一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域,具体地说涉及一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，多种传染性疾病困扰着我国的养殖业，抗生素自发现以来在预防细菌感染、防治畜禽疾病方面发挥了重要作用，对促进畜牧业生产的快速发展起到了巨大的推动作用，但长期大量使用抗生素类药物使得病原菌逐步产生耐药性，为疾病防治工作增加了 难度。同时，抗生素引发的药物残留使得动物性食品的安全性问题日益突出，耐药质粒容易交叉散播传给人类，给人类健康和疾病的预防与治疗带来威胁，为此，国际社会提出减少抗生素生长促进剂(AGP)使用量或取消某些抗生素的使用。从2006年I月开始，欧盟全面禁止食品动物使用抗生素类促生长饲料添加剂，并于3月成立预防抗生素抗药性扩大研究网，随后日本和韩国等发达国家也建立了相应的条例，国际奥委会也要求北京为2008年奥运会提供符合欧盟要求的抗生素含量极低的安全肉食品。寻求抗生素替代品，研制既能有效防控畜禽疾病、促进动物生长，又无毒副作用、无残留、不易产生耐药性的绿色兽药和饲料添加剂，已成为动物营养、食品加工、新兽药研发等领域内面临的重大课题。抗菌肽(antimicrobial peptide)是在诱导条件下,动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽具有高效、广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌(G_)、革兰氏阳性菌(G+)、真菌、原生生物、有被膜的病毒和肿瘤细胞均表现出较强的活性(Jenssen H, et al. PeptideAntimicrobial Agents. Clin Microbiol Rev, 2006，19 (3) :491_511)。而绝大多数抗菌妝对哺乳动物正常细胞无害，具有不同于传统抗生素的独特抗菌机制，而且对机体无毒副作用、无残留，这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题提供新途径，应用前景十分广阔。迄今已从包括动物、植物、昆虫、原核生物等多种生物体内分离、鉴定了千余种抗菌活性肽，有几十种抗菌肽已进入临床试验或临床前研究阶段。目前在家禽体内已发现了三大类抗菌肽，即防御素类(Gallinacin)、Cathelicidin类和肝内表达抗菌肽2 (LEAP-2)。从目前相关研究结果来看，鸡防御素在体外对多杀性巴氏杆菌及大肠杆菌、白色念珠菌、肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌等均有抑菌作用(Harwig S S，etal. Gallinacins: cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBSLett，1994，342(3):281-285;Evans E Wj et al. Antimicrobial activity of chicken andturkey heterophil peptides CHP1，CHP2，THP1，and THP3. Vet Microbiol, 1995，47(3-4):295-303)。
Cathelicidins类抗菌肽是最初被发现于哺乳动物的一类结构多变的抗菌肽，因其在信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidins在体外具有强的广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性，包括抗生素抗性菌，有的在50%血清和生理盐浓度下仍有杀菌活性。同防御素一样，Cathelicidins抗菌肽也是宿主防御系统的重要组成部分，但它们通常更耐盐和溶媒。除了主要的杀灭细菌、真菌和病毒活性外，Cathelicidins还具有对免疫细胞的趋化作用、抑制组织损伤、促进创伤修复、结合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能(Zaiou M, et al. Cathelicidins, essentialgene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med, 2002, 80(9):549-61;RamanathanB, et al. Cathelicidins:microbicidal activity, mechanisms of action, and roles ininnate immunity. Microbes Infect, 2002, 4(3):361-372 ；Carretero M, et al, In vitroand in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37.J Invest Dermatol, 2008, 128(1) :223-236.)。由于具有如此广泛的生物学活性和功能，Cathelicidinds抗菌肽已成为免疫学、分子生物学和生物医药领域内的研究热点，其药用开发前景十分广阔。然而，家禽体内天然抗菌肽的含量极低，分子量小，分离纯化困难，无法满足需要。 化学合成与基因工程方法就成为获得抗菌肽的主要手段，但化学合成抗菌肽成本太高，也难以应用于临床；因此，通过基因工程的方法在特定宿主内大量表达抗菌肽就成为一条有效的途径。但由于抗菌肽本身对原核宿主菌有一定的杀伤作用，不适宜在原核系统中直接表达，通常采用融合表达或真核表达等方式。大肠杆菌因其遗传背景清晰、易于培养、周期短、成本低廉而备受青睐，成为目前应用最为广泛的外源基因表达宿主之一，多种抗菌多肽通过融合形式在大肠杆菌表达系统中成功表达，产物经处理后可产生抗菌活性。

发明内容
本发明的目的在于提供一组具有很强抗微生物活性的鸡抗菌肽Cathelicidinl，3，本发明利用基因工程技术从白来航鸡的骨髓组织中克隆出Cathelicidins抗菌肽基因(CathL-1, -3)cDNA片段，并将其成熟肽编码序列克隆至pET_30a(+)等融合表达载体中，在E. coli Rosetta(DE3)表达菌株中重组表达融合蛋白并对其进行初步鉴定,表达产物以可溶形式存在，不需蛋白酶切割，经亲和层析方法即可制备一组具有很强抗微生物活性的鸡重组抗菌肽 Cathelicidinl, 3。本发明还公开了该组鸡Cathelicidins抗菌肽的氨基酸序列及编码所述鸡Cathelicidins抗菌肽的DNA序列。本发明同时提供了该组鸡Cathelicidins抗菌肽的基因工程制备方法和固相化学合成法。本发明还进一步公开了该组鸡Cathelicidins重组抗菌肽在制备治疗鸡细菌感染药物中的用途。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案本发明提供的一组Cathelicidins抗菌肽,是白来航鸡基因编码的抗菌肽,属于家禽Cathelicidins抗菌肽家族，它们的这一系列序列被命名为Cathelicidinl，3，其前体蛋白的氨基酸序列(从氨基端至羧基端)如下
Cathelicidinl (SEQ ID NO. 5)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu Gly TyrSer Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln ArgPro Glu Val Gln Asn Ala Phe Arg Leu LeuSer Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe Thr He Met GluThr Arg Cys Gln Ala ArgSer Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp Gly Leu Val Lys AspCys AlaAla Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys Val Asp Ser MetAla AspPro Val Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala GlyTyr Asn Leu Tyr Arg Ala IleLys Lys LysCathelicidin3 (SEQ ID NO. 10)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu GlyTyr Ser Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln ArgPro Glu Val Gln Asn Ala Phe ArgLeu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe Thr IleMet Glu Thr Arg Cys Gln Ala ArgSer Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp Gly LeuVal Lys Asp Cys Ala Ala Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys Val AspSer MetAla Asp Pro Val Arg Val Lys Arg Phe Trp Pro Leu Val Pro Val Ala He Asn Thr ValAla AlaGly He Asn Leu Tyr Lys Ala He Arg Arg Lys鸡抗菌妝Cathelicidinl 和 Cathelicidin3,其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO. I、和 SEQ ID NO. 6 所述。