一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达。本发明提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。
【专利说明】一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域。具体的说，本发明涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]粘红酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres.) Harrison)是一种重要的工业菌株，可以生产微生物油脂和其他活性物质，包括类胡萝卜素、L-苯丙氨酸、过氧化物歧化酶，近年来日益受到营养学家和药理学家的重视。
[0003]目前对于产油粘红酵母基因工程改良的报道不多，特别是以提高亚油酸含量为目的的基因工程改良还未有报道，而亚油酸是人体的必需氨基酸，因此提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种粘红酵母野生菌株的构建方法，以提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。
[0005]本发明的技术方案还在于采用了一种粘红酵母生产高亚油酸的基因工程菌的构建方法，利用35S强启动子和油桐vfFAD2基因构建重组表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2在粘红酵母种获得高校表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下:
(1)采用同源序列克隆方法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆，并测序，获得目的基因 vfFAD2 ；`
(2)目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121_vfFAD2，酶切、测序验证重组载体；
(3)利用农杆菌介导法，重组载体pBI121-vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL_l头孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 yg*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线，培养3-5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子；
(4)提取基因组DNA、PCR验证获得阳性转化子；
(5)气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了 102.86%。
[0006]作为优选，所述步骤(2)中扩增引物为:
FAD2-Y:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；
FAD2-R:5， -GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
PCR反应程序为:94 °C预变性5 min ；94 °C变性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35个循环；72 °C延伸10 min ;PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。[0007]进一步地，本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母转化子的筛选方法，所述步骤(4)首先用60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL_l头孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基培养3-5 d后，再将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μ g*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线筛选，最后提取基因组DNA，进行PCR验证。
[0008]本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母的培养方法，其方法具体步骤如下: 将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28°C培养48h之后，挑2环接入装有50mL
液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C振荡发酵72 h，发酵结束经离心收集菌体；种子培养基:15 g.L—1 葡萄糖，I g.L—1 酵母粉，2 g·L-1 (NH4)2SO4, 7 g.L-1 KH2PO4,2 g-L^1Na2HPO4,1.5 g·L-1 MgSO4,PH 5.5;发酵培养基:50 g·L-1 葡萄糖，1 g.·L-1 酵母粉，2.5 g·L-1 (NH4)2SO4,7 g·L-1 KH2PO4, 2 ·L-1 Na2HPO4, 2 g*L-1 MgSO4,0.1 g.L-1CaCl2，0.07 g.L-1FeCl3，PH 5.5。
[0009]本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产微生物油脂方面的应用。
