专利名称：检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法。
背景技术：
传统化疗主要针对细胞的DNA，这种作用往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也“错杀”了很多正常细胞。靶向治疗和以前的化疗完全不同。肿瘤的发病有多种机制参与，而这些机制往往是肿瘤细胞所特有的。靶向治疗就是针对肿瘤发病机制中某特有的信号传导通路或者某一发病机制，采用单克隆抗体、小分子物质将它打断，从而达到治疗肿瘤的目的，而对正常细胞作用却很轻微。
靶向治疗的特异性很强，只针对癌细胞，没有化疗常见的副作用，不会引起患者掉头发，不会引起恶心、呕吐。常见的副作用是皮疹和腹泻，患者大多可以耐受。靶向治疗多数只需每天口服治疗一粒，患者可以在家里进行，安全性较好，有望恢复往日的生活，部分患者甚至能重返工作岗位。靶向药与常规化疗药的另一个不同在于其用药的判断上。医生在给病人使用常规药物时，一般是根据病人的身体状况、症状等条件选择用药，而药物的有效性要通过一段时间的治疗观察才能判定。而靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路；而肿瘤细胞是有多样性的，并非所有肿瘤细胞都具有一样的特征性位点，具有个体差异，因此对于某些特定的靶向药物，在使用前检测患者体内是否有符合条件的基因，判断其肿瘤细胞上是否有符合条件的位点，就可以预知该药物是否会奏效，这从临床上节省了金钱和时间。这样的诊断模式被称为“个体化诊断”。对于靶向药物来说，使用前进行“个体化诊断”是保证安全、有效用药的必要步骤。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增值、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR信号转导通路上的基因发生体细胞突变及表达异常，从而导致肿瘤细胞无限制的扩增和迁移。因此，近年以EGFR和EGFR信号通路中关键的组分为靶标的分子靶标检测及靶向治疗成为国际肿瘤界个体化医疗关注的焦点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，吉非替尼和厄罗替尼已被FDA批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。这些靶向药物已应用于晚期和不适宜传统治疗方案的NSCLC患者的临床治疗。在这类药的早期使用过程中，曾发现其有效率并不高，甚至因此而被FDA叫停；对临床资料的统计表明，这两种靶向药物更适合东方人、不吸烟者、女性和腺癌/肺泡癌患者。随后，进一步研究结果表明，EGFR基因外显子的突变(体细胞突变)是患者对此类靶向药物有效的必要前提。美国国家癌症综合网络(NCCN) 2009年版的临床指南中明确指出EGFR突变，尤其是外显子19缺失突变与肿瘤对TKIs如吉非替尼的敏感度有重要关系，所以EGFR基因突变的检测有利于为这些患者选择最好的治疗方法。如图I所示。目前认为EGFR突变的位点主要集中在18、19、20和21外显子，其中19号外显子和21号外显子的突变最常见，占整个突变的90%左右，21号外显子主要集中在第858为密码子的改变，但19号外显子存在多种缺失突变，而且不同的突变，病人对TKI的疗效是不同的。此外，最新的研究也表明，TKI的疗效不仅与是否有EGFR基因19号外显子突变相关，还与基因突变的量有密切关系。广州的吴一龙教授利用两种敏感度不同的检测方法，一种是用测序检测EGFR突变，另一种是用荧光定量PCR检测EGFR突变，分别筛查出两组肺癌病人，都给予靶向药物治疗。结果发现，第一组即基因突变量大的肺癌病人，疗效特别好，而第二组即突变量小的病人疗效则很一般，差别非常明显。这个研究将改变肺癌治疗策略。目前，对肺癌病人，一般先查有没有EGFR突变，如果有突变，就建议吃靶向药物。今后要对有突变的病人进一步分类，根据突变量的大小，决定是否先服用靶向药物，制定个性化治疗方 案。专利ZL200910111499. 2公开了一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针，还公开了含有该引物、探针的试剂盒，该试剂盒仅能检测出以下29种EGFR突变，并不能对突变的类型，尤其是EGFR基因第19号外显子的突变类型进行分析。此外，也不能对基因突变的量的多少进行判别。为此，本发明提出了一种检测EGFR基因突变检测试剂盒，不仅能检测出31种EGFR基因相关的突变，而且能通过对内参反应液后续的测序反应，在不经过电泳分析的情况下，对EGFR基因19号外显子不同的突变类型进行判别，并有可能发现新的突变。更重要的是，本发明提出了一种新型的对突变量的判断标准，通过检测的突变反应液和内参反应液的差值，对突变的量进行半定量的判断，从而指导临床用药。