临时贮存。如果没有另外说明，所有测量 和校准根据制造商的说明书进行。葡萄糖为了评估培养上清中的葡萄糖含量，使用自动化葡萄糖分析仪(EBIOCompact， Eppendorf, Hamburg)。测量基于酶偶联的电化学方法，其中固化葡萄糖氧化酶释放出葡糖 酸和过氧化氢，在Pt/AgCI/Ag电极上用安培法测量过氧化氢。过氧化氢氧化为氧气所产生 的电极电流与过氧化氢浓度直接成比例，因而与样品葡萄糖浓度直接成比例。乳酸乳酸也是根据电-酶原理用分析仪定量(Yellow Springs Instruments, Ohio, USA)。通过固化乳酸氧化酶，乳酸反应为丙酮酸和过氧化氢。后者可通过如葡萄糖定量的 方法定量。谷氨酰胺和谷氨酸谷氨酰胺和谷氨酸的同时定量根据葡萄糖定量中描述的原理进行，在不同的传感 器上使用2种固化酶。谷氨酸氧化酶催化谷氨酸和氧气反应为α-酮戊二酸和过氧化氢， 同时除去氨。在谷氨酰胺传感器上，谷氨酰胺酶首先实现谷氨酸的形成，谷氨酸之后再以类 似的方式反应。因此，谷氨酰胺传感器也检测溶液中的游离谷氨酸，这由分析仪计算在内。重量摩尔渗透压浓度重量摩尔渗透压浓度是每测量单位溶剂中溶解粒子数的度量。根据定义，去离子 水在通常条件下于0°C结冰。1. 858K的相关冰点降低对应losmol/kg的重量摩尔渗透压浓
11度。使用冰点渗透压仪测量重量摩尔渗透压浓度时，首先将样品冷却至-7. 0°C。通过晶种 诱导过冷溶液的结晶，测量产生的热量直至达到冰点。此热量与纯溶剂水的差别与样品的 重量摩尔渗透压浓度直接成比例。氨基酸培养上清中的游离氨基酸浓度通过反相HPLC(高效/压液相色谱)测定 (Buntemeyer，1988)。使用具有2个高压泵(Model 420)、自动采样(Model460)、以及荧光 检测器(Model SFM 25)和计算机辅助评估元件(KromaSystem2000, version 1. 60)的全自 动 HPLC 系统 D450(Kontron Instruments, Echingen)进行分析。使用 RP18 柱(Ultrasphere 0DS，150_X4. 6_，颗粒大小5μπι，Beckman, Munich)进行分离，使用十八烷基硅酸盐 (octadecylsilicate)作为固定相。为此，前置另一 RP18 柱(Hypersil ODS, IOmmX4. 6mm, 颗粒大小IOym, Techlab, Erkerode)以增加停留时间。在分离前，用邻苯二甲醛(OPA) (Sigma,Deisenhofen) (Lim, 1987 ；Buntemeyer, 1991)将氨基酸衍生化。氨基酸的伯氨基团 在碱性介质(PH > 9)中与OPA和3-巯基丙酸反应为荧光异吲哚衍生物(图2. 1)。在用 340nm激发光激发后在450nm发射波长上进行测量。无细胞培养上清(500μ 1)与三氯乙酸(100μ 1，36% w/v)混合，离心沉淀 (10min，15000g)蛋白质。回收中间相(250 μ 1)并中和(12. 5μ 1 NaOH 1 Μ)。将此储液经合 适的预稀释后用于衍生化，并用硼酸钠缓冲液(0.4m，pH 9. 5)碱化，其中，由于异吲哚衍生 物的不稳定性，衍生化在HPLC分离前立刻进行，通过自动化加入衍生化试剂(溶于Iml甲 醇的50mg ΟΡΑ, 100 μ 1 3-巯基丙酸和9ml 0. 6M硼酸钠缓冲液，pH 10. 4)至样品。用于氨 基酸衍生物的HPLC分离的梯度(Buntemeyer，1991)从较极性(99% ν/ν 0. Im醋酸钠pH 7. 5，ν/ν四氢呋喃)到较非极性(30% 0. 08511醋酸钠？!15.2，70%甲醇)缓冲液中进行， 这可以定量除了半胱氨酸和脯氨酸以外的所有氨基酸。脯氨酸作为仲胺不发生反应，半胱 氨酸与OPA共同形成非荧光衍生物。(3)MUCl-lgG2a ELISA由本研究培养的CH0-MUC1细胞系制备的MUCl_lgG2a抗体为典型鼠免疫球蛋白 G (IgG)，其H链为y型，属于2a亚类。