异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用的制作方法

异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用。该异源动物细胞因子突变体疫苗，它的活性成分是异源动物细胞因子突变体，所述异源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变得到的，所述异源动物细胞因子突变体满足如下条件：1）所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合；2）所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合能力的十分之一以下。该异源动物细胞因子突变体疫苗可用于治疗受体动物的骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤。
【专利说明】异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用。

【背景技术】
[0002] 动物机体内的许多细胞会合成和分泌一些蛋白质和小分子多肽物质，它们可在细 胞间传递信息，并调节自身和其它细胞的多种生理功能，这些蛋白质和小分子多肽物质统 称为细胞因子。现在已发现的细胞因子根据其主要功能可分为：1.白细胞介素：在细胞间 相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用，目前已报道有三十余种；2.集 落刺激因子：刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞形成细胞集落；3.干扰素：干扰 病毒的感染和复制，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用；4.肿瘤坏死因子：杀伤肿瘤细 胞、免疫调节以及参与发热和炎症的发生；5.转化生长因子家族；6.生长因子家族； 7.趋化因子家族；8.其它细胞因子等。细胞因子一般通过与靶细胞上的受体分子相结合来 传递下游信号。每种细胞因子家族蛋白都会含有一些其家族特征结构，因此其受体分子往 往也具有相应的特征结构，因而形成了相应的细胞因子受体家族，如肿瘤坏死因子家族等。
[0003] 骨组织处于不断重建过程之中，破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨生成处于平衡 状态，维持骨密度和骨结构的优化来维持骨的机械功能。由于更年期、衰老、炎症或其他的 因素导致过度增加破骨细胞活性而打破平衡，并导致骨质快速流失，因此提高骨质疏松和 其他慢性骨疾病如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、骨肿瘤转移和佩吉特氏病的发生率。这 些慢性骨疾病最成功的药物疗法就是通过抑制破骨细胞的骨吸收而生效的。
[0004] 对破骨细胞成熟和活化的调控机制的理解，可以提供了比以前更好的骨吸收有 关疾病的预防和治疗。最近发现的NF-K B受体活化剂配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)和其受体-NF-k B 受体活化因子（receptor activator of NFk B，RANK)是破骨细胞发育和活化中必不可少，在调节骨重建中发挥着重 要作用。RANKL是肿瘤坏死因子超家族的成员，是一种II型跨膜蛋白，被认为主要表达在破 骨细胞、活化的T细胞和骨髓基质细胞表面。人类和小鼠的RANKL在氨基酸序列上有87% 的同源性，表明在进化上是一种高度保守的蛋白。象其他TNF超家族成员一样，所有型式的 RANKL都是组装成同源三聚体行使功能。
[0005] RANKL的功能受体RANK是肿瘤坏死因子受体（TNFR)超家族的成员。它是I型跨 膜蛋白，由620个氨基酸残基组成，人类和小鼠具有85%的同源性。N-末端的胞外区域是由 30-194位氨基酸残基组成的，含有4个富含半胱氨酸的重复序列（CRDs)，这些重复CRDs所 形成的细长形状给与受体的配体结合时提供了接触面。当与配体RANKL相互作用时，三个 独立的RANK胞外区域会结合在RANKL同源三聚体的相邻单体间的间隙，从而导致三个RANK 的胞内区域相互聚合。由约383个氨基酸残基组成的RANK细胞内区域是TNF受体超家族 中的最长的胞内域之一。像TNF受体超家族的其他成员一样，该区域缺乏酶活性，它通过招 募各种接头蛋白，包括肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs)来传递胞内信号，导致NF-yB、 JNK、ERK、p38、NFATcl、和Akt信号通路的激活。
[0006] 骨保护素（OPG)是一种RANK同源的可溶性蛋白，是RANKL的天然诱导受体。OPG 主要由骨髓基质细胞和成骨细胞分泌，通过阻断RANK与RANKL的结合，充当一个重要的内 源性调节RANK-RANKL信号通路的角色。OPG基因敲除小鼠表现出严重的骨质疏松症，证实 了 OPG是RANK-RANKL信号通路上的一个重要蛋白。此外，许多疾病模型提出RANK/0PG比 例是决定骨吸收的重要因素。因此，RANKL，RANK和OPG所组成的配体/受体/受体拮抗剂 系统调控着骨骼平衡和其它相关的生物过程。
[0007] 近年来，抗细胞因子免疫疗法为许多细胞因子产生异常相关的慢性疾病的治疗带 来了革命性的突破。通过注射(被动抗细胞因子免疫疗法)或诱导体内产生特异性抗细胞因 子抗体中和过度产生的细胞因子(主动抗细胞因子免疫疗法)达到阻止它们致病的作用。过 去的20年，使用特异性高亲和力单克隆抗体的被动抗细胞因子免疫疗法被用于动物模型 和各种临床研究(如类风湿关节炎，多发性硬化症，发炎性肠道疾病，哮喘，克罗恩病，牛皮 癣和其他关节的自身免疫性疾病)，在很大程度上确认了免疫疗法的功效。尽管被动抗细胞 因子免疫治疗在医疗和商业上获得了成功，但是它具有几个缺点：生产困难和成本过高，患 者需要定期输液，因半衰期有限阻碍抗细胞因子生物制剂的疗效，还具有一些副作用。


【发明内容】

[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供异源动物细胞因子突变体疫苗。