本发明的一组鸡Cathelicidins抗菌肽，其编码基因cathelicidinl, 3,来自于自成年白来航鸡骨髓组织中提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板，分别用3对基因特异性引物CathLl P1/P2和CathL3 P1/P2进行PCR，扩增产物即为cathelicidinl, 3cDNA全序列。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段(见图1)，将目的片段与克隆载体PMD18-T连接并转化E. coli DH5 α感受态细胞，阳性菌株用Μ13F/R引物测序，得到含cathelicidinl，3开放阅读框(ORF)的完整核苷酸序列，其ORF序列全长分别为447bp、456bp，其自5’端至3’端的序列详见序列表(SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 6)。本发明提供的一组鸡Cathelicidins抗菌肽，其制备方法可以是固相化学合成法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到表达载体上，然后导入特定的宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱法鉴定。本发明提供一种鸡抗菌肽Cathelicidinl，3高效的基因工程制备方法，主要通过以下步骤实现(I)将鸡抗菌肽Cathelicidinl和鸡抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的编码基因分别克隆到大肠杆菌融合表达载体pET30a ( + )中，得到融合表达载体pET30-CathLlS、pET30-CathL3S ；(2)将 pET30_CathLlS、pET30_CathL3S 质粒分别转化大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株，得到重组大肠杆菌基因工程菌株；(3)37°C下，在LB培养基中，诱导物IPTG浓度为I. Ommol/L的条件下，对上述重组大肠杆菌基因工程菌进行诱导表达3小时；(4)离心收集上述表达菌体，超声波破碎，分离细胞可溶组分与包涵体；(5) Ni2+-NTA Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白。其具体步骤为(I)采用RT-PCR方法从白来航鸡骨髓组织中扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidinl，3前体蛋白的核苷酸序列(cDNA序列)，将所述基因分别克隆至PMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5 α菌株，并进行序列测定；

(2) PCR方法扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidinl，3成熟肽的核苷酸序列，PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后与同样酶切的pET-30a(+)(或pET_32a(+))融合表达载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，小量提取质粒，应用PCR和质粒酶切的方法筛选阳性克隆,通过DNA测序验证插入片段阅读框的正确性,从而构建出原核表达载体。将构建的融合表达载体分别命名为pET30-CathLlS、pET30-CathL3S ；(3)将测序正确的重组表达质粒pET30-CathLlS、pET30_CathL3S分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，挑取阳性菌株接种至LB培养基中37°C培养8 12h。次日离心取菌体重悬至新鲜LB培养基中，待培养液OD6tltol值达到O. 5^0. 6时加入IPTG使其终浓度为
I.OmmoI/L，开始进行诱导；37°C继续培养4h，每隔I小时取样lmL。离心收集诱导培养后的菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，再加入裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH8. O, 50mmol/L NaCl, lmmol/LEDTA, 5%甘油，临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为lmmol/L)，冰浴中超声破碎菌体，每次破碎5s，间隔2s，功率600W，破碎lOmin。超声后12000r/min，4°C下离心IOmin,分离可溶组分与和包涵体,进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测。浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%。将pET-30a(+)质粒按同样方法进行转化、诱导表达，取3h诱导表达产物(上清)作为对照。Western Blot操作参照《分子克隆实验指南》中的方法进行。电泳后将SDS-PAGE凝胶中的条带电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗His单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗，DAB为显色底物进行Western-blot分析，鉴定表达产物。(4)融合蛋白表达条件优化与表达产物的亲和层析纯化通过采用高渗培养基(即LB/SB培养基)、低温(25°C或15 20°C )长时间诱导、调节诱导物IPTG的浓度等方法，抑制包涵体形成，提高表达产物中可溶性蛋白所占比例。试验证明，在25°C、IPTG浓度为I. Ommol/L的条件下诱导培养8小时，可溶性目的蛋白所占的比例较37°C条件下明显提高，利于下游纯化操作。按上述优化后的条件进行扩大培养和目的蛋白的诱导表达，取诱导后的菌体，力口入适量结合缓冲液，冰浴中超声波破碎菌体，分离包涵体和可溶组分，将裂解上清液上样于固定化金属配体亲和柱层析柱(Ni2+-NTA Sepharose 4B柱),样品经含O. I "O. 5mol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱，收集融合蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE检测。结果显示，洗脱液中目的蛋白在目标位置呈现单一条带，表明经亲和层析可获得纯度较高的融合蛋白，为成熟产物的获得创造条件。(5)采用标准琼脂孔穴扩散法(AWDA)检测重组鸡抗菌肽Cathelicidinl，3的对指示菌株的体外抑菌活性。
本发明的一组新的鸡抗菌肽Cathelicidinl, 3,还可方便地采用固相化学合成方法进行制备。从鸡Cathelicidinl抗菌肽核苷酸序列推导出其前体蛋白的氨基酸序列(Seq-Ι)，根据目前对鸡Cathelicidins类抗菌肽成熟肽酶切加工位点(弹性蛋白酶切割位点)的认识，即鸡体内弹性蛋白酶一般是从该基因第四个外显子编码氨基酸序列中的第一个缬氨酸(Val)位点进行切割加工，释放出有生物学活性的成熟肽的N-端；结合对信号肽与成熟肽间高度保守的Cathelin结构域肽段的分析，可以推断在其前体蛋白中，Arg123-Lys 148为鸡Cathelicidinl抗菌肽的成熟肽序列(Seq_4)。根据编码鸡Cathelicidinl抗菌肽的核酸序列推导出成熟抗菌肽的氨基酸序列，按照标准固相肽合成程序用全自动多肽合成仪合成其成熟肽序列(其N端至C端的氨基酸序列为Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala Gly Tyr AsnLeu Tyr Arg Ala He Lys Lys Lys,见序列表中Seq_4)。合成肽经反相-高压液相柱层析(RP-HPLC, Column X Bridge 4. 6X 250mm)脱盐、纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸系统洗脱，合成肽的样品纯度>95% (95. 4%)。采用电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子量为3142. 80，与理论分子量(3141. 86)基本一致。 本发明通过抑菌活性检测发现，利用Rosetta(DE3)/pET30a表达体系表达的重组Cathelicidins抗菌肽不需酶切等处理，对革兰氏阳性、阴性菌均有很好的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌C79-13、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、绿脓杆菌等标准菌株和临床分离菌株均有较强的抑制作用。