其N端与MUCl连接，因此对此抗体分子的检测始终 包括对融合的MUCl分子的检测。为了避免检测到不完全的翻译产物，只考虑超过80%的细 胞存活率。培养上清中MUCl-IgG2a的定量评估通过ELISA进行。MUCl-IgG融合蛋白的定量根据Link(2003)的研究进行(Parker, 1990 ；Link, 2003)。使用 96 孔免疫板(F96 Maxisorp, Nunc, Wiesbaden)作为 MUCl-IgG 定量 ELISA 的吸附固相。吸附于固相的捕捉抗体是可购买到的山羊抗小鼠IgG(M-8642，Sigma, Deisenhofen)，通过用小鼠IgG免疫山羊得到。提供的抗体(Img)溶解于PBS (25ml，终浓 度40 μ g mL—1)，分装(Iml)并贮存于-20°C。使用前用PBS稀释为3 μ g mL—1。使用待定量 MUCl-lgG2a的上清和MUCl_lgG2a标准品作为可检测抗原。在用于ELISA之前，标准品用稀 释液预稀释至1 μ g mL—1。使用捕捉抗体碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG AP (A-5143，Sigma, Deisenhofen)作为酶标记的抗体，所述抗体携带碱性磷酸酶(AP)作为底物反应酶并与小 鼠IgGy型重链特异性结合。抗体于4°C贮存。通过碱性磷酸酶，底物磷酸对硝基苯酚(pNPP， N-2770, Sigma, Deisenhofen)反应生成可通过光度测定的黄色的对硝基苯酚。使用分光光
12度计(405nm,ffallacVictor2,Perkin Elmer Life Sciences,Bad ffildbach)测量所得显色 的消光。为了用捕捉抗体山羊抗小鼠IgG包被Maxisorp免疫板，将抗体加入微滴定板的各 个孔中(每孔100μ L)。之后，将封闭的检测板置于4°C孵育14h，之后将微滴定板快速翻转 并拍打以去除缓冲液，用清洗液清洗10次，并拍干。为了封闭捕捉抗体的非特异性结合位 点，每孔加入200 μ L封闭液并将加盖的板置于37°C孵育2h。之后用清洗液清洗板3次，并 拍至干燥。待分析的无细胞培养样品首先经离心(15000g，3min)，得到的上清作为包含产物 的样品用于进一步分析。使用稀释液进行合适的预稀释，以得到可比较的标准品和样品的 强度用于评估显色反应，从而得到产品浓度的结论。稀释液中包含的BSA作为中和剂用于 结合非特异性结合位点。用于样品(3-12列)和标准品(1和2列)的双测定，在预稀释板 (96孔，Nunc，Wiesbaden)的H行(该板分为Al至H12)，每孔分别加入280 μ L样品或标准 品。之后，进行1 2连续稀释，每一步将140 μ L移至下一行的每孔包含140 μ L稀释液的 孔中。在包被的检测板的每孔加入100 μ L预稀释的样品和标准品，和预稀释板类似，每 行的稀释度递增，将加盖的板置于37°C孵育lh。为了用空白样品平衡分光光度计，右下的2个孔仅用稀释液处理。之后经拍打， 将板用清洗液清洗10次并拍至干燥。下一步中，酶标记的山羊抗小鼠IgG AP抗体首先以 1 1000在稀释液中稀释，之后转移至检测板的孔中(每孔100 μ L)。在37°C重新孵育 Ih,经拍打去除剩余的缓冲液，之后将检测板用清洗液清洗10次。由于底物pNPP对光敏 感，以下所有步骤在黑暗中快速连续进行。通过在检测板的各个孔中加入100 μ L底物诱 导磷酸对硝基苯酯经抗体结合的碱性磷酸酶反应成为黄色产物。板在黑暗中孵育(室温， 10-30min)直至在反应的标准品孔中观察到明显的黄色显色(0. 7-0. 8的消光)。在405nm 用分光光度计测量显色的强度。(4) hGM-CSF EILSA使用竞争ELISA(Bollati Fogolin, 2002)检测细胞因子hGM-CSF。使用96孔免疫 板作为hGM-CSF的ELISA定量的吸附固相。