[0009] 本发明所提供的异源动物细胞因子突变体疫苗，它的活性成分是异源动物细胞因 子突变体，所述异源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变得到的， 所述异源动物细胞因子突变体满足如下条件：
[0010] 1)所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因 子的受体结合；
[0011] 2)所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子 的受体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜上的所述 细胞因子的受体结合能力的十分之一以下。
[0012] 上述异源动物细胞因子突变体中，术语"异源动物"是指与所述受体动物不同的物 种。所述结合能力可用亲和常数表示。
[0013] 上述异源动物细胞因子突变体中，所述细胞因子可为TNF家族蛋白，所述细胞因 子的受体可为TNFR家族受体分子。
[0014] 在本发明的一个实施方式中，所述细胞因子为RANKL细胞因子，所述细胞因子的 受体为RANK受体分子。
[0015] 上述异源动物细胞因子突变体中，所述异源动物和所述受体动物均可为哺乳动 物。在本发明的一个实施例中，所述异源动物为人，所述受体动物为大鼠，所述异源动物细 胞因子突变体具体为人RANKL细胞因子突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No. 1，实验证明该 人RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠骨质疏松症。在本发明的另一个实施例中，所 述异源动物为小鼠，所述受体动物为大鼠或家兔，所述异源动物细胞因子突变体具体为小 鼠RANKL细胞因子突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2,实验证明该小鼠RANKL细胞因子 突变体能够成功阻止大鼠和家兔骨质疏松症。
[0016] 上文中，所述异源动物细胞因子突变体可为1)-4)中的任一种：
[0017] 1)氨基酸序列是SEQ ID No. 2 ;
[0018] 2)氨基酸序列是SEQ ID No. I ;
[0019] 3)氨基酸序列与 SEQ ID No. 2 具有至少 85%，如 88%-99%、90%-99% 或 95%-99% 或 90%-95%或99%或95%或90%或88%的同一性；
[0020] 4)氨基酸序列与 SEQ ID No. 1 具有至少 85%，如 88%-99%、90%-99% 或 95%-99% 或 90%-95%或99%或95%或90%或88%的同一性。
[0021] 其中，可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI 主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2. 1中，通过使用blastp作为程序，将Expect 值设置为10,将所有Filter设置为OFF，使用BL0SUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost 和 Lambda ratio 分别设置为 11，1 和 0? 85 (缺省值）并进行 检索一对氨基酸序列的同一性进行计算。然后即可获得同一性的值（％)。
[0022] 上述异源动物细胞因子突变体中，所述异源动物也可为非灵长类动物。所述受体 动物可为人。
[0023] 下述BI)至B6)中的任一种所述异源动物细胞因子突变体的相关生物材料也属于 本发明的保护范围：
[0024] BI)编码上述异源动物细胞因子突变体的核酸分子；
[0025] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0026] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0027] B4)含有BI)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、 或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0028] B5)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0029] B6)含有BI)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 动物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
[0030] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。编码所述异源动物细胞因子突变体的核酸分子具体可 为编码所述异源动物细胞因子突变体的基因。所述重组微生物具体可为细菌、病毒、酵母、 藻和真菌。所述转基因植物细胞系和所述转基因动物细胞系不为繁殖材料。
[0031] 本发明中所述表达盒可含有编码所述异源动物细胞因子突变体的基因和启动所 述基因转录的启动子。本发明中所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述异源动物细胞 因子突变体的DNA，该DNA不但可包括启动所述基因转录的启动子，还可包括终止所述基因 转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0032] 以上述异源动物细胞因子突变体或上述异源动物细胞因子突变体的相关生物材 料为活性成分的疫苗也属于本发明的保护范围。
[0033] 上述疫苗中，所述疫苗单独使用或与佐剂同时使用；进一步，所述佐剂具体为铝佐 剂。
[0034] 所述疫苗具体可为治疗和/或预防哺乳动物骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤 的疫苗。所述哺乳动物可为大鼠。
[0035] 其中，所述异源动物细胞因子突变体可采用大肠杆菌表达系统表达。