[0010]本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产功能性油脂方面的应用。
[0011]本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的应用。
[0012]说明书附图
图1.vfFAD2基因的获得及pBI121-vfFAD2酶切、PCR验证；
图 1-a.vfFAD2 的 RT-PCR 扩增图1:DNA Marker ；2, 3:vfFAD2 ；
图 1-b.质粒pBI121 的酶切电泳图1:DNA Marker ；2:pBI121 未酶切；3:pBI121 的XbaI/Sac I双酶切；
图 1-c.重组质粒 pBI121-vfFAD2 的 PCR 验证，I:DNA Marker ；2, 3:vfFAD2 ；
图2.部分vfFAD2转化子的抗生素筛选及PCR验证；
图 2a:SM I 筛选；图 2b:SM II 筛选；图 2c:FAD2_F/R ；图 2d:FAD2-RTF/RTR ；M:DNAmarker 2000 ;1_7:FAD2酵母转化子；8:野生型酵母；
图3.转基因酵母中FAD2基因的表达分析；
图4.转FAD2酵母的脂肪酸组成分析。
【具体实施方式】
[0013]实施例1、油桐FAD2基因对酵母的遗传转化
(I)基因的获得
根据NCBI上已提交的油桐vfFAD2序列(Genbank登录号:AF525534)，利用分子生物学分析软件01igo6.0设计引物:
VF2a:5’ TATCTTCAGGTTGGGCAACGA 3’ ；
VF2b:5’ CGATTGAACGGCCTACATTAT 3’。
[0014]PCR扩增vfFAD2基因反应体系:
IOXEx buffer (Mg2+ free)2.5 μ LdNTP Mix2.0 μ L
25mM MgCl21.5 μ L
VF2al.0yL
VF2bl.0yL
Templet (油桐种仁总 cDNA) 1.0 μ L ddH2015.9 μ L
Ex Taq polymerase0.1 μ L
Total25 μ L
PCR反应程序:94°C预变性3 min，94°C变性45 s，60°C退火45 s，72°C延伸I min，共35个循环，最后72°C延伸10 min。1%琼脂糖电泳结果如图l_a。
[0015]目的片段回收及与pMD18_T simple vector连接:
将PCR扩增得到的vfFAD2目的片段进行凝胶回收，回收产物与pMD18-T simplevector 连接:
PCR回收产物4 yL
pMD18_T simple vectorI μ L
Solution I5 μ L
Total10 μ L
16°C反应 I h0
[0016]4)转化大肠杆菌及阳性克隆的鉴定:
连接产物PMD-FAD2 5 μ L转化大肠杆菌，挑取蓝白斑筛选出的白斑进行菌落PCR鉴定，鉴定呈阳性的克隆摇菌后，测序鉴定。
[0017](2)植物表达载体pBI121_vfFAD2的构建
O设计引物:按照载体连接试剂盒的要求设计引物D15f-a/D15f-b，此引物不仅具有目的基因的序列和酶切位点，还要求与载体具有15个碱基同源。
[0018]D15f-a:5’ CACGGGGGACTCTAGATGGGTGCT 3’ {含Xba J 酶切位点)；
D15f~b:5’ GATCGGGGAAATTCGTCAAAACTTCT 3’(含 fee J 酶切位点)。
[0019](注:下划线为载体的15个碱基，方框内为内切酶的碱基序列，剩下的为目的基因序列。)
2)PCR扩增及产物的回收:
反应体系: IOXEx buffer (Mg2+ free) 2.5 μ L dNTP Mix2.0 μ L
25mM MgCl21.5 μ L
D15f-al.0yL
D15f-bl.0yL
Templet (质粒 pMD_FAD2) l.0yL ddH2015.9 μ L
Ex Taq polymerase0.1 μ L
Total25 μ L
PCR反应程序:94°C预变性5 min，94°C变性30 s，52°C退火40 s，72°C延伸I min，共35个循环，最后72°C延伸10 min。琼脂糖电泳后，凝胶回收目的基因片段。
[0020]3 )载体 pB1121 的油a I/Sac J 双酶切:
IOXM buffer2 yL
ddH207 μ L
PMD-FAD210 μ L
Xba II yL
Total20 μ L
先37°C酶切2 h，65°C将/酶灭活0.5 h后，冷却至室温，加入内切酶fee I I μ L，37°C酶切2 h以上。酶切后凝胶回收pBI121的大片段。
[0021](2)植物表达载体pBI121-FAD2的构建:
按照试剂盒步骤进行连接，具体操作如下:
①在洁净的eppendorf管中加入以下成分:
FAD2基因回收产物1μL
PBI121的大片段回收产物6 μL
5XIn-Fusion Reaction Buffer 2 μ L In-Fusion EnzymeI μ L
Total10 μ L
②混匀后，PCR仪上 37°C 15 min, 50°C 15 min ；
③迅速置于冰上冷却至室温，加入IXTE(pH 8.0)使体系增至50 yL，混匀；
④取2.5 μ L上述产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞；
⑤挑取白斑进行PCR检测及酶切验证，结果见图l_b，C，对于检测呈阳性的克隆进行测序验证。
[0022](3)农杆菌介导vfFAD2基因转化酵母