使用可购买到的大肠杆菌(E. coli)重组未糖基 化 HGM-CSF (Leucomax,活性组分莫拉司亭，Schering-Plough corporation Kenilworth, NJ,USA)包被Maxisorp板，并作为浓度标准品。承蒙Bollati Fogolin女士提供的单克隆小 鼠抗GM-CSF 抗体(M7E10) (Etcheverrigaray, 1998)用作一抗。此抗体针对hGM-CSF 的一个 不依赖蛋白质糖基化状态均可结合的结构域。酶标记的抗体为过氧化物酶缀合的山羊抗小 鼠IgG-HRP，携带辣根过氧化物酶作为底物反应酶，并与小鼠IgG —抗的Fab2片段(Dianova 115-035-072,0. SmgrnL"1)特异结合。底物1，2_苯二胺二盐酸盐(0PD，Fluka)通过辣根过 氧化物酶在酶反应终止后反应为橘黄色终产物。用光度测定测量所得显色的消光(492nm， 测量时间 1 秒 / 孔，Wallac Victor2, Perkin Elmer Life Sciences, Bad Wildbach)。为将大肠杆菌hGM-CSF作为发酵上清中糖基化hGM-CSF的竞争物包被Maxisorp 免疫板，将大肠杆菌hGM-CSF加入微滴定板的各个孔(每孔16. 5ng,在100 μ L包被液中)。 之后，封闭的检测板在水蒸气饱和的空气中孵育(371，111，之后41，1411)，经拍打去除剩 余缓冲液，用清洗液清洗10次，拍至干燥。为了测定标准曲线，在稀释液中对未糖基化的hGM-CSF标准品进行200-0. 195ng mL—1范围的稀释。来自培养上清的样品也在稀释液中 进行1 2的连续稀释，与准备好的标准品一起转移至包被好的微滴定板(每孔100 μ L)。 用空白稀释液作为不包含hGM-CSF的标准品或培养上清的竞争的完全结合对照。之后，将 一抗M7E10(1 100000在稀释液中，100 μ L每孔)加入用样品和标准品包被的板的孔中， 37°C孵育lh。去除溶液，用清洗液清洗板7次，与缀合抗体(1 5000在稀释液中，100 μ L 每孔)在37°C孵育lh。清洗板7次后，加入新鲜配制的染料溶液开始酶反应。孵育15min 后，加入终止溶液(50 μ L每孔)终止反应，在492nm波长下测定得到的消光(1秒/孔)。(5)流式细胞分析使用FACSCaliburCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose，CA，USA)和 CellQuest 软件版本 3. 3(Becton Dickinson, San Jose, CA,USA)测量相应准备的样品。数 据的脱机分析使用 CellQuest 3. 3、Modfit 和 FCSassist 1. 0 在一台 G4 Apple Macintosh 计算机上进行。细胞周期时相分布为测定各细胞周期(Gl、S、G2和M)，从上清中分离(200g，7min)以单个细胞悬浮 物形式的培养样品，并在冰冷的PBS中清洗2次(200g，7min)。得到的沉淀在剧烈摇动下逐 滴重悬于80% (ν/ν)甲醇(高等级，Merck)混合物中，并于4°C孵育2h到2个月。之后离 心细胞(200g，7min)，接着将细胞重悬于0. 1% (w/v)皂角苷(Roth)的PBS混合物中，清洗 2次(200g，7min)。将4X IO6个细胞重悬于ImL染料溶液(0. 1 % w/v皂角苷，Igmr1RNase S (Sigma)，0. 02mg mL—1碘化丙啶(Sigma))并孵育(室温，30min)，得到粉红色染色的细胞 沉淀。先通过冰上存放终止RNA的酶降解，之后，将染色的细胞用于流式细胞术。根据制造 商的说明书和流式细胞术相关文献中的实验方案进行测量(Melamed，1990 ；Givan, 1992 ； Shapiro, 1994 ；BD-Biosciences 2000)。细胞内pH值动物细胞的细胞内pH值(pHi)与不同的细胞功能相关。