与常规药敏试验结果比对发现，藤黄微球菌、大肠杆菌等标准菌株对试验中所使用的大多数抗生素类药物均耐药,而重组Cathelicidins抗菌肽对这些菌株却有明显的抑制效果。表明重组Cathelicidins抗菌肽对某些细菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超过传统抗生素。本发明通过抗菌肽Cathelicidinl对金黄色葡萄球菌急性感染抑菌活性的雏鸡试验显示，抗菌肽给予5. Omg/kg剂量，就能达到100%杀菌抑制率，而作为抑杀金黄色葡萄球菌的氨苄青霉素给予5. Omg/kg剂量未能达到明显的杀菌抑制率，表明本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染有很显著的杀菌效果，因此本发明抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物，尤其是应用于制备治疗金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等的药物。本发明抗菌肽同时还可以用于制备动物饲料添加剂和防腐剂。本发明的有益效果在于(I)本发明选择大肠杆菌/融合表达载体作为外源基因的原核表达体系，选择pET30a等融合表达载体，使鸡Cathelicidins抗菌肽获得高效表达，并避免表达产物对宿主细胞造成直接的杀伤性。(2)本发明提供的方法表达效率高，表达产物分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适用于大规模工业化生产，具有广阔的应用推广前景。(3)本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达鸡Cathelicidins抗菌肽，经实验证实该组抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的抑制作用。该组抗菌肽可应用于制备抗菌药物，或用于制备动物饲料添加剂和防腐剂。(4)与其它来源的碱性抗菌肽相比，该组抗菌肽还具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广等有益特点。


图I为PCR扩增白来航鸡Cathelicidinl，3抗菌肽基因产物的2%琼脂糖凝胶电泳图。在图I中，I为DL15000 DNA marker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为 15000，10000，7500，5000，2500，1000,250 ;2，4 分别为 Cathelicidin_l，-3cDNA序列的PCR扩增产物；图中5为DL2000 DNA Marker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为 2000，1000，750，500，250，100。图2为含鸡Cathelicidin-I, -3基因cDNA序列的阳性质粒pMD-CathL酶切后2%琼脂糖凝胶电泳图。图2中I为λ-EcoTH I digest DNA marker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为 bp)分别为 19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ；2 为质粒pMD-CathLl/EcoR I+Hind III 双酶切后条带，3 为质粒 pMD-CathLl/EcoR I+Not I 双酶切后条带,6为质粒pMD-CathL3/EcoR I+Hind III双酶切后条带，7为质粒pMD_CathL3/EcoRI+Not I双酶切后条带，8为DL2000 DNA marker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为 2000，1000，750，500，250，100。图3为重组表达质粒pET30_CathLS酶切后I. 5%琼脂糖凝胶电泳图。图3中I为X-EcoT14 Idigest DNA marker,其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ;2 为质粒 pET-30a Sma I+Xba I 双酶切后条带；3为质粒pET30-CathLlS Sma I+Xba I双酶切后条带；5为质粒pET30_CathL3SSma I+Xba I双酶切后条带。图4为鸡抗菌肽Cathelicidinl，3成熟肽片段融合表达载体pET30_CathLS的构建示意图。在图4中，5. 5Kb代表构建的融合表达载体pET30-CathLS大小为5. 5Kb ；P1, P2分别代表Cathe I i c i din I，3cDNA序列克隆所用的上、下游引物；MCS代表多克隆位点；LacZ代表β-半乳糖苷酶的编码基因；LacI代表Iac阻抑物的编码基因；CathL代表连接插入克隆载体的Cathelicidinl, 3cDNA序列；CathLS代表连接插入表达载体的Cathelicidinl, 3成熟肽编码序列；Amp代表氨苄青霉素抗性基因位点；Kan代表卡那霉素抗性基因位点；pUCorigin, fl origin, pBR322 origin 均代表复制起始位点。图5为SDS-PAGE及Western-Blot分析鸡Cathelicidinl, 3成熟肽融合蛋白的表达产物图。其中，左侧是SDS-PAGE电泳图，右侧是Western blot图。泳道I，I’是空载体转化菌株Rosetta(DE3)/pET30a IPTG诱导3h菌体经超声破碎后可溶性蛋白；泳道2，2’是预染低分子量标准蛋白质Marker，其中各蛋白片段的分子量分别为117，85，48，34，26，19kDa，KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；泳道3，3’是Rosetta (DE3)/pET30-CathLlS菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后可溶性蛋白；泳道4，4’是Rosetta (DE3) /PET30_CathLlS菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后包涵体蛋白；泳道7，7’是Rosetta (DE3) /pET30_CathL3S菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后可溶性蛋白；泳道8，8’是Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后包涵体蛋白。图6.固相化学合成鸡抗菌肽Cathelicidinl的反相-高压液相(RP-PHLC)色谱图。图7.固相化学合成鸡抗菌肽Cathelicidinl的质谱(ESI-MS)图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法如Sambrook等编著的《分子克隆实验室指南》(Molecular cloning:A laboratorymanual, 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)中所述的条件进行，或按照制造厂商提供的说明书进行。具体实施例中所使用的工具酶和其他试剂RNAiso Plus总RNA提取试剂、Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase Η-)、核糖核酸酶抑制剂-RNAsin、Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、PMD18-T Vector、T4DNA连接酶除特别指明外均为TAKARA公司产品；鼠抗His单克隆抗体均购自Tiangen公司；UNIQ_10柱式质粒小量抽提试剂盒和UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒均为上海生工产品；IPTG为BBI公司产品；HRP标记羊抗鼠IgG为SouthernBiotech公司产品；预染蛋白质分子量标准为Fermentas (MBI)公司产品；金属螯合层析树脂Ni2+-NTA S印harose4B购自北京鼎国公司；细菌培养用TMP、TSA等固体培养基为青岛高科园海博生物技术公司产品，按说明书提供方法制备；常规药敏试纸片为杭州天 和微生物试剂有限公司产品，其他试剂均为进口或国产分析纯。实施例I :鸡Cathelicidinl，3抗菌肽完整编码基因的克隆及测序测定分析，具体包括I.引物的设计根据GenBank中发表的原鸡Cathelicidins类抗菌妝基因序列(DQ092350,DQ092353)和PCR引物的设计原则，并借助计算机软件DNASTAR进行辅助分析，设计了三对PCR基因特异性引物分别用于扩增鸡Cathelicidinl，3编码基因的cDNA序列，引物分别为表中CathLl Pl/P2、CathL3 P1/P2，其中Pl为正向引物，P2为反向引物。引物均由上海博尚公司合成。本实施例和实施例2中所用的引物序列如表I所示。在CathLlS F/R，CathL3S F/R引物对中，下划线处的碱基分别代表在上下游引物中引入的EcoR I、Xho I限制性内切酶位点。表I鸡Cathelicidins类抗菌肽基因扩增所用引物
pPll名称引物序列(5, ^ T)SEQID NO.