[0036] 上述异源动物细胞因子突变体或其相关生物材料在制备治疗和/或预防哺乳动 物疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0037] 其中，所述哺乳动物疾病可为骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤。
[0038] 实验证明，在卵巢摘除（OVX)大鼠模型中，应用人RANKL细胞因子突变体和小鼠 RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠骨质疏松症。说明异源动物细胞因子突变体疫苗 可用于治疗受体动物的骨质疏松症。本发明的异源动物细胞因子突变体相对于治疗个体为 异源，所以具有免疫原性；失去了 RANKL的可激活破骨细胞的生物活性，所以具有安全性。 本发明的异源动物细胞因子突变体疫苗可用于治疗和/或预防哺乳动物骨质疏松症、自身 免疫性疾病或肿瘤。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 图1为典型的胫骨近端扫描片层和胫骨近端所感兴趣的空间区域（VOI)的骨小梁 结构的三维重建图。
[0040] A是胫骨近段片层的三维重建图，B为从胫骨近端的感兴趣的空间区域（VOI)的松 质骨结构的三维重建图。扫描从胫骨近端生长板开始以空间分辨率20 y m扫描，这组图从 第51层取到第100层(左图）和第一层到第25层(右图）。
[0041] 图中，Sham表示假手术组，HSA表示阴性对照组，223+300M表示治疗组。
[0042] 图2为用micro-CT对人RANKL223+300M在OVX大鼠中的抑制骨吸收作用的评价。
[0043] 图中A为骨密度（BMD)、B为包括骨体积密度（Bv/Tv)、骨小梁厚度（Tb. Th)、骨小 梁间隙（Tb. Sp)、骨小梁数量（Tb. N)、骨表面积密度（Bs/Bv，）和骨形态参数（Tb. Pf)在内 的其他的形态学和测量参数。计算得到的数值用平均值土标准差表示。
[0044] 图中，Sham表示假手术组，HSA表示阴性对照组，223+300M表示治疗组；数据为平 均值土标准差。
[0045] 图3为用Elisa法检测免疫人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M的大鼠抗 血清对小鼠RANKL细胞因子的效价。
[0046] 图中，BSA表示BSA包被到El isa板上作为阴性对照，anti-MRL serum表示作为阳 性对照的兔抗小鼠RANKL细胞因子的抗血清，HSA group表示人血清白蛋白疫苗免疫的阴 性对照组抗血清，223+300M group表示人RANKL223+300M疫苗免疫的治疗组抗血清；数据 为平均值土标准差。
[0047] 图4为利用免疫小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M方法来治疗OVX大 鼠及OVX家兔的骨质疏松。
[0048] A.高分辨率micro-CT对OVX大鼠胫骨三维重建后获得的VOI区域骨小梁结构。
[0049] B.经小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M免疫治疗后各组OVX大鼠胫骨 的BMD值。
[0050] C.高分辨率micro-CT对OVX家兔胫骨三维重建后获得的VOI区域骨小梁结构。 D.率micro CT对OVX家兔胫骨三维重建后获得的VOI区域骨小梁结构。
[0051] D.经小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M免疫治疗后各组OVX家兔胫骨 的BMD值。*和**为各组同阴性对照组的统计学比较。
[0052] 图中，Sham为假手术组；HSA为阴性对照组；M29为小鼠RANKL细胞因子突变体 mRANKL222+299M治疗组；Calcitonin为Calcitonin组；数据为平均值土标准差。
[0053] 图5为hRANKL158_317及其突变体与mRANK26_ 21Q的平衡解离常数曲线
[0054] A 为 hRANKL158_317, B 为 hRANKL300M，C 为 hRANKL223M，D 为 hRANKL223+300M。
[0055] 图6为hRANKL158_317及其突变体的抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果。
[0056] A 为 hRANKL158_317, B 为 hRANKL300M，C 为 hRANKL223M，D 为 hRANKL223+300M。

【具体实施方式】
[0057] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。
[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059] 2月龄的雌性Sprague - Dawley大鼠和8月龄的雌性新西兰大耳白兔购于北京维 通利华实验动物技术有限公司。
[0060] Raw264. 7细胞系购于American Type Culture Collection,并按照操作手册进行 培养传代。
[0061] 引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。限制性内切酶和T4DNA合成酶 购于Fermentas Molecular Biology Tools。Pfu DNA合成酶购于天根生化科技（北京） 有限公司。
[0062] 实施例1、用人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症
[0063] 一、人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症
