一种aida-i表达元件和cmv真核表达元件共表达载体的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，具体包括pBD载体的制备；AIDA-I表达元件的获取；CMV真核表达元件的获取；构建含有AIDA-I的表达元件的载体pA以及目标载体pAC的构建。本发明首次实现在同一载体中整合AIDA-I表面展示系统及CMV表达元件，通过该载体上AIDA-I元件将外源蛋白展示于革兰氏阴性菌表面，并通过该载体的真核表达元件将另一种外源蛋白表达于真核细胞中，为疫苗研发、全细胞催化剂、全细胞吸附剂及多肽库筛选提供了更多的候选载体。
【专利说明】—种AIDA-1表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种AIDA-1表面展示系统和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]运用DNA重组技术在噬菌体、细菌、真菌、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术等方面得到了广泛应用。
[0003]细菌表面展示技术是其中一种重要的微生物表面展示方法，与噬菌体、真菌及病毒表面展示技术相比，具有操作简便、系统多样、稳定性强及高效的特点。目前，细菌表面展示系统在重组疫苗开发、全细胞催化剂、全细胞吸附剂及多肽库筛选等方面具有广泛的应用前景。
[0004]细胞表面展示体系通常由运载蛋白、靶蛋白和受体菌三者组成，其中运载蛋白与靶蛋白以融合蛋白的方式交联，其中运载蛋白的功能是将靶蛋白引导并锚定于细胞表面特定部位，是影响展示系统性能的关键因素。
[0005]在众多的细菌表面展示系统中，AIDA-1是一种高效的展示系统。AIDA-1是革兰氏阴性菌的IV型分泌系统的重要成员，无需其它蛋白的辅助，其即可通过C-端氨基酸的β折叠嵌入细菌膜表面、形成桶装结构，通过C-端的链接区将N-端的蛋白展示到细菌表面。
[0006]另外，在通过表达技术研究基因功能的过程中，最常用的研究手段是真核表达。传统的方法就是通过分子生物学手段将将目的基因片段连接到真核启动子下游，整合到细胞基因组中后指导外源蛋白表达。
[0007]但是，现有技术中还没有关于将细菌表面展示系统与真核表达元件整合与同一表达载体，以独立高效的表达两种外源蛋白的报道。
【发明内容】
[0008]本发明涉的目的是提供一种整合了大肠杆菌AIDA-1表面展示系统及CMV真核表达元件的表达载体的构建方法，通过该载体上AIDA-1元件将外源蛋白展示于革兰氏阴性菌表面，并通过该载体的真核表达元件将另一种外源蛋白表达于真核细胞中。
[0009]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种AIDA-1表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:
(U pBD载体的制备:合成一对互补DNA序列，序列如下:
5 ‘-AATTCTTAGATCTCTTCATACTAGTCATGTTTGACTCATCGATA-3’ ；
5 ‘-AGCTTATCGATGAGTCAAACATGACTAGTATGAAGAGATCTAAG-3’ ；
将上述两条DNA序列通过退火处理得到双链DNA片段；
用EcoR I和Hind III双酶切pBR322载体后，以所述的双链DNA片段替代pBR322载体中被EcoR I和Hind III酶切掉的片段，得到载体pBD ； m AIDA-1表达元件的获取:
$启动子的获取:取大肠杆菌E393，超纯水中煮沸10分钟后离心分离，取上清作为PCR模板；合成特异性引物Seq N0.1和SeqN0.2，通过对上述模板进行PCR扩增得出AIDA-1启动子，回收此产物备用；
I； AIDA-1的C-端片段获取:合成特异性引物Seq N0.3和Seq N0.4，通过对X中所得的模板进行PCR扩增得出AIDA-1的C-端片段，回收此产物备用；
t AIDA-1表达元件的获取:以AIDA-1启动子和AIDA-1的C-端片段为模板，用SeqN0.1和Seq N0.4为引物，通过融合PCR扩增出AIDA-1的表达元件；
(3)CMV真核表达元件的获取:合成引物Seq N0.5和Seq N0.6，通过对p⑶NA3.1载体PCR扩增出CMV真核表达元件；
(4)构建含有AIDA-1的表达元件的载体pA:利用凝胶回收试剂盒回收步骤f2)获得的AIDA-1表达元件，将回收所得的AIDA-1表达元件与PGEM-T克隆载体连接、4°C连接过夜；取连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列；