CathLi Pl5'-tgg gca egg ggt gag gat-3'Il
CathLl P2__S'-ctg ggg atg ttt cac ttc ttc-3'__12_
CathL3 Pl5-atg ctg age tgc tgg gtg c-3'13
CathL3 P2__5-tea ttt tct cct gat ggc ttt gta g-31__14_
CathLlS F 5'-ca GAATTC cgcgtcaagcgcgt-3'15
CathLlS R__5' -ac CTCGAG tcacttcttcttgattgccc-3'__16_
CathUS F 5-caGAATTC cgcgtcaagcgc ttc-3 * 17 I CathL3S R__5'-gcCTCGAG tcattttctcctgatggc-31__18_注下划线处碱基分别为在上下游引物中引入的EcoR I, Xho I限制性内切酶位点。2.鸡Cathelicidinl, 3抗菌肽基因cDNA序列的克隆
(I)鸡骨髓组织总RNA提取(以下实验所用器具和试剂均经过处理，无RNase):提取过程按试剂说明书进行操作。无菌采集I月龄白来航鸡腿骨新鲜骨髓(lg)，将其加入含ImL RNAiso Plus细胞裂解液(TAKARA公司产品)的玻璃匀浆器中，置于冰浴中匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。将匀浆液转移至2ml离心管于室温下作用IOmindPARNAisoPlus 1/5体积量(200yL)的氯仿，用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后，再于室温下静置5分钟；于4°C，12000 Xg条件下离心15min ;从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的2ml离心管中(切忌吸出白色中间层)；向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，于-20°C下静置20min ;4°C，12000X g下离心15min ;小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000Xg，4°C离心5分钟后小心弃去乙醇；室温干燥沉淀2 5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，即可得到鸡骨髓细胞总RNAJt RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。(2) cDNA第一链的合成(mRNA反转录)
首先在O. 2mL微量离心管中按照下列反应体系进行反转录反应合成cDNA。在20μ L 反应体系中分别加入以下组分5XRT Buffer 4. O μ L, dNTP (IOmM each) 2. 0 μ L,25mM MgCI2 0. 8 μ L，RNA 酶抑制剂 Rnasin O. 5 μ L ( 20U)，引物 Ρ2 (CathLl Ρ2 或 CathL3Ρ2，20 μ M)l. O μ L，细胞总RNA 10. 7 μ LCl μ g)，将上述反应混合物于台式离心机上稍作离心，然后在PCR仪上按下列反应条件进行反转录反应70°C保温5min后迅速置于冰上急冷2min ;短暂离心后，在反应体系中加入 Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase H-) I. O μ L,混匀后在PCR仪中完成以下程序于42°C反应60min，95°C变性2min后结束反应，将获得的cDNA溶液贮存于_20°C备用或直接用于下一步PCR扩增。(3)鸡Cathelicidins基因的PCR扩增与克隆筛选以获得的cDNA第一链产物为模板，进行cDNA第二链合成。按照下列反应体系进行10XPCR Buffer 5. O μ L, 25mmol/L MgCl2 I. 4 μ L，引物 Pl (CathLl Pl 或 CathL3 PI,20 μ Μ) I. O μ L, RT 产物 10 μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 6 μ L,补加 ddH20 至总体积为 50 μ L。在PCR仪上设置下列反应程序95°C预变性3min，I个循环；94°C 30S,54°C 30S，72°C 30S，30个循环后以72°C延伸IOmin结束反应，4°C保存。取5 10 μ LPCR产物进行2%琼脂糖凝胶-TAE电泳，检测目的条带，结果如图I所示。将PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收并纯化(按凝胶回收试剂盒说明进行)目的片段后，与PMD18-T克隆载体连接；热激法转化CaCl2法制备的大肠杆菌DH5 α感受态细胞，离心取转化后菌液均匀涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基平板上，37°C培养过夜。次日挑取单菌落，振荡培养后，碱法小量提取质粒(按质粒小量抽提试剂盒说明书操作);通过利用引物CathLl Pl/P2、CathL3 P1/P2分别进行PCR检测及质粒限制性酶切鉴定的方法筛选阳性克隆(如图2所示)，并将阳性质粒命名为pMD-CathLl和pMD-CathL3。将鉴定的阳性菌株寄至上海博尚公司测序，测定的DNA序列用Blast程序进行同源性检索，并进行序列比对分析。4.鸡cathelicidins基因的序列测定和结果分析取鸡Cathelicidins cDNA 克隆使用 M13 F/R 引物测序,得到 Cathelicidinsl, 3前体蛋白编码基因的完整核苷酸序列。基因的测序结果如序列表所示。
序列测定结果表明，克隆的Cathelicidin-Ι，_3基因开放阅读框(ORF)大小分别为447bp，456bp，分别编码包含148、151个氨基酸残基的前体蛋白，其中N末端的17个氨基酸残基为信号肽序列，中间部分105个氨基酸残基构成Cathelin结构域，C端的26、29个氨基酸残基分别组成Cathelicidin-I, -3抗菌肽的成熟肽。序列比对分析发现，克隆的白来航鸡Cathelicidin-Ι基因序列与参考序列(Fowlicidin-1, GenBank 登录号 DQ092351) ORF 完全一致。与乌骨鸡 Cathelicidin-I(GenBank登录号FJ938357)0RF序列相似性为99. 6%，只有432位一个碱基差异，前者为A，后者为G。推导的氨基酸序列相似性为100%。克隆的白来航鸡Cathelicidin-3基因序列与参考序列(Fowlicidin_3, GenBank登录号DQ092353) ORF序列相似性为99. 6%，在168、420位各存在I个碱基差异，前者分别为A、G，后者分别为G、A。氨基酸序列相似性为100%ο SPF鸡Cathelicidin-3 ORF与乌骨鸡Cathelicidin-30RF (GenBank登录号FJ938359)核酸序列相似性为99. 8%，在168位存在I个碱基差异，前者为A,后者为G。氨基酸序列相似性为100%。序列分析表明，不同品种来源的鸡Cathelicidins抗菌肽基因在核苷酸序列上存在微小的差异，氨基酸序列相差甚微，从而表明Cathelicidins抗菌肽基因在进化中是高度保守的。实施例2 重组鸡Cathelicidins抗菌肽融合蛋白的基因工程制备方法，包括以下步骤
I.鸡Cathelicidinsl, 3成熟肽编码序列的的制备及其融合表达载体的构建(I)鸡Cathelicidinsl, 3成熟肽编码序列的的扩增根据已克隆的鸡Cathelicidinsl, 3抗菌肽基因序列和推导的氨基酸序列,设计3对带有酶切位点的特异性引物CathLlS F/R，CathL3SF/R，下游引物带有终止密码子TGA，引物序列见表I。分别以含鸡 Cathelicidin-I, -3 基因 cDNA 序列的阳性质粒 pMD-CathLl, pMD_CathL3 为模板，用 PCR方法扩增鸡Cathelicidinsl, 3成熟肽编码序列( lOObp)。反应体系为10X PCR Buffer (含 Mg2+) 5. O μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4. O μ L，引物F (CathLlF 或 CathL3 F，20 μ Μ) I. O μ L，引物 R (CathLl R 或 CathL3 R, 20 μ Μ) I. O μ L，pMD-CathL (pMD-CathLl 或 pMD_CathL3)质粒 DNA O. 5 μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，补加ddH20 38 μ L，总体积为50 μ L。混匀后在PCR仪上按照下列程序进行反应95°C预变性3min，l 个循环；94°C 30S，55°C 30S，72°C 30S，30 个循环后以 72°C延伸 IOmin 结束反应，4°C保存。