[0064] 人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M是对来自人的细胞因子hRANKL158_ 317进 行突变得到的。hRANKL158_317的氨基酸序列如序列SEQ ID No. 7,人RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M的氨基酸序列如SEQ ID No. 1。其中，SEQ ID No. 1的第1位对应人RANKL 细胞因子的第158位，SEQ ID No. 1的第160位对应人RANKL细胞因子的第317位。人RANKL 细胞因子突变体hRANKL223+300M将人RANKL细胞因子第223位（SEQ ID No. 7的第66位） 的精氨酸突变为丙氨酸，将人RANKL细胞因子第300位（SEQ ID No. 7的第143位）的天冬 氨酸为丙氨酸。
[0065] 1、制备人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M
[0066] 用SEQ ID No. 3所示的hRANKL223+300M的基因替换pGEX-6p-l载体（美国 GEHealthcare公司）的BamHI和XhoI之间的小片段，得到含有hRANKL223+300M基因的重 组表达载体 pGEX-6p-hRANKL223+300M。
[0067] 将pGEX-6p-hRANKL223+300M转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生 物技术有限公司），得到含有pGEX-6p-hRANKL223+300M的重组大肠杆菌BL21/ pGEX-6p-hRANKL223+300M〇
[0068] 在表达菌（BL21/pGEX-6p-hRANKL223+300M)的生长浓度达到 0D600nm=0. 6 时，用 0.5mM 的 IPTG 诱导，并 20°C 过夜表达。利用 glutathione-Sepharose fast flow4B beads(GE Healthcare)来纯化可溶性的 hRANKL223+300M，然后用 PreScission protease (GE healthcare)切除GST标签，用分子排阻色谱法（Superdex200)在PBS pH7. 4的缓冲条件下 进一步纯化，得到人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M。
[0069] 2、人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症
[0070] 用卵巢摘除（OVX)大鼠作为骨质疏松的模型来检验人RANKL细胞因子突变体 hRANKL223+300M免疫对于骨质疏松的治疗作用。在卵巢摘除手术和随即进行的蛋白免疫 后，用高分辨率的微型计算机断层扫描（micro-CT)来对大鼠的胫骨进行三维重建。具体实 验方法如下：
[0071] 供试药剂：hRANKL223+300M疫苗和人血清白蛋白疫苗。
[0072] 步骤 1 的人 RANKL 细胞因子突变体 hRANKL223+300M用 PBS(KC10. 2g/L, NaC18. 2g/ L, Na2HPO4 ? 12H203. 6g/L, KH2PO4O. 245g/L, pH7. 4)进行溶解后，与氢氧化铝佐剂按照质量比 1:3的配比混合得到hRANKL223+300M疫苗。
[0073] 人血清白蛋白用 PBS(KC10. 2g/L，NaC18. 2g/L, Na2HPO4 ? 12H203. 6g/ L，KH2PO4O. 245g/L，pH7. 4)进行溶解后，与氢氧化铝佐剂按照质量比1:3混合得到人血清白 蛋白疫苗。
[0074] 供试动物：2月龄的雌性Sprague - Dawley (SD)大鼠。
[0075] 24只SD大鼠等分成三组：阴性对照组，进行卵巢摘除去势手术，在手术后10周 后皮下注射免疫人血清白蛋白；阳性对照组(假手术组)，进行卵巢摘除假手术，即手术但不 摘除卵巢，不进行免疫；治疗组，进行卵巢摘除去势手术，在手术后10周后皮下注射免疫 hRANKL223+300M疫苗。阴性对照组和治疗组的每只大鼠每次免疫0. 2mg蛋白，每两周免疫 一次，总共免疫六次，在第一次免疫的六个月后，处死24只大鼠并收集血清用下述步骤二 的Elisa方法进行抗小鼠RANKL细胞因子抗体效价的测定，在血液处理完毕后，分离出大鼠 的胫骨并去除上面的软组织进行U -CT扫描分析。y -CT扫描分析的方法如下：用Quantum FX microscopyCT(ii-CT)(Perkin Elmer)对大鼠的右腿胚骨近端进行扫描，扫描射线的能 量为90kv，0. 16mA，扫描在视野IOmm下进行(体素大小为20 ii m，扫描时间为3分钟)。扫描 部位从大鼠膝关节胫骨近端开始共扫描512层，数据计算从胫骨生长板消失的那层开始， 向远端计算100层。骨形态学测量包括骨矿物密度（BMD，mg/cc)、骨体积密度（Bv/Tv)、骨表 面积密度（Bs/Bv，mm 〇、骨小梁厚度（Tb. Th, mm)、骨小梁数量（Tb. N，mm 〇、骨小梁间隙（Tb. Sp, mm)和骨形态参数（Tb. Pf^mnT1)用Inveon research workplace软件进行计算。计算 得到的数值用平均值土标准差表示。P值小于〇. 05被认为有显著差异而当P值小于0. 01 时认为有非常显著的差异。
[0076] 图1给出了典型的胫骨近端扫描片层和胫骨近端所感兴趣的空间区域（VOI)的 骨小梁结构的三维重建图。与假手术组的大鼠相比，用人血清白蛋白疫苗免疫的OVX大 鼠（阴性对照组）松质骨片状结构有更多的孔隙，并且形成松质骨网状结构的小梁越来越 细直至消失，导致骨结构连接不良，表明在卵巢摘除后出现了骨质疏松的症状。然而用 hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组OVX大鼠的松质骨明显比人血清白蛋白疫苗免疫的OVX 大鼠（阴性对照组）的松质骨更厚更密，即使与假手术组的大鼠相比较，也没有表现出任何 的骨质丢失。除了可见的特征外，用定量micro-CT分析了胫骨骨松质的骨矿物密度（BMD)， 即钙羟磷灰石的体积密度。分析结果显示假手术组的BMD值（431. 1±104. 8mg/CC)和用 hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组的BMD值（445. 8±156. 9mg/cc)明显高于人血清白蛋白 疫苗免疫的阴性对照组的BMD值（238. 0±139. lmg/cc)(两组数据均P〈0. 05)(图2中A)。 