取测序鉴定正确的AIDA-1表达元件质粒及步骤Φ制备的载体pBD，分别用StyI和ApeI双酶切得到酶切片段；利用凝胶回收试剂盒回收AIDA-1表达元件质粒的1600bp条带及pBD载体的3000bp酶切片段；将回收所得的两份酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DHlOB菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体PA ；(δ)目标载体pAC的构建:利用凝胶回收试剂盒回收步骤(3:1获取的CMV真核表达元件，将回收所得的CMV真核表达 元件与PGEM-T克隆载体进行连接、4°C连接过夜；取连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列，取测序鉴定正确的CMV真核表达元件质粒为CMV真核表达元件载体；
将步骤4)构建的载体PA及CMV真核表达元件载体分别用BglII和ApeI双酶切得到酶切片段，回收载体PA的4600bp条带及CMV真核表达元件载体的1200bp酶切片段，将回收所得的酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DHlOB菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体PAC，即为所述的AIDA-1表面展示系统和CMV真核表达元件共表达载体，称为载体pAC ；
上述 Seq N0.1 为 CCTTGGTTCACATGGCTGTAATGGATG ；
Seq N0.2 为 GTTATTCATCTAGACGGTACCGCCTGAAATATTTACTGCAAATGC ；
Seq N0.3 为 GCGGTACCGTCTAGATGAATAACAATGGAAGCATTG ；
Seq N0.4 为 GAATTCTAAGATCTAAACTAGTCCTCAGAAATGAGGGCCG ；
Seq N0.5 为 ACTAGTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC ；
Seq N0.6 为 AGATCTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC。
[0010]上述技术方案中，步骤⑵中离心分离的转速为12000rpm，时间为5min。
[0011]格革兰氏阴性菌感染细胞过程中，其表面蛋白可被细胞高效摄取，同时其菌膜内的质粒也会被摄取。如果该质粒包含有真核表达元件，则可在被感染的细胞中表达该蛋白。因此，将AIDA-1表达元件及真核表达元件构建于同一个载体中，既可以在细菌表面展示外源蛋白，又可以在该细菌被真核细胞摄取的情况下在真核细胞中表达另一种外源蛋白。
[0012]由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1、本发明首次实现在同一载体中整合AIDA-1表面展示系统及CMV表达元件，实现在革兰氏阴性菌膜表面展示外源蛋白及在真核细胞中表达同一或另外一种外源蛋白，并且两个表达相对独立，不会互相影响；
2、本发明构建的共表达载体广谱性强，为蛋白表达、疫苗研发、全细胞催化剂、全细胞吸附剂及多肽库筛选提供更多的载体选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例制备的共表达载体的构建示意图；
图2为实施例中AIDA-1表达元件的酶切鉴定图；
图3为实施例中CMV真核表达元件PCR产物鉴定图；
图4为实施例中载体pA的酶切鉴定图；
图5为实施例中载体pAC的酶切鉴定图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例一
OJ pBD载体的制备:根据PBR32`2载体的特征，合成一对两端分别带有EcoRl和HindIII酶切后的残余碱基的互补DNA序列，序列如下:
5 ‘-AATTCTTAGATCTCTTCATACTAGTCATGTTTGACTCATCGATA-3’ ；
5 ‘-AGCTTATCGATGAGTCAAACATGACTAGTATGAAGAGATCTAAG-3’ ；
将上述两条DNA片段以1:1的摩尔比例混匀，加入10%的PCR缓冲液(25mM的Tris-Hcl)混匀后煮沸5分钟，然后自然冷却至室温得到双链DNA片段；将pBR322载体用EcoR I和Hind III双酶切后，通过胶回收4.3kb的载体片段；