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种检测EGFR基因突变的引物和探针。本发明的第二发明目的在于提出含有该引物和探针的试剂盒。本发明的首要发明目的在于提出该试剂盒的使用方法。为了完成本发明的目的，采用的技术方案为本发明涉及一种检测人EGFR基因突变的引物和探针，其中，所述引物和探针的核苷酸序列为(I)用于检测18号外显子突变的引物和探针为由SEQ ID NO I所示的上游引物，由SEQ ID NO 2所示的下游引物和由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 27所示的探针；(2)用于检测19号外显子突变的引物和探针为由SEQ ID NO 4所示的上游引物，由SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 13所示的下游引物，由SEQ ID NO 14所示的探针;(3)用于检测20号外显子突变的引物和探针为由SEQ ID NO 15 SEQ IDNO 17所示的上游引物，由SEQ ID NO 18所示的下游引物，由SEQ ID NO 19所示的探针；
(4)用于检测21号外显子突变的引物和探针为由SEQ ID NO 20所示的上游引物，由SEQ ID NO 21所示的下游引物，由SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23所示的探针；(5)作为内参的引物和探针由SEQ ID NO 24所示的上游引物，由SEQ IDNO 25所示的下游引物，由SEQ ID NO 26所示的探针；其中，所述探针的核苷酸链的5’端标记有FAM，3’端标记有TAMRA。本发明的第一优选技术方案为所述的试剂盒的组成为所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和测序试剂，其中，所述的核酸扩增试剂包括表I :
权利要求
1.一种检测人EGFR基因突变的引物和探针，其中，所述引物和探针的核苷酸序列为 (1)用于检测18号外显子突变的引物和探针为由SEQID NO I所示的上游引物，由SEQ ID NO 2所示的下游引物，由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 27所示的探针； (2)用于检测19号外显子突变的引物和探针为由SEQID NO 4所示的上游引物，由SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 13所示的下游引物，由SEQ ID NO 14所示的探针； (3)用于检测20号外显子突变的引物和探针为由SEQID NO 15 SEQ ID NO 17所示的上游引物，由SEQ ID NO 18所示的下游引物，由SEQ ID NO 19所示的探针； (4)用于检测21号外显子突变的引物和探针为由SEQID NO 20所示的上游引物，由SEQ ID NO 21所示的下游引物，由SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23所示的探针； (5)作为内参的引物和探针由SEQID NO 24所示的上游引物，由SEQ ID NO 25所示的下游引物，由SEQ ID NO 26所示的探针； 其中，所述探针的核苷酸链的5’端均标记有FAM，3’端均标记有TAMRA。
2.一种含有权利要求I所述检测人EGFR基因突变的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的组成为所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和测序试剂，其中，所述的核酸扩增试剂包括
3.根据权利要求2所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述各组核酸扩增试剂中各成分的含量为含有6mmol/L引物各lul、4mmol/L探针各lul、5mM的dNTPsO. 5ul、10Xbuffer2. 5ul，加水至 21 μ I ;所述的 EGFR 酶液中含有 Taq 酶 5u/ 管、UNGO. 5u/ 管。
4.根据权利要求2所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的对照品包括
5.根据权利要求2所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的测序试剂包括