另外，还用定量micro-CT分别计算了测量参数包括骨体积密度（Bv/Tv)即松质骨的体积与 整个VOI的体积的比值、骨小梁厚度（Tb. Th)、骨小梁间隙（Tb. Sp)、骨小梁数量（Tb. N)、骨 表面积密度（Bs/Bv)、和骨形态参数（Tb. Pf)(图2中B)。结果表明，在假手术组和人血清 白蛋白疫苗免疫的阴性对照组中，尽管所有参数都没有统计学差异，卵巢摘除导致假手术 组的Bv/Tv，Tb. Th和Tb. N均高于人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组。在比较人血清白蛋 白疫苗免疫的阴性对照组的OVX大鼠和hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组免疫的大鼠的 测量参数，可以看到相似的差异。但是这些差异更显著并具有统计学差异（BS/BV，P〈0. 05; 其他，P〈0. 01)。这些结果清楚的证明了人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M (异源 动物细胞因子突变体）免疫对于大鼠(受体动物）骨质疏松的治疗作用。
[0077] 二、人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M诱导大鼠产生抗小鼠RANKL细胞因 子的抗体
[0078] 1、制备小鼠RANKL细胞因子
[0079] 用SEQ ID No. 5所示的小鼠RANKL细胞因子（mRANKL)基因替换pGEX-6p-l (美国 GE Healthcare公司）的Sail和XhoI之间的小片段得到含有小鼠RANKL基因的重组表达 载体 pGEX-6p-mRANKL。
[0080] 将pGEX-6p-mRANKL转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生物技术有限公司），得 到含有 pGEX-6p-mRANKL 的重组大肠杆菌 BL21/pGEX-6p-mRANKL。
[0081] 在表达菌（BL21/pGEX-6p-mRANKL)的生长浓度达到 0D600nm=0. 6 时，用 0? 5mM 的 IPTG 诱导，并 20°C 过夜表达。利用 glutathione-Sepharose fast flow4B beads(GE Healthcare)来纯化可溶性的 mRANKL，然后用 PreScission protease(GE healthcare)切 除GST标签，用分子排阻色谱法（Superdex200)在PBS pH7. 4的缓冲条件下进一步纯化，得 到氨基酸序列是SEQ ID No. 6的小鼠RANKL细胞因子。
[0082] 2、按照如下方法检验从步骤一的人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组大鼠取出 的抗血清、hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组大鼠取出的抗血清是否具有抗小鼠RANKL细 胞因子的能力。方法如下：其中，Elisa测定抗血清的效价的方法如下：用PBS(KC10. 2g/ L，NaC18. 2g/L，Na2HPO4 .12H203. 6g/L，KH2PO4O. 245g/L，pH7. 4)作为包被液，小鼠 RANKL 细胞 因子和作为阴性对照的牛血清白蛋白BSA以lug/孔的量过夜包被到Elisa板上。从人血 清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组大鼠取出的抗血清、hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组大 鼠取出的抗血清和作为阳性对照的兔抗小鼠RANKL的抗血清分别作为一抗，并以KT3开始 10倍稀释直到10'每个样品做两个复孔。450nm光吸收值（O.D. 450)用来定量抗血清的 效价，数据以平均值土标准差来表示。
[0083] Elisa分析显示，与阳性对照组即抗小鼠RANKL的抗血清和阴性对照即用人血清 白蛋白疫苗免疫的大鼠来源的抗血清相比较，用hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组大鼠 来源的抗血清在检测小鼠RANKL细胞因子时有着高效价（图3)。说明人RANKL细胞因子突 变体hRANKL223+300M (异源动物细胞因子突变体）诱导大鼠(受体动物）产生抗小鼠RANKL 细胞因子的抗体。
[0084] 三、人RANKL细胞因子与小鼠RANK结合
[0085] I、hRANKL158_317及其突变体与mRANK的结合作用
[0086] hRANKL158_317 的两种单突变体 hRANKL223M 和 hRANKL300M。hRANKL223M 的氨基序 列是将SEQ ID No. 7的第66位的精氨酸残基替换为丙氨酸残基，其它氨基酸残基不变得到 的序列。hRANKL300M的氨基序列是将SEQ ID No. 7的第143位的天冬氨酸残基替换为丙氨 酸残基，其它氨基酸残基不变得到的序列。
[0087] 小鼠RANK命名为mRANK26_21Q，其氨基酸序列是SEQ ID No. 8。
[0088] 1)制备 hRANKL158_317、hRANKL223M、hRANKL300M 和 mRANK26_210
[0089] 用 SEQ ID No. 9 的 hRANKL158_317 基因替换 pGEX-6p_l 载体（美国 GE Healthcare 公司）的BamHI和XhoI之间的小片段，得到含有hRANKL158_317基因的重组表达载体 pGEX-6p-hRANKL158_317。用 hRANKL223M 基因替换 pGEX-6p-l 载体（美国 GEHealthcare 公司）的BamHI和XhoI之间的小片段，得到含有hRANKL223M基因的重组表达载体 pGEX-6p-hRANKL223M。用 hRANKL300M 基因替换 pGEX-6p-l 载体（美国 GE Healthcare 公司）的BamHI和XhoI之间的小片段，得到含有hRANKL300M基因的重组表达载体 pGEX-6p-hRANKL300M的基因。用SEQ ID吣.10所示的111狀疆26_21(|的基因替换口￡了283载体 (美国Novagen公司）的NdeI和XhoI之间的小片段，得到含有mRANK26_21(l基因的重组表达 载体 pGEX-6p-mRANK26_21。。