将上述DNA片段和载体片段按以下体系进行连接:DNA片段8 μ 1，酶切回收后的PBR322载体2 μ 1，Τ4连接酶I μ 1，IOX连接缓冲液2 μ 1，三蒸水7 μ 1，4°C连接过夜；将此连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，通过氨苄青霉素筛选，取阳性菌落，摇菌过夜，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒；取所得质粒按照以下体系进行酶切鉴定:质粒5 μ 1，IOXbuffer 2μ I,EcoR I 内切酶 1μ I,Hind III 内切酶 1μ 1，双蒸水 11μ 1，37°C水浴 2h ；取初步酶切鉴定结果为阳性的相应质粒至上海生工测序以得到准确的重组克隆，标记为载体pBD ；
⑵AIDA-1表达元件的获取::X:启动子的获取:从LB平板上挑取3个大肠杆菌E393菌落放入含有100 μ I灭菌的超纯水的EP管中，煮沸10分钟后12000rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板；根据NCBI所公布AIDA-1的orfA序列EF601572设计特异性引物Seq N0.1和SeqN0.2，进行PCR扩增，反应体系为:10XTaq buffer 5ml, MgCl2 4ml, IOmM dNTP 1ml，IOmM 上下游引物各 lml，模板5ml，Taq DNA聚合酶1ml，ddH20补充至总体积50ml ;扩增条件为:94°C预变性5 min，94°C变性30 s，57 °C退火60 s，72 °C延伸50s，扩增30个循环，72 °C延伸IOmin ;2%琼脂糖凝胶电泳鉴定所得PCR扩增产物回收此产物备用；
S AIDA-1的C-端片段获取:取上述E393模板，根据NCBI所公布的AIDA-1的orfB序列EF601573、X65022及载体pBR322特征设计特异性引物Seq N0.3和Seq N0.4，通过PCR进行扩增，反应体系为:10XTaq buffer 5ml, MgCl2 4ml, IOmM dNTP 1ml，IOmM 上下游引物各1ml，模板5ml，Taq DNA聚合酶1ml，ddH20补充至总体积50ml ;扩增条件为:94°C预变性5 min，94 °C变性 60 s，57 °C退火 60 s，72 °C延伸 90s，扩增 30 个循环，72 °C延伸 IOmin ;2%琼脂糖凝胶电泳鉴定所得PCR扩增产物回收此产物备用；
# AIDA-1表达元件的获取:以$和g中回收的PCR产物为模板，用Seq N0.1和SeqN0.4为引物，通过融合PCR进行扩增，反应体系为:10XTaq buffer 5ml，MgCl2 4ml, IOmMdNTP lml, IOmM上下游引物各lml，模板各5ml, Taq DNA聚合酶lml, ddH20补充至总体积50ml ;扩增条件为:94°C预变性5 min，94 °C变性60 s，57 °C退火60 s，72 °C延伸120s，扩增30个循环，72 °C延伸IOmin ;2%琼脂糖凝胶电泳鉴定所得PCR扩增产物回收此产物备用；
附图2为上述AIDA-1表达元件的酶切鉴定图，其中1、DL2000，2、AIDA-1启动子片段，
3、AIDA-1的C-端片段，4、AIDA-1完整表达元件；可以看出AIDA-1启动子片段、AIDA-1的C-端片段、AIDA-1完整表达元件的大小分别约340bp、1500bp以及1800bp ；
取20 μ I步骤:f所得PCR 产物，按照凝胶回收试剂盒说明进行回收，取回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体按以下体系进行连接:PCR产物5μ 1，PGEM-T克隆载体1μ 1，T4连接酶1μ 1，10Χ连接缓冲液1μ 1，三蒸水2μ 1，4°C连接过夜；
将此连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，通过蓝白斑筛选，取白色阳性菌落，摇菌过夜，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒；取所得质粒按照以下体系进行酶切鉴定:质粒5 μ I, IOXbuffer 2 μ 1，Bgl II 内切酶 I μ 1，Sty I 内切酶 I μ 1，双蒸水 11 μ 1，30°C水浴2h ;取初步酶切鉴定结果为阳性的相应质粒至上海生工测序以得到准确的AIDA-1表达元件质粒；