本研究参照Piers等(1996)的农杆菌介导法进行。首先挑取粘红酵母单克隆接种于10 mL的YPD培养基，30 V，180 rpm振荡培养18 h，然后按1: 10稀释到YPD新鲜培养基中培养6 h，离心收集菌体，用无菌水冲洗两次，用液体頂培养基重悬，稀释酵母至0D660为0.7左右(细胞浓度约IXl(AmL-1);将含有质粒pBI121_FAD2和pBI121的根癌农杆菌在LB固体培养基上划线活化，培养基内加入50 μ g.mL-1.卡那霉素和50 μ g.mL-1利福平，挑取农杆菌单克隆接种于10 mL液体LB培养基中(加入50 μ g*mL_1卡那霉素,50 μ g*mL_1利福平)，28 °C, 180 rpm振荡培养18 h，离心收集菌体，用10 mL液体頂培养基重悬(含50μ g*mL_1卡那霉素,50 μ g*mL_1利福平),继续培养6 h。随后离心收集菌体,用IM培养基稀释农杆菌0D600值0.5左右(细胞浓度约lXlOlOmr1)。各取50 μ L稀释好的酵母与农杆菌加入到10 mL液体頂培养基(含200 μ M的乙酰丁香酮)中，28 °C, 180 rpm振荡培养过夜后，取150 μ L培养液涂布于铺有微孔滤膜的IM固体培养基上(含200 μ M的乙酰丁香酮)，25 °C，倒置，黑暗培养48 h。
[0023]( 3 )转化酵母初步筛选
将微孔滤膜转移到含60 μ g.mL_1链霉素,200 μ g?mL_1头孢霉素和100 μ g?mL_1卡那霉素的SM I筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μ gir1头孢霉素，150 Ugmr1卡那霉素的SM II平板上划线，培养3-5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子。将SM I平板(图2a)筛选到的出酵母与野生型酵母同时在加有抗生素的SM II平板(图2b)上划线，结果表明(图2b)，野生型酵母菌株(8)在平板上不能正常生长，而转化酵母菌株(1-7)均能够正常生长，将这些转化酵母初步认定为阳性菌株。
[0024]实施例2转vfFAD2基因粘红酵母鉴定
酵母转化子基因组DNA提取及PCR鉴定，按照北京艾德莱生物技术公司的酵母DNA提取试剂盒说明书提取酵母DNA。以野生型酵母为对照。根据油桐FAD2基因序列设计特异性引物:
FAD2-F:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；
FAD2-R:5，-GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
PCR反应程序为:94 °C预变性5 min ；94 °C变性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35个循环；72 °C延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0025]以野生型酵母做对照，利用FAD2-F/R以及FAD2-RTF/RTR两对引物进一步进行PCR鉴定，其中FAD2-F/R所扩得的片段长度为584 bp，FAD2-RTF/RTR所扩得的片段长度为240bp。结果显示，用FAD2-F/R引物扩增有5个转化酵母菌株在目的片段有条带(图2c)，而用FAD2-RTF/RTR引物扩增时4个转化酵母菌株在目的片段有条带(图2d)，野生型酵母均无条带，因此将转化子1，2，3，6视为成功转入FAD2的转基因酵母。
[0026]实施例3转基因酵母中vfFAD2的表达分析
为了探明油桐FAD2基因在转基因酵母中的表达情况，我们提取了 3个转基因酵母菌株的总RNA，经过微量分光光度计检测其浓度后，用1%琼脂糖电泳分析其完整性，获得了完整的 RNA,根据 SuperScript? III First-Strand Synthesis System 试剂盒的说明进行反转录。以FAD2-RTF/RTR为实时荧光定量PCR引物，检测酵母中油桐FAD2基因的表达水平，以酵母肌动蛋白基因ACTl (AB248916)为内参，设计其特异性引物:
RgACTl-RTF:5’ -ACTTTGAGCAGGAGATGCAG-3’
RgACTl-RTR:5’ -GACATGACAATGTTGCCGTA-3’
按照荧光定量试剂盒SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit指导说明进行实时荧光定量PCR0利用实时荧光定量PCR法检测转基因酵母中FAD2的表达，以转pBI121的酵母为对照。图3表明，FAD2基因在3个转基因酵母菌株中均有表达，但是在不同菌株中表达水平有所差异，其中以FAD2-1表达水平最高，在FAD2-3中表达水平最低，转pBI121空载体中FAD2基因无表达。
[0027]实施例4转基因酵母的脂肪酸成分分析
为了检测油桐FAD2基因对酵母脂肪酸可能具有的调控作用，我们利用酸热法提取了酵母的油脂。首先在YB)培养基上活化酵母菌株，培养3 d后，将转基因酵母菌株与对照分别接种于50 mL种子培养基中，30 °C, 180 rpm摇床培养24 h后，移种于500 mL发酵培养液中，30 °C, 180 rpm摇床培养72 h。将获得的发酵液采用酸热法进行油脂的提取。具体步骤:`
1)离心收集菌体,菌体沉淀称重,按大约每克菌加入6ml 4 mol*L-l盐酸的比例重悬菌体，振荡混匀；
2)将混合液室温放置30min，沸水浴3 min，放入冰箱，-20 °C速冷30 min ；3)取出混合液，加入2倍体积的氯仿:甲醇(1:1)提取液，充分振荡混匀；
4)5OOO rpm离心5 min,取氯仿层(下相)到新的离心管；