[0090] hRANKL223M 的基因序列是将 SEQ ID No. 9 的第 202-204 位的"cga"替换为"gca"， 其它核苷酸不变得到的序列。hRANKL300M的基因序列是将SEQ ID No. 9的第433-435位的 "gat"替换为"gcc"，其它核苷酸不变得到的序列。
[0091] 将 pGEX-6p-hRANKL158_317、pGEX-6p-hRANKL223M、pGEX-6p-hRANKL300M 和 pET28a-mRANK26_21(l分别单独转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生物技术有限公 司），得到含有 pGEX-6p-hRANKL158_317 的重组大肠杆菌 BL21/pGEX-6p-hRANKL158_317、 含有 pGEX-6p-hRANKL223M 的重组大肠杆菌 BL21/pGEX-6p-hRANKL223M、含有 pGEX-6p-hRANKL300M 的重组大肠杆菌 BL21/pGEX-6p-hRANKL300M、含有 pET28a-mRANK26_21。 的重组大肠杆菌 BL21/pET28a-mRANK26_21Q。
[0092] 在表达菌（BL21/pGEX-6p-hRANKL158_317、BL21/pGEX-6p-hRANKL223M、BL21/ pGEX-6p-hRANKL300M)的生长浓度达到 0D600nm=0. 6 时，用 0. 5mM 的 IPTG 诱导，并 20°C 过夜表达。利用 glutathione-Sepharose fast flow4B beads(GE Healthcare)来纯化 可溶性的 hRANKL223+300M，然后用 PreScission protease(GE healthcare)切除 GST 标 签，用分子排阻色谱法（Superdex200)在PBS pH7. 4的缓冲条件下进一步纯化，分别得到 hRANKL158_317、hRANKL223M 和 hRANKL300M。在表达菌（BL21/pET28a-mRANK26_21Q)的生长浓 度达到0D600nm=0. 6时，用ImM的IPTG诱导，并37°C过夜表达。利用超声处理获得纯化 后的包涵体并且将包涵体重新溶解在6M的盐酸胍中。通过如下步骤实现mRANK26_21(!的重 新折叠：该包涵体稀释在包含20mM的Na2HPO4(pH7. 3)、1M L-精氨酸、20%甘油、IOmM还原 型谷胱苷肽以及ImM氧化型谷胱苷肽的复性溶液中，然后在含有20mM的Na2HPO4 (pH7. 3)、 〇. 5M L-精氨酸、10%甘油的重新折叠缓冲液1中4°C下透析12小时，然后在含有20mM的 Na2HPO4 (pH7. 3)、0. 2M L-精氨酸、5%甘油的重新折叠缓冲液2中4°C下透析12小时，最后在 20mM的Na2HP04(pH7. 3)、0. 2M L-精氨酸中4°C下透析12小时，在20000g离心10分钟后， 将上清液用75 (Superdex75)色谱柱（购自Amersham Pharmacia公司）进行纯化，并且收 集正确折叠的mRANK26_21(l。
[0093] 2) Biacore 分析
[0094] 采用表面等离子体共振进行检测，具体方法如下：利用Biacore3000 (GE Heathcare)来计算野生型的hRANKL158_317、两种单位点突变体（hRANKL223M和hRANKL300M) 和双位点突变体（hRANKL223+300M)与mRANK的结合力。将步骤1纯化的mRANK26_21Q固定在螯合NTA传感芯片通道1上，再将步骤1纯化的hRANKL158_317、hRANKL223M和 hRANKL300M 分别以不同的浓度（0,0. 47,0. 94, 1.88,3. 75,7. 5, 15 和 30nM)注入螯合 NTA 传感芯片上的通道中，信号以传感图的方式记录。重组肿瘤坏死受体超家族TNFRSF9 (Zhang S, Liu C, Huang P, et al. The affinity of human RANK binding to its ligand RANKL. Arch Biochem Biophys. 2009;487:49-53 ；Liu C1Walter TS1Huang P, et al.Structural and functional insights of RANKL-RANK interaction and signaling. J Immunol. 2010; 184:6910-6919)、固定在通道2中用来当做对照。平衡解离常数（KD)用 BIAevaluation software4. 1 来计算。
[0095] 结果表明与 mRANKL157_316 结合 mRANK26_21。的力（Kd=6.8X10_nM)[2]相比， hRANKL158_317 与 mRANK26_210 的结合力（Kd=l. 56X1(T10M)稍弱（图 5)。hRANKL223M 和 hRANKL300M这两种单突变体与mRANK26_21(l的结合力明显下降，从Kd值上分析分别下降了 20 倍和70倍，而hRANKL223+300M双位点突变体在三种突变体中结合mRANK26_21(l的结合力最 低，下降了 260倍。因此选择了 hRANKL223+300M来检验其生物学性质和功能的改变。
[0096] 3) RAW264. 7细胞的分化实验
[0097] 细胞实验证实hRANKL222+299M不具有刺激小鼠破骨细胞前体细胞分化成破骨细 胞能力
[0098] 用含有 50ng/ml 的 hRANKL158_317、hRANKL223M、hRANKL300M 或 hRANKL223+300M 的 培养液(含有10%的胎牛血清的a -MEM)培养RAW264. 7细胞，不含hRANKL158_317及其突变体 的培养液培养细胞作为对照，4天后固定细胞并用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)试剂盒(编 号387A，美国Sigma公司）染色。标尺：200 ii m。