?.3) CMV真核表达元件的获取:根据P⑶NA3.1载体的序列，设计了针对CMV真核表达元件的引物Seq N0.5和Seq N0.6 ;取I μ I ρ⑶ΝΑ3.1质粒用100 μ I灭菌超纯水稀释后作为模板，进行PCR扩增，反应体系为:10XTaq buffer 5ml,MgCl2 4ml, IOmM dNTP lml, IOmM上下游引物各1ml，模板5ml，Taq DNA聚合酶1ml，ddH20补充至总体积50ml ;扩增条件为:94°C预变性5 min，94 °C变性60 s，57 °C退火60 s，72 °C延伸90s，扩增30个循环，72 V延伸IOmin ;2%琼脂糖凝胶电泳鉴定所得PCR扩增产物回收此产物备用；
取回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体按以下体系进行连接:PCR产物5 μ 1，PGEM-T克隆载体I μ 1，Τ4连接酶1μ 1，10Χ连接缓冲液1μ 1，三蒸水2μ 1，4°C连接过夜；将此连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，通过蓝白斑筛选，取白色阳性菌落，摇菌过夜，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒；取所得质粒按照以下体系进行酶切鉴定:质粒5 μ 1，IOXbuffer 2 μ I, Bgl II 内切酶 lyl，Ape I 内切酶 I μ 1，双蒸水 11 μ 1，30°C水浴 2h ;取初步酶切鉴定结果为阳性的相应质粒测序以得到准确的基因克隆，为CMV真核表达元件；附图3为上述CMV真核表达元件PCR鉴定图，其中1、DL2000，2、CMV真核表达元件PCR产物；可以看出该PCR产物的大小约1400bp ；
W构建含有AIDA-1的表达元件的载体pA:
取测序鉴定正确的AIDA-1表达元件质粒及载体pBRD，分别用Sty I和Ape I双酶切，酶切体系如下:质粒5 μ I, IOXbuffer 2 μ I, Ape I内切酶I μ I, Sty I内切酶I μ 1，双蒸水11 μ 1，30°C水浴2h。按照凝胶回收试剂盒说明书回收AIDA-1表达元件质粒的1800bp条带及pBRD的3000bp片段。将回收所得的酶切片段连接过夜，连接体系如下=AIDA-1表达元件片段8μ 1，酶切回收后的pBRD载体2μ 1，T4连接酶Iy 1，10X连接缓冲液2μ 1，三蒸水7μ 1，4°C连接过夜。将此连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，通过氨苄青霉素筛选，取阳性菌落，摇菌过夜，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒。取所得质粒按上述体系用StyI和Ape I双酶切，鉴定阳性克隆，筛选出序列正确的载体为载体PA ；
附图4为上述载体pA的酶切鉴定图，其中1、DL2000 ;2、pA载体经Sty I和Ape I双酶切后条带(出现3000bp的载体条带和1800bp的AIDA-1表达元件的条带)；
(5)目标载体pAC的构建:将载体pA及CMV真核表达元件载体分别用Bgl II和ApeI双酶切，酶切体系如下:质粒5 μ 1，10Xbuffer 2 μ I, Bgl II内切酶I μ 1，Ape I内切酶I μ 1，双蒸水11 μ I, 3011C水浴2h。按照凝胶回收试剂盒说明书回收回收pA的4600bp条带及CMV真核表达元件载体的1200bp片段。将回收所得的酶切片段连接过夜，连接体系如下:CMV表达元件片段8 μ 1，酶切回收后的pA载体2 μ 1，Τ4连接酶I μ 1，IOX连接缓冲液2μ 1，三蒸水7μ 1，4°C连接过夜。将此连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，通过氨苄青霉素筛选，取阳性菌落，摇菌过夜，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒。取所得质粒按上述体系用Bgl II和Ape I双酶切，鉴定阳性克隆，筛选出序列正确的载体PA。取连接产物转化感受态DHlOB菌，挑菌，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体为目标载体pAC ；
附图5为上述载体pAC的酶切鉴定图，其中1、DL2000 ladder ； 2、载体pAC经Ape I和Bgl II双酶切的产物(出现4600bp的pA载体条带和1200bp的CMV真核表达元件条带)。
[0015]上述引物的序列号见表1。
[0016]表1 实施例中各引物的序列号_