将所有PCR反应液进行2%琼脂糖凝胶-TAE电泳，并用生工公司的凝胶回收试剂盒回收特异性片段。PCR产物经切胶回收后，溶于适量EB洗脱液。(2)预连接DNA片段的制备将上步中回收产物用EcoR I和Xho I进行双酶切。酶切反应体系具体为10X酶切反应缓冲液H IOyL, PCR回收产物35 μ L，限制性内切酶EcoR I 3. O μ L，Xho I 3. O μ L，双蒸水49 μ L，总反应体积为100 μ L。将反应液置于37°C水浴中反应3h。将酶切反应液转移至一新的I. 5ml离心管中，补加TE缓冲液(lOmmol/LTris-HCl, lmmol/L EDTA, pH8. 0)至总体积为500 μ L ;加入等体积的苯酚/氯仿(体积比为25 24)蛋白抽提液，充分振荡混匀；于41，12000 Xg条件下离心IOmin ;小心吸取上层无机相，转移至一新的离心管中；加入2. 5倍上清液体积的无水乙醇，于-20°C下静置30min ；4°C，12000 X g下离心15min ;小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml洗涤离心管管壁，12000 X g，4°C离心5分钟后小心弃去乙醇；室温干燥沉淀5 10分钟，加入适量的TE缓冲液溶解沉淀，即得到含有与处理好的pET-30a(+)线性载体相互配对的粘性末端的预连接成熟肽编码片段。(3)线性化表达载体的制备取保存的DH5 a /PET_30a(+)原核表达载体转化菌株，振荡培养后，小量提取质粒。取pET-30a(+)质粒用EcoR I和Xho I进行双酶切。酶切反应体系为10X酶切反应缓冲液H8yL，pET_30a(+)质粒20 μ L，限制性内切酶EcoR I
3.O μ L，Xho I 3. O μ L，双蒸水46 μ L，总反应体积为80 μ L。37°C水浴中3h酶切反应完全后，将反应液进行1% (W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳后，用凝胶回收试剂盒回收特异性片段，处理好的载体具有EcoR I和Xho I的粘性末端，贮存于_20°C待用。(4) Cathelicidinsl, 3成熟肽片段融合表达载体的构建、转化与鉴定

将经上述一系列处理后带有相同粘性末端的pET_30a(+)原核表达载体与含有Cathelicidinsl, 3成熟肽编码序列的DNA片段进行体外连接,反应体系如下
10xT4 DNA Ltgase Buffer2pL
Cathelicidins I，3 成熟肽编 1 片段 14pL线性化表达载体3PL
T4 DNA LigaseΙμ
总反应体积2_L16°C反应过夜；次日将连接反应液全部转化至JM109感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素(100yg/ml)的LB琼脂平板上培养过夜。次日挑取单菌落，振荡培养后，小量提取质粒，利用CathLlS F/R，CathL3S F/R引物对，以质粒为模板，按照前述PCR检测和质粒酶切方法鉴定阳性克隆菌株。将阳性菌株寄至由上海博尚公司进行核苷酸序列测定，测序结果表明编码Cathelicidins成熟蛋白基因正确地插入到原核表达载体的目的位点，且各段核苷酸序列的开放阅读框(ORF)连续，即得到重组表达质粒，将其分别命名为pET30-CathLlS、pET30_CathL3S。重组表达质粒pET30_CathLS的酶切分析结果见图3，融合表达载体的构建过程详见图4。2.鸡CathelicidinSl，3成熟肽片段在大肠杆菌中的诱导表达与表达产物鉴定Rosetta(DE3)是Novagen公司用于pET系列原核表达载体表达外源蛋白的受体菌株，Rosetta宿主菌是从BL21衍生而来的λ DE3溶原菌，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核基因在原核系统中的的表达水平。该菌株的基因型为F_ omp T hsdSB(rBmB_)galdcm lac Yl (DE3) pRARE (argU, argff, ileX, glyT, leuff, proL) (CmE)。将 pET30_CathLS 重组表达质粒转化Rosetta(DE3)受体菌株,可获得重组表达Cathelicidinsl, 3成熟肽融合蛋白的工程菌 Rosetta (DE3) /pET30_CathLS。(I)表达重组融合蛋白的工程菌Rosetta (DE3) /pET30_CathLS的构建I)取前述经鉴定正确的融合表达质粒pET30_CathLlS、pET30_CathL3S和pET-30a(+)空质粒O. 5 μ L，用热激法分别转化CaCl2法制备的Rosetta (DE3)宿主感受态细胞，取200 μ L转化后菌液均匀涂布于含100 μ g/mL卡那霉素(kana)的LB琼脂平板上，37 °C培养过夜。2)次日，挑取阳性克隆接种至4ml LB培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)中进行液体培养，37°C振荡培养8h后，取少量菌液，分别利用CathLlS F/R，CathL3S F/R引物对进行PCR检测确定转化成功的菌株(PCR方法、条件如前所述)。将成功转化的工程菌命名为Rosetta(DE3)/pET30_CathLS (分别为 Rosetta(DE3)/pET30_CathLlS 和 Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S)，菌株在含15%甘油的LB培养基中于_80°C保存。(2) Cathelicidinsl, 3成熟肽融合蛋白的小规模诱导表达I)分别取构建好的工程菌 Rosetta(DE3)/pET30_CathLlS、Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S的单菌落，接种至4ml LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)中37°C振荡培养8 12h ;2)将菌悬液于4°C保存过夜,次日离心取菌体,重悬于50mL含100 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中；3)37°C振荡培养3h左右至培养液OD6tltlnm值达到O. 5^0. 6，先取出ImL培养物作为诱导前对照，在余下培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)贮存液(500mmol/L)至终浓度为I. Ommol/L进行诱导；4)37°C继续培养4h，每隔I小时取ImL培养液；离心收集诱导后的菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，按ImL菌液离心后加入IOOuL裂解缓冲液的比例，加入冰预冷的裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH8. O, 50mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA, 5%甘油，临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为lmmol/L)重悬菌体，冰浴中超声破碎菌体，每次破碎5s，间隔2s，功率600W，破碎IOmin。5)超声后菌体裂解液于12000Xg，4°C下离心lOmin，分离可溶组分与和包涵体，
进行下一步鉴定。6)同时取pET_30a(+)空质粒转化的Rosetta(DE3)菌株为对照，按照上述条件进行诱导培养和菌体裂解。(3) Cathelicidinsl, 3成熟肽表达产物的鉴定通过表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与蛋白质免疫印迹分析(Western Blot检测),对融合蛋白进行初步鉴定。SDS-PAGE检测融合蛋白的表达I)凝胶的配制参照《分子克隆实验指南》中的配方和方法制备15%分离胶和5%浓缩胶；2)样品处理取上述待分析鉴定的蛋白质样品，加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液，100°C水浴煮沸5min ；3)加样将电泳槽内加入IXTris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/LTris-HCl, pH8. O, 250mmol/L甘氨酸，O. 1%SDS, pH8. 3)，小心拔去点样梳，然后用注射器吹打加样孔。用微量加样器分别吸取待分析样品，根据蛋白浓度和加样孔体积决定加样量；4)电泳开始用低电压80V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂前沿进入分离胶后，提高电压至120V电泳，直至溴酚蓝迁移至分离胶底部后，停止电泳；