[0099] 结果如图6所示，hRANKL158_317刺激后的RAW264. 7细胞已经分化成TRAP染色 阳性的、具有大细胞直径（>100 U m)、多核的（>3个细胞核）的成熟的破骨细胞(A)，而 hRANKL300M刺激后的RAW264. 7细胞形成的破骨细胞比hRANKL158_317刺激的破骨细胞在成 熟程度上要弱很多，另两种蛋白hRANKL223M和hRANKL223+300M刺激后无破骨细胞出现，说 明与野生型hRANKL158_317的强烈的刺激破骨细胞成熟的能力相反，用hRANKL223+300M刺激 后，没有发现成熟的破骨细胞，这说明hRANKL158_317的突变体hRANKL223+300M不具有刺激小 鼠破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞能力。
[0100] 从Biacore分析和RAW264. 7细胞的分化实验表明，hRANKL可以结合如mRANK的 异源受体，从而刺激非人源破骨细胞的成熟。
[0101] 实施例2、用小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和 家兔骨质疏松症
[0102] 一、小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家兔骨质 疏松症
[0103] 小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M的氨基酸序列是SEQ ID No. 2。SEQ ID No. 2的第1位对应小鼠RANKL细胞因子的第158位，SEQ ID No. 2的第159位对应小鼠 RANKL细胞因子的第316位。小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M将小鼠RANKL细 胞因子第222位的精氨酸突变为丙氨酸，第299位的天冬氨酸为丙氨酸。
[0104] 1、制备小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M
[0105] 用SEQ ID No. 4所示的小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M的基因替 换pGEX-6p_l载体(美国GE Healthcare公司）的Sail和XhoI之间的小片段得到含有 mRANKL222+299M 基因的重组表达载体 pGEX-6p-mRANKL222+299M。
[0106] 将pGEX-6p-mRANKL222+299M转入大肠杆菌BL21菌株（北京全式金生 物技术有限公司），得到含有pGEX-6p-mRANKL222+299M的重组大肠杆菌BL21/ pGEX-6p-mRANKL222+299M〇
[0107] 在表达菌（BL21/pGEX-6p-mRANKL222+299M)的生长浓度达到 0D600nm=0. 6 时，用 0.5mM 的 IPTG 诱导，并 20°C 过夜表达。利用 glutathione-Sepharose fast flow4B beads(GE Healthcare)来纯化可溶性的 mRANKL222+299M，然后用 PreScission protease (GE healthcare)切除GST标签，用分子排阻色谱法（Superdex200)在PBS pH7. 4的缓冲条件下 进一步纯化,得到小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M。
[0108] 2、小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家兔骨质 疏松症
[0109] 具体实验方法如下：
[0110] 供试药剂：H1RANKL222+299M疫苗、人血清白蛋白疫苗、鲑鱼降钙素注射液(密盖息） (Novartis Pharma Schweiz AG, Switzerland)〇
[0111] 步骤I的小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M用PBS(KC10. 2g/ L，NaC18. 2g/L，Na2HPO4 ? 12H203. 6g/L，KH2PO4O. 245g/L，pH7. 4))进行溶解后，与氢氧化铝佐 剂按照质量比1:3混合得到mRANKL222+299M疫苗。
[0112] 人血清白蛋白用 PBS(KC10. 2g/L，NaC18. 2g/L, Na2HPO4 ? 12H203. 6g/ L，KH2PO4O. 245g/L，pH7. 4)进行溶解后，与氢氧化铝佐剂按照质量比1:3混合得到人血清白 蛋白疫苗。
[0113] 供试动物：2月龄的雌性Sprague - Dawley (SD)大鼠和8月龄的雌性新西兰大耳 白兔。
[0114] 32只SD大鼠等分成四组：HSA组（阴性对照组），进行卵巢摘除去势手术，在手术 后10周后皮下注射免疫人血清白蛋白疫苗；Sham组(假手术组)，进行卵巢摘除假手术，即 手术但不摘除卵巢，不进行免疫;M29组(治疗组)，进行卵巢摘除去势手术，在手术后10周 后皮下注射免疫mRANKL222+299M疫苗；Calcitonin组，进行卵巢摘除去势手术，在手术后 10周后皮下注射免疫鲑鱼降钙素注射液。HSA组和M29组的每只大鼠每次免疫0. 2mg蛋白， Sham组免疫等体积的PBS, Calcitonin组每只大鼠每次注射0. 2mg。每两周免疫一次，总共 免疫六次，在第一次免疫的六个月后，处死32只大鼠，分离出大鼠的胫骨并去除上面的软 组织按照实施例1的方法进行U -CT扫描分析。
[0115] 24只新西兰大耳白兔被均分为三组，Sham组(假手术组)、HSA组（阴性对照组）和 M29组(治疗组)。其中，Sham组进行卵巢摘除假手术，即手术但不摘除卵巢，不进行免疫， 阴性对照组和治疗组在进行卵巢摘除去势手术后第三天开始每天按0. 5mg/kg的量肌肉注 射地塞米松，六周后停药，并开始免疫治疗，阴性对照组用人血清白蛋白疫苗免疫，治疗组 用mRANKL222+299M疫苗免疫，免疫剂量均为每只兔子0. 5mg蛋白，每两周皮下注射免疫一 次，共免疫六次，第一次免疫六个月后，处死兔子，分离出兔子的胫骨、第三和第四腰椎并去 除上面的软组织按照如下方法进行U -CT扫描分析。