细胞生长、代谢和蛋白质 生产以及酶活性的修饰、转运机制、增殖诱导和维持能量需要均涉及PHi的变化(Madshus， 1988 ；GMnstein, 1989) 0因此，pHi的控制对细胞来说具有根本的生物学重要性。多种具生 物学重要性的细胞内大分子的等电点在PH7的生理值附近，因此质子浓度的较小的改变即 可对蛋白质和核酸的构象和相互作用具有重要影响。为避免胞质的酸化，H+质子直接从细 胞中去除或向细胞中引入碳酸氢根离子HC0”以中和胞质中的质子。用于此pHi控制，动 物细胞中存在不同的机制(Madshus，1988 ；Reusch, 1995) :Na+/H+交换泵、Na+依赖性和非依 赖性C17HCCV反向转运体、Na+MCO3-同向转运体和H+转位ATP酶(质子泵)。与动物细胞培养中范围在6. 6-7. 4的细胞外pH(pHe)相比，上述机制使细胞能够 主动维持与细胞外PH值偏离0. 1-0. 5pH单位的细胞内pH值。细胞器具有特征的pH值以 行使其生物学功能。此外，精确控制的PH梯度对翻译后蛋白质的分选和加工十分重要。此 细胞内调控的功能障碍可能在细胞培养中发生，原因是培养基中有机酸和碱如例如乳酸、 铵或C02的积聚。已发现pHi和细胞周期时相相关。因此，一般的，如果细胞处于细胞周 期中的代谢活跃期(分别为S和/或G2期)，胞质中可测量到较碱性的pH值(Welsh and Al-Rubeai，1996)。细胞内pH值可使用流式细胞术测定，使用在细胞内激活的pH敏感荧光染料。本发明使用的荧光染料5'(和6' )_羧基-10-二甲氨基-3-羟螺环[7H-苯并[c]氧 杂蒽-7，1 ‘ (3 ‘ H)-异苯并呋喃]-3 ‘酮，通常称为 carboxyseminaphtorhodaf Iuor acetoxymethyl ester或简称为羧基-SNARF_1_AM，下文中称为SNARF-1，是一种弱酸，在 37°C具有7. 3-7. 4的pKa值，在488nm波长光的激发下，在2种不同波长下展示荧光信号极 大值(FL2 :580nm,FL3 :640nm，图 3-7) (C-1270，Molecular Probes)。这些发射极大值的相 关性显示了 PH依赖性偏移，因此可不依赖于细胞中激发染料的量测定pHi。作为乙酸基甲基衍生物，该荧光染料为细胞膜依赖性的，在胞质中被非特异性酯 酶水解。此游离形态的荧光体保留在细胞中，并可在细胞中经激发发出荧光。为测定细胞 内PH值，必须通过使用已知的pHi值建立标准曲线。这必须基于与待测样品来源相同的细 胞群(Owen, 1991 ；Owen, Carango等人1992)。在这方面，为得到典型pH值，在样品准备中 维持反应器条件和标定方法的选择是同样重要的(Cherlet，Franck等人，1999 ；Bond and Varley,2005 ； Jockwer, Gatgens 等人，2005)。在本发明中，使用伪零点标定方法校准细胞内pH值，所述方法基于通过向细胞中 加入以已知比率混合的弱酸和碱对稳定PH的偏离。由此，得到的荧光比率反应了新的pH。 如果弱酸和碱的混合物的摩尔浓度足够高，此相同混合物的额外加入将不改变荧光比率或 pHh，从而偏离的pH代表满足方程3-3的新的伪零点。如果将不同摩尔比率的弱酸和碱的 浓缩混合物加入至已载有PH敏感的荧光染料的细胞中，则可通过用伪零点-pH对得到的荧 光比率作图建立标准曲线。此标定方法可通过流式细胞术重复，并且仅需要一点时间即可 完成，其不依赖于细胞内的K+浓度，因此适用于在发酵过程中的分析。为用于生物反应器(具压力封闭)中的典型采样和在定义的溶解气体组成中培 养，本发明中开发了特异的采样装置(Jockwer，Gatgens等，2005)。在染料吸收期的pH相 关参数，如PCO2、压力、pH和温度均进入此装置，从而使细胞样品在可再现的反应器条件下 染色。因此，在所述方式下测量的pH代表了生物反应器中的真实条件，优于传统方法。相 同细胞群的未染色样品在相同的条件下作为对照与染色的样品一起被研究。