专利名称：一种检测ugt1a1基因型的引物和探针、及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测UGTlAl基因型的引物和探针、及其试剂盒。
背景技术：
个体化治疗是基于药物基因组Pharmaco-genomics发展起来的,在肿瘤治疗中扮演越来越重要的角色。个体化治疗是指通过检测肿 瘤的靶标或患者的遗传因素，了解患者对药物敏感性及耐受性，从而指导合理用药、提高用药的安全性和有效性、避免不良反应、减少药物治疗的费用和风险。简而言之，个体化治疗的目标就是在合适的时间，对合适的人，使用合适的药物，处方合适的剂量。伊立替康(Irinotecan,CPT_ll,商品名为开普拓、Camptosar),是DNA拓扑异构酶I抑制剂，可诱导单链DNA损伤，从而阻断DNA复制叉，阻止DNA链的重新组装，引起DNA双链的断裂，造成细胞死亡。伊立替康主要用于治疗成人晚期/转移性大肠癌，对小细胞和非小细胞肺癌及宫颈癌和卵巢癌亦有疗效。伊立替康最主要的毒副作用为嗜中性白血球减少症及迟发性腹泻，后者为剂量限制性毒副反应，严重时可致命。临床研究表明，40%以上接受伊立替康治疗的患者可出现3 4级迟发性腹泻，约10%患者可出现嗜中性白血球减少症，从而导致化疗方案的提前中止。伊立替康为前体药物，在体内经过羧酸酯酶转化为活性代谢物。羧酸酯酶将伊立替康分子10位的哌啶侧链裂解，产生7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，其活性较伊立替康强100到1000倍。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-GT，主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代谢)葡萄糖醛酸化灭活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 (SN-38G)，从而保护健康细胞免受伊立替康毒性的影响。UGTlAl基因编码尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶，其多态性最常发生在TATA启动子区，表现为易变的TA重复。野生启动子序列有6个TA重复(TA)6，也被称为UGT1A1*1，三个变异等位基因分别为5、7、8三种TA重复——(TA)5, (TA)” (TA)go其中(TA)7多态性(也叫UGT1A1*28)最常见，(TA)5和(TA)8多态性少见。突变型UGT1A1*28的杂合子比野生型对SN-38的葡萄糖醛苷化活性稍低，而UGT1A1*28的突变纯合子对SN-38的葡萄糖醛苷化活性则仅是野生型的35%，从而更容易产生毒副作用。野生型UGTlAl (6/6)在接受伊立替康治疗时产生毒副作用风险较低，而UGT1A1*28突变型杂合子(6/7)产生毒副作用的几率为12. 5%，突变型纯合子(7/7)则有50%产生毒副作用的可能性。该突变的影响是与剂量相关的，在使用低剂量伊立替康治疗时，UGTlAl突变与否对毒副作用的风险影响大。因此，2005年,美国FDA要求在伊立替康药品标签上加入警示,建议患者在使用伊立替康前先检测是否带有UGT1A1*28突变。在中国人中，野生型纯合子￠/6)、杂合子(6/7)和突变型纯合子(7/7)的发生频率分别为70. 2%、27. 7%和2. 1%。为此，发明人根据我国人口突变特点，设计并制造了一种检测UGTlAl基因型的引物和探针、及其试剂盒。
发明内容
本发明涉及一种检测UGTlAl基因型的引物和探针、试剂盒。为了完成本发明的目的，采用的技术方案为本发明涉及一种检测UGTlAl基因型的引物，其中，所述引物的核苷酸序列为上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，下游引物为由SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。本发明还涉及一种含有述检测UGTlAl基因型的引物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、PCR对照品、Genscan对照品；其中，核酸扩增试剂为表I:
权利要求
1.一种检测UGTlAl基因型的引物，其中，所述引物的核苷酸序列为 上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列， 下游引物为由SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求I所述检测UGTlAl基因型的引物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、PCR对照品、Genscan对照品；其中，核酸扩增试剂为
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸扩增试剂中，UGTlAlMIX-I中含有 6mmol/L 引物各 lul、5mM 的 dNTPs O. 5ul、10Xbuffer 50μ，共计 25μ1; 所述的UGT1A1MIX-2中含有Taq酶5u/反应、UNGO. 5u/反应。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR对照品为
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的Genscan对照品为
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对检测样本的要求为，所述检测样本为人类基因组DNA，0D260/0D280在I. 8 2. 0，DNA总量在3 15 μ g，稀释DNA的终浓度至50 125ng/ μ I,优选75ng/ μ I。
7.根据权利要求2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)扩增试剂准备 取UGTlAl MIX-I管、UGTlAl ΜΙΧ-2管，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心5 15s ；配制反应体系21 μ I的UGTlAl MIX-I与I μ I的UGTlAl ΜΙΧ-2混合，加入到PCR反应管中，得到PCR预混液，配制多管，存于O 4°C ；(2)加样 从UGTlAl阴性对照管、UGTlAl PCR阳性对照管和样本处理液管中各取3 μ 1，分别加至装有步骤(I)制备的PCR预混液的离心管中，进行扩增和检测； (3)PCR扩增反应体系为25μ I ; PCR扩增条件为
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的结果判定方法为 (1)有效性判定 a.Genscan有效性判断 在322 330bp范围内，UGTlAl Genscan阳性对照在325、327bp位置收集到ROX荧光信号，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比< 3，判定为有效； b.PCR有效性判断 在322 330bp范围内，阴性对照未收集到任何荧光信号；UGT1A1 PCR阳性对照在Genscan阳性对照相同位置收集到FAM荧光信号，荧光信号高度高于或等于Genscan阳性对照，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比< 3，判定为有效； (2)结果判定 在322 330bp范围内， a.当标本检测中收集到两个荧光信号，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比(3，则这两个峰均判为有效；若两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比> 3，则高峰判为有效峰，低峰判为无效峰； 有效峰中至少有一个的荧光信号高度> Genscan阳性对照低峰的荧光信号高度，则按检验结果判定表进行判断；反之，则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验； b.当标本检测中收集到一个荧光信号，且荧光信号高度>Genscan阳性对照低峰的荧光信号高度，则按检验结果判定表进行判断；反之，则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验； c.当标本检测中的未收集到荧光信号则判为标本质量不符合检测要求,低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验； 检验结果判定表
全文摘要
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测UGT1A1基因型的引物及其试剂盒。所述引物的核苷酸序列为上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，下游引物为由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本发明的试剂盒操作简单，检测速度快；灵敏度高，最低检出限为50ng/μl基因组DNA并可通过基因扫描技术能检测出UGT1A1所有基因型。
文档编号C12Q1/68GK102816858SQ20121032756
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者熊慧, 程新建, 谢立群, 陈嘉铮, 包文静, 陶慧卿, 丁璐, 徐任 申请人:上海源奇生物医药科技有限公司