5)加等体积0.1%氯化钠溶液,混匀,5 000 rpm离心5 min,取氯仿层(下相)；
6)将氯仿层放入旋转瓶旋转蒸发，除去氯仿即得油脂。将装有油脂的旋转瓶放入真空烘箱 60 °C, 30 min。
[0028]7)对油脂进行气象色谱分析
各组分参考标准品出峰情况进行定性，计算各脂肪酸的相对含量，并对亚油酸含量进行T-test显著性分析，P < 0.01,为极显著，标为；0.01 < P < 0.05为显著，标为；P > 0.05，为不显著。采用气相色谱法分析了酵母中五种主要的脂肪酸，包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。经过检测发现转基因酵母菌株的脂肪酸绝对含量(每克油中的脂肪酸总量)没有明显的变化，而相对含量与对照相比均有所改变(图4)，其中以油酸、亚油酸和亚麻酸变化幅度较大，3个转FAD2酵母的油酸含量与对照相比，分别从72.4%下降为62.73%，67.89%和68.86%，亚油酸相对含量则分别从 6.65% 提高至Ij 13.49%, 12.1% 和 8.1%，即分别提高了 102.86%, 81.95% 和 21.80%,此外，转基因酵母的亚麻酸含量分别从0.78%上升为2.28%，1.18%和1.24%，即分别提高了192.31%，51.28%和58.97%。本文对亚油酸含量的提高做了 T_test显著性分析，表明亚油酸含量提高较显著。综合分析，油桐vfFAD2基因能够提高粘红酵母菌株亚油酸含量，使其从 6.65% 提高至Ij 13.49%ο`
【权利要求】
1.一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下: (1)粘红酵母进行活化和扩培； (2)采用同源序列克隆法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆并测序，获得目的基因vfFAD2 ； (3)目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121_vfFAD2，酶切、测序验证重组载体； (4)利用农杆菌介导法，重组载体pBI121-vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL-l头孢霉素和100 μ g*mL-l卡那霉素的SM I筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 yg*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线，培养3-5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子，提取基因组DNA，PCR验证获得阳性转化子； (5)气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了 102.86%。
2.根据权利要求1所述的一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增引物为:
3.根据权利要求1所述的一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(4) 60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL_l头孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基中培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μ g*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线筛选初步获得阳性转化子，提取基因组DNA，进行PCR验证进一步鉴定阳性转化子。
4.一种粘红酵母的培养方法，其特征在于，将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28°C培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C振荡发酵72 h，发酵结束经离心收集菌体； 种子培养基:15 g.!/1 葡萄糖，I g.!/1 酵母粉，2 g-L-1 (NH4)2SO4, 7 g-L-1 KH2PO4,2 g-L^1Na2HPO4,1.5 g-L-1 MgSO4, PH 5.5 ;发酵培养基:50 g.!/1 葡萄糖，I g.!/1 酵母粉，2.5 g*L—1 (NH4)2SO4, 7 g*L—1 KH2PO4, 2 g*L_1 Na2HPO4, 2 g*L—1 MgSO4,0.1 g*L—1CaCl2,0.07g^L^FeC^, PH 5.5。
5.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产微生物油脂方面的应用。
6.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产功能性油脂方面的应用。
7.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的 应用。
【文档编号】C12P7/64GK103509725SQ201310418736
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】汪阳东, 陈益存 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所