溶液和缓冲液HEPES缓冲液(N_[2_羟乙基]哌嗪-N' -[2-甲磺酸](IOmM)2. 383g L-1HEPES(IOmM)7. 802g L-1NaCl (133. 5mM)0. 298g L^1KCl (4mM)0. 166g L^1NaH2PO4-H2Od. 2mM)0. 144g L-1MgSO4 (1. 2mM)1. 981g L-1 α -D-葡萄糖(IlmM)0. 294g L-1CaCl2IH2O (2mM) pH 7. 4，无菌过滤，C存于 4°C^c|4 SNARF-I(carboxy seminaphtorhodafIuor acetoxymethyl ester)(2mM)50 μ g 幾基-SNARF-I-AM(C 1272, Molecular Probes, Leiden, TheNetherlands)44 μ 1 DMSO丁酸 BA (η-丁酸)IM4. 6mL 丁酸 10. 9M(pKa = 4. 82，Sigma)力口 50mL H2O pH 7· 4
无菌过滤，贮存于4°C三甲胺TMA IM12. 3mL 三甲胺 4. 06M(pKa = 9,8, Sigma)力口 50mL H2OpH 7.4，无菌过滤，贮存于41HDFBS10% (ν/ν)透析的FBS，于HEPES缓冲液中表1 伪零点标定溶液(Chow，Hedley等人，1996)
6倍浓缩 BA/TMA [mM]0. 5 log ([BA/TMA])BA [ μ TMA [μι]HDFBS [mL]6/96-0. 6609608. 986/24-0. 3602409. 706/6060609. 8824/60. 3240609. 7096/60. 6960608. 98在使用开发的采样装置(Jockwer，Gatgens等人，2005)从相关培养系统中采样 前，将6倍浓度的伪零点标定溶液(表3-1)加入流式细胞仪的测量槽中(各200 μ L)，以 气密方式关闭测量槽并在4°C贮存。2种最高和最低混合比率的酸和碱标定溶液每种配制 2次，以用于流式细胞仪测量范围的调整。对待测样品，以相同方式用HDFBS处理3个测量 槽(每槽200 μ L)。在从培养基中收集样品之前，将22 μ L荧光染料加入预孵育的采样装置(37°C )。 在等压的气密采样过程中混合细胞悬浮物开始对无酯酶培养基中的细胞染色，在黑暗中和 搅动下继续染色(合适的反应器压力，25min，37°C )。孵育15min后，标定和测量溶液的温 度在仍然封闭和气密下调整至反应器温度(水浴，37°C )。细胞和荧光染料在反应器条件下 的孵育一旦结束，细胞立即经受压力控制和溶解气体分析(Compact 3，RocheDiagnostics GmbH)，之后悬浮于相应的测量和标定溶液(每种200 μ L)中，10秒后用流式细胞仪 (FACSCalibur，Becton Dickinson)测量。为此，首先在测量液(HDFBS)中对待测样品进行 重复测量，之后才对染色的细胞在相应的测量液中连续测量。在样品的流式细胞测量后立 即测量各个样品的 PH 值(Compact 3，Roche Diagnostics GmbH)。从开启采样装置到染色和未染色细胞的溶解气体分析的时间间隔不超过5秒，直 到流式细胞测量终止的时间间隔不超过90秒。荧光分析终止和细胞外pH值测定的时间间 隔是15秒。此程序组合(压力维持)采样装置使得能够测定典型PHi值(也见4. 2章) (Chow, Hedley 等人，1996)。测量测定pHi值的荧光流式细胞测量根据制造商对仪器(FACSCal ibur，BectonDickinson)和染料(羧基-SNARF1-AM，Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)的 说明书以及根据相关文献进行(Chow and Hedley，1997)。