6.一种权利要求2 5所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒的使用方法，其特征在 于， (1)PCR荧光检测 a.样本处理提取人类基因组DNA;提取完的DNA-20°C保存； b.扩增试剂准备从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心IOs ;按每管21ul反应液和Iul酶液,分装于PCR反应管中； c.加样从对照品或样本处理液中分别取3ul，加至装有上述PCR反应混合液的离心管中，盖紧管盖、将其移至检测区； d.PCR扩增 ABI PRISM 荧光 PCR 检测仪扩增条件42°C,5min ；94°C,3min ;94°C，15sec ；60°C,60sec ;共40个循环；反应体系为25ul ;在PCR循环第二步60°C时收集荧光信号；检测通道为FAM-TAMRA，参比荧光设定为none ； Stratagene 突光 PCR 检测仪扩增条件42 °C，5min ；94 °C，3min ；94 °C，45sec ；60 °C，80sec ;共40个循环；反应体系为25ul ;在PCR循环第二步60°C时收集荧光信号；检测通道为 FAM ； e.检测用chromas2.23软件自动处理和分析数据； (2)EGFR基因19外显子测序检测对EGFR(exonl9)为阳性的突变标本，并且满足内参基因的(^值< 30、且相关基因与内参基因Ct值差值< I，对该标本进打测序。
7.根据权利要求6所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的检测结果的判定方法为 (I)、有效性判定 A.阴性对照有效性判定 对于 EGFR (exonl8) PCR 反应液管、EGFR(exon20)PCR 反应液管、EGFR(exon21)PCR 反应液管、内参基因PCR反应液管CT值均彡38或显示“Undet”判定为有效； 对于EGFR(exonl9) PCR反应液管CT值> 38或显示“Undet”判定为有效；或相关检测基因与内参基因Ct值差值> 10判定为有效； B.阳性对照有效性判定 对于EGFR(exonl8)反应液管、EGFR(exon20)反应液管、EGFR(exon21)反应液管Ct值均< 36判定为有效； 对于EGFR(exonl9)反应液管、内参基因反应液管(^值< 36，且相关检测基因与内参基因Ct值差值< 1，判定为有效；内参基因测序图清晰，判定enonl9为纯合缺失突变； (2)结果判定 A.PCR检测结果判定 对于EGFR(exonl8)反应液管、EGFR(exon20)反应液管、EGFR(exon21)反应液管 ①相关检测基因Ct值<38,且相关基因与内参基因Ct值差值< I ;判定该相关检测基因中有突变； ②相关检测基因Ct值<38，且相关基因与内参基因Ct值差值> I ;判定存在少量EGFR突变； ③相关检测基因Ct值彡38或显示“Undet”，且内参基因Ct值<38. O ;判定该相关检测基因中无突变或突变低于最低检出限； ④相关检测基因Ct值>38或显示“Undet”，且内参基因Ct值> 38或显示“Undet”;需增加取样量重新抽提后进行检测； 对于EGFR(exonl9)反应液管 ①相关检测基因Ct值>38或显不“Undet”,且内参基因Ct值〈38. O ;或标本的相关检测基因Ct值< 38，且相关基因与内参基因Ct值差值> 10 ;判定该相关检测基因中无突变或突变低于最低检出限； ②相关检测基因Ct值<38,且相关基因与内参基因Ct值差值< I ;判定该相关检测基因中有突变； ③相关检测基因Ct值<38，且相关基因与内参基因Ct值差值在I 10之间；判定存在少量EGFR (exonl9)突变； ④相关检测基因Ct值>38或显示“Undet”，且内参基因Ct值> 38或显示“Undet”;判定为需增加取样量重新抽提后进行检测； B.EGFR基因19号外显子突变测序检测结果判定 运行ChiOmas程序，对测序得到的序列进行分析首先删除不稳定的测序区域及内含子区域，然后将测序得到的序列与正常19外显子的氨基酸序列K745 P753进行对比，如果不存在缺失，则为野生型；反之，则为突变型。
全文摘要
本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法。本发明的试剂盒能检出含0.1-1％EGFR基因突变DNA的样本、对含10％EGFR19号外显子基因突变DNA样本，通过测序能准确分型；本发明的试剂盒灵敏度高，最低检出限为5拷贝基因，并能对EGFR基因突变的定性检测，给出不同的灵敏度参考范围，以帮助临床判断突变量的多少，确定最终诊疗方案能对不同突变。
文档编号C12N15/11GK102851375SQ201210334208
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者熊慧, 程新建, 谢立群, 陈嘉铮, 包文静, 陶慧卿, 丁璐, 徐任, 占闽宁, 杨青喜 申请人:上海源奇生物医药科技有限公司