取出凝胶，考马斯亮蓝染色、脱色后扫描分析。5)染色轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，用至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液(O. 25g考马斯亮蓝R-25溶于含45%(V/V)甲醇、10%(V/V)乙酸的溶液中)浸泡凝胶，置于平稳脱色摇床上室温缓慢振荡染色2h ；6)脱色换掉染色液，用脱色液(10% (V/V)乙酸溶液)浸泡凝胶，缓慢摇动4 8h，其间更换3 4次脱色液，直至背景干净，条带清晰为止。7) SDS-PAGE分析表明，Cathelicidin-1，3成熟肽片段均能成功表达，表达产物以可溶组分和包涵体两种形式存在，但2段基因的表达量有所差异，其中Cathelicidin-3的表达量较Cathelicidin-Ι产物高些。2种表达产物的表观分子量约为12kDa。而空载体转化对照组无相应蛋白条带，结果见图5。蛋白质印迹分析(Western-Blot检测)I)目的蛋白的电转移(湿式转移)①按前述方法将诱导表达蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；
②SDS-PAGE电泳结束后，小心取出凝胶，浸泡在转膜缓冲液中平衡5 IOmin ；③将滤纸、硝酸纤维素膜(NC)剪成与凝胶同样大小，将NC膜在蒸馏水中浸泡5min以消除气泡，再将NC膜、滤纸、吸水海棉层等浸入转移缓冲液中平衡lOmin。将NC先浸入蒸馏水中10-20min，再浸入转移缓冲液中平衡30min。④转膜戴上手套按如下方法安装好电转移装置(北京六一厂)将黑色多孔塑料夹放在最底层，再按自下而上的顺序依次放置吸水海棉层、多层滤纸、凝胶、NC膜、多层滤纸、海棉层、无色多孔塑料夹，滤纸、凝胶、NC膜要精确对齐，用一试管或玻璃棒在每层表面缓慢移动，以除去凝胶和NC膜、滤纸之间的气泡；合拢好电转印夹放入转移槽中(黑的靠黑的，白的靠红的)，加满转移缓冲液；正确连接电极，即凝胶朝向阴极，NC膜朝向阳极，使凝胶上的蛋白质向NC膜印迹转移；200mA恒流(电压IOOV左右)，加冰条件下电转移3h。起始电流应小于250mA，结束电流不应超过400mA。2)免疫标记①从电转移槽中取出NC膜，用TBS缓冲液洗膜2次，以除去NC膜上的凝胶。将NC膜装入一可加热封接的塑料袋中，加入封闭液(3%脱脂奶粉溶于TBS)，放在平缓摇动的摇床上封闭3h ；②封闭结束，将膜转移至新的可加热封接的塑料袋中，按O. lmL/cm2的量加入封闭液和适量的第一抗体(鼠抗His单克隆抗体，1:1000稀释于封闭液中)，封口，4°C温和振摇过夜；③剪开塑料袋，用约200mL TBST漂洗液洗膜3次，每次lOmin，以除去过量的一抗；④将膜转入另一塑料袋，加入溶于二抗稀释液的羊抗鼠IgG-HRP 二抗(I :3000稀释，7uL羊抗鼠IgG-HRP稀释至21mL)，封口，室温下平缓摇动f 2h ；⑤取出NC膜，用大量TBST漂洗液洗膜Γ5次，每次lOmin，以除去未结合的二抗；⑥最后再用TBS洗膜一次，去除Tween-20。3)免疫染色将NC膜转入适量新鲜配制的DAB显色液(临用时加入H2O2)中，置暗处反应，待蛋白条带颜色深度达到要求时(显色反应达到最佳程度，约疒3min)，立即用双蒸水洗涤终止反应，将膜晾干保存。Western-Blot检测所用各缓冲液的配制方法如下I.转移缓冲液39mmol/L 甘氨酸，48mmol/L Tris-HCl, O. 037%(ff/V) SDS, 20%(V/V)甲醇；配制IL转移缓冲液需称取2. 9g甘氨酸，5. 8g Tris-base,0. 37g SDS，并加入200mL甲醇，加水至总量为1L。2.封闭液3%(W/V)脱脂奶粉，O. 02%叠氮钠，溶于TBS ；3.漂洗液 I-TBS 缓冲液(150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-Cl，ρΗ7· 5)；漂洗液II -TBST 150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-Cl, pH7. 5,0. 02%Tween-204. 二抗稀释液(3% 脱脂奶粉，150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-HCl, pH7. 5)5.显色液 DAB (3. 3-diaminobenzidine, 3. 3_ 二氛基联苯胺)配制7. 5mg DAB 溶于IOmL TBS buffer中，临用时加入30%H202 IOyL (临用时现配)，混匀后立即使用。SDS-PAGE 和 Western-blot 分析表明，Cathelicidin-l, 3 成熟妝片段均能成功表达，表达产物以可溶组分和包涵体两种形式存在，但3段基因的表达量有所差异，其中 Cathelicidin-3的表达量较Cathelicidin-Ι产物高些,诱导后产生较为清晰的特异条带，而空载体转化对照组无相应蛋白条带。2种融合蛋白表达产物的表观分子量约为12kDa(结果见图5)。实施例3:Cathelicidins融合蛋白表达条件优化与表达产物的亲和层析纯化I.融合蛋白表达条件优化为提高可溶性组分在表达总蛋白中所占比例，通过降低诱导温度(降至25°C或15^200C )，延长诱导时间(3h 8h)，调节诱导物浓度(IPTG分别浓度为O. 4mmol/L, O. 8mmol/L, I. Ommol/L, I. 2mmol/L)等方法,来抑制包涵体的形成,从而简化纯化操作。通过采用高渗培养基(即LB/SB培养基)、低温(25°C或15 20°C )长时间诱导、调节诱导物IPTG的浓度等方法，达到抑制包涵体形成、提高表达产物中可溶性蛋白所占比例的目的。试验证明，在25°C、IPTG浓度为I. Ommol/L的诱导条件下，可溶性目的蛋白所占的比例较37°C条件下明显提高(图略)，利于下游纯化操作。2.融合蛋白表达产物的亲和层析纯化His标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA Resin)是用于纯化带有6XHis标签重组蛋白的一种纯化介质，该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力，可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6XHis标签重组蛋白。6XHis可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液温和的洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。本发明利用Ni2+-NTA Sepharose 4B亲和层析纯化介质，在非变性条件下纯化出高纯度的Cathelicidins融合蛋白。操作如下(I)蛋白质样品制备I)取成功表达 Cathelicidins 融合蛋白的工程菌 Rosetta (DE3) /pET30_CathLS,于LB/Kan琼脂平板上划线分离单菌落。2)取单菌落接种至4ml LB液体培养基(含100 μ g/mL Kan)中37°C振荡培养8 12h ；3)离心取菌体，重悬于200mL含100 μ g/mL Kan的新鲜LB培养基中扩大培养，37°C振荡培养至培养物OD6tltlnm值达到0. 5^0. 6时，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)贮存液(500mmol/L)至终浓度为I. 0mmol/L进行诱导，按上述优化后变动条件进行诱导；4)离心收集菌体，按照每IOOmL培养物的菌体沉淀悬于4mL结合缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, pH8. 0, 500mmol/L NaCl)的比例加入适量结合缓冲液；5)将菌体悬浮起来，加入溶菌酶至终浓度lmg/mL，混匀，冰上放置30min，超声或匀浆破碎细胞，再将混合物于4°C摇床上孵育lOmin。6)加入 Triton X_100、DNase (5U/μ L)和 RNase (10mg/mL)，至终浓度分别为 1%、5U/mL和5 μ g/mL,再于4°C摇床上孵育lOmin。7) 12000r/m (2 0，000xg以上)，4°C离心15min以上。去掉不溶性细胞碎片，将上