引物编号序歹Li_
【权利要求】
1.一种AIDA-1表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤::i:> PBD载体的制备:合成一对互补DNA序列，序列如下:
.5 ‘-AATTCTTAGATCTCTTCATACTAGTCATGTTTGACTCATCGATA-3’ ； . 5 ‘-AGCTTATCGATGAGTCAAACATGACTAGTATGAAGAGATCTAAG-3’ ； 将上述两条DNA序列通过退火处理得到双链DNA片段； 用EcoR I和Hind III双酶切pBR322载体后，以所述的双链DNA片段替代pBR322载体中被EcoR I和Hind III酶切掉的片段，得到载体pBD ；
AIDA-1表达元件的获取: X:启动子的获取:取大肠杆菌E393，超纯水中煮沸10分钟后离心分离，取上清作为PCR模板；合成特异性引物Seq N0.1和SeqN0.2，通过对载体pBR322进行PCR扩增得出AIDA-1启动子，回收此产物备用； S AIDA-1的C-端片段获取:合成特异性引物Seq N0.3和Seq N0.4，通过对载体PBR322进行PCR扩增得出AIDA-1的C-端片段，回收此产物备用； 客AIDA-1表达元件的获取:以AIDA-1启动子和AIDA-1的C-端片段为模板，用SeqN0.1和Seq N0.4为引物，通过融合PCR扩增出AIDA-1的表达元件；:? CMV真核表达元件的获取:合成引物Seq N0.5和Seq N0.6，通过对p⑶NA3.1载体PCR扩增得到CMV真核表达元件； ⑷构建含有AIDA-1的表达元件的载体PA:利用凝胶回收试剂盒回收步骤⑵获得的AIDA-1表达元件，将回收所得的AIDA-1表达元件与PGEM-T克隆载体连接、4°C连接过夜；取连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列； 取测序鉴定正确的AIDA-1表达元件质粒及步骤(!)制备的载体pBD，分别用StyI和ApeI双酶切得到酶切片段；利用凝胶回收试剂盒回收AIDA-1表达元件质粒的1600bp条带及pBD载体的3000bp酶切片段；将回收所得的两份酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DHlOB菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体PA ；S目标载体的构建:利用凝胶回收试剂盒回收步骤3::获取的CMV真核表达元件，将回收所得的CMV真核表达元件与PGEM-T克隆载体进行连接、4°C连接过夜；取连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列，取测序鉴定正确的CMV真核表达元件质粒为CMV真核表达元件载体； 将步骤U-:构建的载体pA及CMV真核表达元件载体分别用BglII和ApeI双酶切得到酶切片段，回收载体PA的4600bp条带及CMV真核表达元件载体的1200bp酶切片段，将回收所得的酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DHlOB菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体即为所述的AIDA-1表面展示系统和CMV真核表达元件共表达载体；
所述引物 Seq N0.1 为 CCTTGGTTCACATGGCTGTAATGGATG ；
Seq N0.2 为 GTTATTCATCTAGACGGTACCGCCTGAAATATTTACTGCAAATGC ；Seq N0.3 为 GCGGTACCGTCTAGATGAATAACAATGGAAGCATTG ；
Seq N0.4 为 GAATTCTAAGATCTAAACTAGTCCTCAGAAATGAGGGCCG ；
Seq N0.5 为 ACTAGTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC ；
Seq N0.6 为 AGATCTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于:步骤T中离心分离的转速为12000rpm，时间为 5min。
【文档编号】C12R1/19GK103614405SQ201310599985
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】赵李祥, 梅雨, 刘海燕 申请人:苏州大学