以下列出必须对各个样品优化的基本设置·测量窗口 1 :SSC/FSC(散点图，缩放比例双线性，总细胞群)·测量窗口 2 计数(线性)/FL2 (对数)(柱状图)·测量窗口 3 计数(线性)/FL3 (对数)(柱状图)·测量窗口 4 计数(线性)/荧光比率(FL2/FL3)通过合适的限制值将死细胞、团聚和染色不充分细胞从测量中排除。因为使用的 测量仪器不可能实时实现测量窗口 4，荧光比率使用程序FCSassist (Becton Dickinson) 计算。使用程序CellQuest 3. 3 (BectonDickinson)用于测量。将“平均荧光强度比 率”(MFI)对各个诱导的pHi值根据方程3-3作图，得到可计算样品PHi的标准曲线。(6)溶解气体，pH值和依赖参数使用血气分析仪AVL Compact 3 (Roche Diagnostics GmbH)用于包含细胞的培养 物样品(> 55 μ L，37°C )中溶解气体CO2和02、pH值的直接测量以及碳酸氢盐和“总CO2，， 依赖浓度的计算，根据制造商的说明书进行(Roche 2003)。在放置好相关生理样品后，仪器 自动测定上述参数。为此，在调节好的测量室中安装下列小型电极·ρΗ参考电极·ρΗ测量电极· ρ02测量电极· pC02测量电极pC02的直接测量是pH测量的变型。通过离子不通透的膜，仅气体CO2可进入测量 液，测量该溶液被解离的CO2修饰的PH值，经放大后得到PCO2值[mmHg]。在各样品测量中 进行的大气压自动测量后分别进行JpCO2和/或O2的分别转换。供仪器使用的标定气 体和缓冲溶液可以根据定义的循环自动标定和清洁。(D)动物细胞培养所有操作依照处理遗传修饰生物的标准操作规章和指示进行，安全级为Si。(E)生物反应器培养所有检测在可购买到的IL(Applikon Biotek, Knullwald)和 10L(B. Braun Biotech International,Melsungen)工作体积的搅拌反应器中于无菌条件下分别进行。所 有测量值经测量放大器和模拟-数字转换的编码器(SMP Interface, Siemens)传送到处理 计算机，并使用过程控制软件LabView(National Instruments, USA)处理和储存。以下过 程参数在两个系统中的整个培养期内相同，并始终检测。标准发酵条件(1L&10L反应器)搅拌速度200rpm温度37 °C溶解氧气饱和度40 % (与空气相比)ρΗ7· 0比率充气(1L反应器2. 4-5. OLtT1 ； 10L 反应器 ^ΟΙδ Γ1)将用于维持溶解氧气ρ02的受控浓度的、具有恒定充气速率的氮气(N2)、氧气(O2)和二氧化碳(CO2)的高级气体组分混合物称为“比率模式”。(1)过程参数的测量溶解氧气(p02)不同水溶液中溶解氧气浓度的原位测量通过氧电极进行，根据ClarkdnPro 6000，Mettler Toledo, Urdorf, CH)。溶解二氧化碳(pC02)不同水溶液中和发酵中的溶解二氧化碳浓度的原位测量通过可购买到的探针 YSI 8500, Yellow Springs Instruments (Yellow Springs, USA)禾口 / 或探针 InPro 5000， Mettler Toledo (Urdorf, CH)进行，后者用于无细胞系统中的比较测量。两种仪器都在显 示模式CO2]下进行。其中，]表示在标准发酵条件(37°C )下，在充气混合物和水 性培养基中CO2比率]的平衡条件，在标定条件下设定。使用的标定条件和C02[% ]显示值允许在过程中计算溶解的CO2的平衡浓度。如 此技术领域的其他出版物，此处使用的术语pC02[% ]为C02 “溶解浓度”和“部分压力”的 同义词，而实际溶解在培养基中的绝对CO2浓度需要在此基础上计算(Zhangi，Schmelzer 等人，1999 ;Pattison，Swamy 等人，2000 ;Schmelzer，de Zengotita 等人，2000)。饱和 度对应于约7，5mmHg，10%对应于约75mmHg。