[0116] 用 Quantum FX microscopyCT ( u-CT) (Perkin Elmer)对兔子的右腿胚骨近端、 第三和第四腰椎进行扫描，扫描射线的能量为90kv，0. 16mA，扫描在视野24mm下进行(体素 大小为46. 875 ii m，扫描时间为2分钟)。扫描部位从兔子膝关节胫骨近端开始共扫描512 层，数据计算从胫骨生长板消失的那层开始，向远端计算85层。对于脊椎，扫描部位从椎 间盘开始向上扫描512层，数据分析从椎间盘上面Imm开始，向上计算85层。骨矿物密度 (BMD，mg/cc)用Inveon research workplace软件进行计算。计算得到的数值用平均值土 标准差表示。P值小于0. 05被认为有显著差异而当P值小于0. 01时认为有非常显著的差 异。
[0117] 图4中A和C分别为高分辨率micro-CT对大鼠和家兔的胫骨进行三维重建后获得 的所感兴趣的空间区域（VOI)骨小梁结构的三维重建图。结果表明，mRANKL222+299M免疫 的OVX大鼠和OVX家兔的松质骨明显比HSA免疫的OVX大鼠和OVX家兔的松质骨更厚更密， 即使与假手术组的大鼠和家兔相比较，也没有表现出任何的骨质丢失。mRANKL222+299M免 疫的OVX大鼠的松质骨结构甚至要好于市场药物鲑鱼降钙素(密盖息)治疗的OVX大鼠的松 质骨结构。定量分析胫骨骨松质的骨矿物密度（BMD)获得了相同的结果：mRANKL222+299M 免疫的OVX大鼠和OVX家兔的BMD值要明显高于相应HSA免疫组的BMD值，并且具有统计学 差异（图4中B和D)。其值甚至高于阳性对照假手术大鼠和家兔，及鲑鱼降钙素治疗的OVX 大鼠的BMD值。这些结果清楚地证明了小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M(异源 动物细胞因子突变体）免疫对于大鼠和家兔(受体动物）骨质疏松的治疗作用。
【权利要求】
1. 异源动物细胞因子突变体疫苗，它的活性成分是异源动物细胞因子突变体，所述异 源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变得到的，所述异源动物细胞 因子突变体满足如下条件： 1) 所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的 受体结合； 2) 所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受 体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞 因子的受体结合能力的十分之一以下。
2. 根据权利要求1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗，其特征在于：所述细胞因子 是指TNF家族蛋白，所述细胞因子的受体是指TNFR家族受体分子。
3. 根据权利要求1所述的异源动物细胞因子突变体疫苗，其特征在于：所述细胞因子 是指RANKL细胞因子，所述细胞因子的受体是指RANK受体分子。
4. 根据权利要求1至3中任一所述的异源动物细胞因子突变体疫苗，其特征在于：所 述异源动物为非灵长类动物。
5. 根据权利要求1至4中任一所述的异源动物细胞因子突变体疫苗，其特征在于：所 述受体动物为人。
6. 根据权利要求1至5中任一所述的异源动物细胞因子突变体疫苗，其特征在于：所 述异源动物细胞因子突变体为1) -4)中的任一种： 1) 氨基酸序列是SEQ ID No. 2 ; 2) 氨基酸序列是SEQ ID No. 1 ; 3) 氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少85%的同一性； 4) 氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少85%的同一性。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的异源动物细胞因子突变体疫苗，其特征在于：所述 疫苗单独使用或与佐剂同时使用；进一步，所述佐剂具体为铝佐剂。
8. 异源动物细胞因子突变体，为1) _4)中的任一种： 1) 氨基酸序列是SEQ ID No. 2 ; 2) 氨基酸序列是SEQ ID No. 1 ; 3) 氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少85%的同一性； 4) 氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少85%的同一性。
9. 权利要求8所述异源动物细胞因子突变体的相关生物材料，为下述B1)至B6)中的 任一种： B1)编码权利要求8所述的异源动物细胞因子突变体的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体； B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含 有B3)所述重组载体的重组微生物； B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物 细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； B6)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因动物 细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
10.权利要求1至5中任一所述的异源动物细胞因子突变体疫苗中所述的异源动物细 胞因子突变体、或权利要求8所述的异源动物细胞因子突变体、或权利要求9所述异源动物 细胞因子突变体的相关生物材料在制备治疗和/或预防哺乳动物疾病药物中的应用；所述 哺乳动物疾病为骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤。
【文档编号】C12N15/28GK104415328SQ201310371432
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】高斌, 刘长振, 赵云峰 申请人:中国科学院微生物研究所