清(细胞裂解液)转移到另一个新管中，置于冰上备用或_20°C保存。(2)融合蛋白的亲和层析纯化及洗脱I)柱床准备轻轻颠倒混匀固定化Ni2+-NTA树脂，将其装入合适的层析柱内，树脂自然沉降，用3倍柱床体积的无菌水冲洗树脂，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡树脂，放置待用；2)将上步处理好的上清样品经O. 45 μ m微孔滤膜过滤后上样于平衡好的Ni2+-NTASepharose4B亲和层析柱内，流速控制在15mL/h 20mL/h,收集穿透部分,用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况；3)用5倍柱床体积的结合缓冲液洗柱，流速控制在30mL/小时左右，以去除未结合的蛋白和菌体的其他可溶性成份；4)用 4 倍柱床体积的洗漆缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, pH8. O, 500mmol/LNaCl, 50mmol/L咪唑)洗柱，进一步洗去非特异结合的蛋白成分，直至流过液OD28tlnm <0. 01 ；5)在勻速磁力搅拌下,利用梯度混合仪制备含O. Imol/L 0. 5mol/L线性咪唑浓度梯度的洗脱缓冲液(结合缓冲液中咪唑浓度由O. lmol/L至0. 5mol/L线性递增)；6)用5倍柱床体积的咪唑梯度洗脱缓冲液洗脱结合的目的蛋白，按每份ImL分步收集，并监测OD28tlnm ；7)再用3倍柱床体积的含高浓度咪唑(lmol/L)的洗脱缓冲液洗柱，将与柱床结合的蛋白充分洗脱下来；8)取20 μ L等份的洗脱蛋白进行15%SDS_PAGE检测，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况；9)将含有目的蛋白的洗脱液装入处理好的透析袋内，于4°C透析12 16h，其间更换数次透析液(透析液为50mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L NaCl, pH7. 6)，以除去目的蛋白溶液中的咪唑成分；10)再将透析袋置于烧杯中，包埋于适量固体聚乙二醇(PEG)-20000中，4°C浓缩至适当体积，冲洗透析袋，去除残留PEG。可将样品冻干保存并作进一步分析。收集的融合蛋白洗脱峰经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色，显示洗脱液中目的蛋白在目标位置呈现单一条带，表明经亲和层析可获得纯度较高的融合蛋白，为大规模利用基因工程手段制备重组抗菌肽创造条件。SPS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色可见，经纯化后得到分子量为12kD的单一条带。(11) Ni2+-NTA Sepharose 4B 树脂的再生Ni2+-NTA树脂在使用若干次数(3-5次)后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱内，在等上一再生溶液流干再加下一再生溶解。需要配制以下再生溶液Stripping Solution 1:6M GuHCl, O. 2M acetic acidStripping Solution 11:2%SDSStripping Solution III:IOOmM EDTA, pH8. 0Ni Charging Solution:IOOmM NiSO4还要准备25%，50%, 75%, 100% (V/V)乙醇和去离子水等。Ni2+-NTA的再生步骤如下 I)从层析柱下端流干所有溶液,用2倍NTA树脂体积的Stripping Solution I洗。2)用2倍体积的去离子水洗。3)用 3 倍体积的 Stripping Solution II洗。4)用I倍体积的25%乙醇洗。5)用I倍体积的50%乙醇洗。6)用I倍体积的75%乙醇洗。7 )用5倍体积的100%乙醇洗。8)用I倍体积的75%乙醇洗。9)用I倍体积的50%乙醇洗。10)用I倍体积的25%乙醇洗。11)用I倍体积的去离子水洗。12)用 5 倍体积的 Stripping Solution III 洗。13)用3倍体积的去离子水洗。14)如果立即使用，用5倍体积的Ni Charging Solution洗,再用10倍体积的结合缓冲液平衡层析柱。15)如需长期储存，加入I倍体积的20%乙醇，4°C保存，使用前需要执行步骤14，并重新装柱。实施例4 :鸡Cathelicidinl抗菌肽的固相化学合成方法根据编码鸡cathelicidin抗菌肽基因推断的Cathelicidinl成熟肽氨基酸序列，按照标准固相肽合成程序人工合成鸡Cathelicidinl抗菌肽CATH1 (Arg Val Lys ArgVal Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala Gly Tyr Asn Leu Tyr Arg Ala HeLys Lys Lys),合成肽经反相-高压液相柱层析(RP-HPLC, Column:X Bridge 4. 6X250mm)脱盐、纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸系统洗脱(Pump A 0. 065% trifluoroacetic in100%water ；Pump B :0.05%trifluoroacetic in 100%acetonitrile),米用电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子量。抗菌肽合成由南京金斯瑞生物科技有限公司(GenscriptCo.，Ltd. Nanjing, China)完成，样品纯度 >95% (为 95. 4%)，其 HPLC 图如图 6 所示；其 ESI质谱分析图见图I。其理论分子量为3141. 86，实测分子量为3142. 80，基本一致。将合成的Cathelicidinl抗菌肽溶于灭菌双蒸水,用于活性检测。实施例5 :重组鸡抗菌肽Cathelicidinl，3的抑菌活性检测米用标准琼脂孔穴扩散法(AgarWell Diffusion Assay, AffDA) (Parente E, etal. A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity. JMicrobiol Methods, 1995，22(1) :95-108)检测重组鸡抗菌肽Cathelicidinl，3 的体外抑菌活性，并与传统抗生素进行比对。抑菌试验所用的指示菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003;ATCC6538)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is CMCC 63501 )、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus CMCC 63501)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus CMCC 28001)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli CMCC44102;ATCC 8099)、鸡白痢沙门氏菌(SalmonellapuIlorum CVCC533, C79-13)、白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida CVCC474，C48-7)等为标准菌株，均购自中国兽医药品监察所；大肠埃希氏菌K12D31菌株(CGSC#5165)由耶鲁大学菌种保藏中心(大肠杆菌菌株库)赠送;魏氏梭菌(Clostridieum welchii)、血清I型、II型鸭疫里默氏杆菌(Riemerellosisanatipestifer)、绿胺杆菌(Pseudomonas aeruginosa),奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、亚利桑那菌(Salmonella arizonae,亚利桑那沙门氏杆菌)、甲型副伤寒沙门 氏菌(Salmonella paratyphi A)等为临床分离、鉴定菌株均由山东省禽病诊断与免疫重点实验室保存。具体步骤如下I.重组Cathelicidins抗菌肽体外抑菌活性检测抑菌活性测定采用标准琼脂孔穴扩散法将上述标准菌株和临床分离菌株接种于5mL新鲜LB液体培养基中，37°C培养过夜；再以1%接种量转接于5mL新鲜LB中，37°C继续振荡培养2. 5tT3h至对数生长中期；离心收集菌体，用预冷的IOmM磷酸盐缓冲液(PBS, pH7. 4)洗涤一次，并调节OD6tltl至O. 4^0. 6 ;分别取处于对数生长期的各标准菌株和临床分离菌株悬浮液(OD6tltl ^ O. 5)200 μ L，与45°C的TSA固体培养基20mL混匀后，到入90mm平皿中，待其凝固后，用灭菌的打孔器(微孔直径为4_)打孔；每孔分别滴加40 μ L待测样品，30°C培养过夜，以同体积的pET30a空载体转化子表达蛋白(诱导表达3h裂解上清液)为阴性对照，Amp (100 μ g/mL)为阳性对照，次日测量抑菌圈直径。2.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等标准菌株的体外药敏试验参照药敏试纸盒的说明，选用先锋V (3(^8/片)、庆大霉素(1(^8/片)、链霉素(10 Ug/片)、苯唑青霉素(I μ g/片)等27种药敏试纸片，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄微球菌等7株G+、G—标准菌株进行药敏试验，作为重组抗菌肽体外抑菌试验的抗生素对照。抑菌活性检测发现，利用Rosetta (DE3)/pET30a表达体系表达的重组Cathelicidins抗菌肽不需酶切等处理，对革兰氏阳性、阴性菌均有很好的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌C79-13、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、绿脓杆菌等标准菌株和临床分离菌株均有较强的抑制作用，抑菌圈直径测定结果见表2。与常规药敏试验结果(表3)比对发现，藤黄微球菌、大肠杆菌等标准菌株对试验中所使用的大多数抗生素类药物均耐药，而重组Cathelicidins抗菌肽对这些菌株却有明显的抑制效果。表明重组Cathelicidins抗菌肽对某些细菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超过传统抗生素。