废气分析使用废气分析仪Xentra 4900 (Servomex, Hamm)对两种过程的非水性废气中的氧 气和二氧化碳定量。氧气比率通过顺磁性测量(0-100% ν/ν)，二氧化碳比率通过红外光谱 测量(0-25% ν/ν)。ρΗ值的测量使用配备凝胶电解液的单杆ρΗ测量(Applisens，TheNetherlands)。 与使用液体电解液的传统PH电极相比，使用的ρΗ电极在高压灭菌后展示了可显著降低外 部物质渗透玻璃膜和与此相关的电极位移的内部压力。在安装和灭菌前，根据制造商的说 明书在37 °C用2个定义的ρΗ值(pH4. 00和pH6. 96)对ρΗ电极校准。在开始发酵前，通 过血气分析仪(章节3. 3. 4)的外部比较测量确定正确的操作性。通过安装在培养容器 盖上的2个预加压的凝胶填充的电极测量过程超压(B. BraunInternational，Melsungen ； Bioengineering AG，WaId，CH)。通过反应器制造商安装在探针环中的PT100电阻温度计测 量所有操作阶段培养容器中的温度。(F)数学方法用于培养和发酵，通过分析方法测定可对生长和代谢率进行描述的参数。用细胞 密度表示动物细胞培养而不是微生物系统。一般不关注干生物量。存活率表示存活细胞密度ZDL相对总细胞密度ZDG的比率
权利要求
用于在柠檬酸循环经修饰的真核宿主细胞中重组制备多肽的方法，所述方法包含以下步骤(a)在允许多肽表达的条件下在合适培养基中培养所述真核宿主细胞，其中培养基中溶解的CO2含量(pCO2)维持在10％至20％范围内的恒定值；和(b)从细胞或培养基中回收所述多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞为动物细胞或昆虫细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述哺乳动物细胞为CH0、BHK、杂交瘤或骨髓瘤细胞。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述柠檬酸循环经修饰的宿主细胞为表达胞 质丙酮酸羧化酶的细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述细胞为CH0-hGM-CSF-PYC2。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述多肽为融合蛋白、抗体或其片段、干扰素、 细胞因子或生长因子。
8.权利要求1的方法，其中培养基中溶解的CO2含量(pC02)维持在12.5%至17.5% 范围内的恒定值。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于以补料分批方法进行。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中培养基中所述溶解的CO2含量(pC02)通过 质量流量控制器(MFC)用具有级联PCO2控制器的控制系统维持恒定。
11.权利要求10中的方法，其中当培养基中PCO2不足设定值时增加供应空气中的CO2 比率，当培养基中PCO2超过设定值时降低供应空气中的CO2比率，如果设定值的超出不能够 通过供应空气中CO2比率的降低充分得到补偿，则级联控制器打开另外的MFC以递送N2。
全文摘要
本说明书描述了用于在柠檬酸循环经修饰的真核宿主细胞中重组制备多肽的方法，其中所述方法包括在允许多肽表达的条件下在合适培养基中培养所述真核宿主细胞，其中培养基中溶解的CO2含量(pCO2)维持在10％至20％范围内的恒定值。
文档编号C12N9/00GK101970646SQ200980108428
公开日2011年2月9日 申请日期2009年3月11日 优先权日2008年3月12日
发明者A·约克尔, B·苏埃斯, C·克灵格尔, D·艾森克雷特泽尔, J·格特根斯, T·诺勒 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司