表2重组Cathelicidins抗菌肽对指示菌株的抑菌活性Table 2 Detection of the antibacterial activity of recombinantCathelicidins against indicator strains
权利要求
1.鸡抗菌肽Cathelicidin3，其核苷酸序列如SEQID NO. 6所述。
2.鸡抗菌肽Cathelicidin3，其特征是，其氨基酸序列如SEQID NO. 10所述。
3.如权利要求I或2所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3的制备方法,其特征是,所述制备方法为固相化学合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是将鸡抗菌肽Cathelicidin3的编码基因克隆到表达载体上，然后导入宿主细胞中表达；所述表达载体为质粒或病毒中的一种，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
4.如权利要求3所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3的制备方法，其特征是，所述基因工程方法为 (O将鸡抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的编码基因克隆到大肠杆菌融合表达载体pET30a(+)中，得到融合表达载体pET30-CathL3S ； (2)将pET30_CathL3S质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，得到重组大肠杆菌基因工程菌株； (3)37°C下，在LB培养基中，诱导物IPTG浓度为I.OmmoI/L的条件下，对上述重组大肠杆菌基因工程菌进行诱导表达3小时； (4)离心收集上述表达菌体，超声波破碎，分离细胞可溶组分与包涵体； (5)Ni2+-NTA Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白。
5.如权利要求4所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3的制备方法,其特征是， (1) 0 方法扩增编码鸡抗菌肽0&访611(^也113成熟肽的核苷酸序列，PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后与同样酶切的pET-30a(+)融合表达载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒，应用PCR和质粒酶切的方法筛选阳性克隆，通过DNA测序验证插入片段阅读框的正确性，从而构建出原核表达载体；将构建的融合表达载体命名为pET30-CathL3S； (2)将测序正确的质粒pET30-CathL3S转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，获得重组表达Cathelicidins3成熟肽融合蛋白的工程菌Rosetta(DE3)/pET30_CathL3S ;挑取工程菌单菌落接种至LB培养基中37°C培养8 12h ;次日离心取菌体重悬至新鲜LB培养基中，待培养液OD6tltlnm值达到O. 5^0. 6时加入IPTG使其终浓度为I. OmmoI/L,开始进行诱导；37°C继续培养4h，每隔I小时取样ImL ;离心收集诱导培养后的菌体,用PBS缓冲液洗涤菌体2次，再加入裂解缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，每次破碎5s，间隔2s，功率600W，破碎IOmin ;超声后12000r/min, 4°C下离心IOmin,分离可溶组分与和包涵体，进行SDS-PAGE电泳和WesternBlot检测；电泳后将SDS-PAGE凝胶中的条带电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗His单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗，DAB为显色底物进行Western-blot分析，鉴定表达产物； (3)然后进行工程菌扩大培养和目的蛋白的诱导表达，条件为:25V、IPTG浓度为I.OmmoI/L的条件下诱导培养8小时；取诱导后的菌体，加入结合缓冲液，冰浴中超声波破碎菌体，分离包涵体和可溶组分，将裂解上清液上样于Ni2+-NTA Sepharose 4B亲和层析柱，样品经含O. Γ0. 5mol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱，收集融合蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE检测。
6.如权利要求5所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3的制备方法,其特征是,所述步骤(I)扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的核苷酸序列的引物为CathL3S F/R，其中F为正向引物，R为反向引物，所述CathL3S F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17-18所述。
7.如权利要求4-6中任意一项所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3的制备方法,其特征是，鸡抗菌肽鸡抗菌肽Cathelicidin3的编码基因的获取方法为自成年白来航鸡骨髓组织中提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板，用I对基因特异性引物CathL3P1/P2进行PCR，扩增产物即为cathelicidin3 cDNA全序列；PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段，将目的片段与克隆载体PMD18-T连接并转化E. coli DH5a感受态细胞，阳性菌株用M13 F/R引物测序，得到含cathelicidin3开放阅读框的完整核苷酸序列；所述CathL3Pl/P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所述。
8.权利要求I或2所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物中的应 用。
9.权利要求I或2所述的鸡抗菌肽Cathelicidin3在制备治疗金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌或绿脓杆菌感染引起的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用。鸡抗菌肽Cathelicidin1和Cathelicidin3的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表所示。所述抗菌肽的制备方法为固相化学合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是将鸡抗菌肽Cathelicidin1和3成熟肽的编码基因分别克隆到表达载体上，然后导入宿主细胞中表达。本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达鸡Cathelicidins抗菌肽，经实验证实该组抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的抑制作用。
文档编号C12N15/70GK102864154SQ201210387660
公开日2013年1月9日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者吴静, 宋敏训, 李玉峰, 马秀丽, 姜亦飞, 黄兵, 林树乾, 于可响 申请人:山东省农业科学院家禽研究所