铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表达3α-羟基类固醇脱氢酶的DNA序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysterioddehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列，包括其互补链序列。其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（ Pseudomonasaeruginosa ）3α-羟基类固醇脱氢酶。内容包括利用生物信息学分析获得的铜绿假单胞菌3α-羟基类固醇脱氢酶基因序列；含有铜绿假单胞菌3α-羟基类固醇脱氢酶3-hsdA基因序列的重组表达载体；表达3α-羟基类固醇脱氢酶3-hsdA的基因工程菌；3α-羟基类固醇脱氢酶的酶促动力学参数。
【专利说明】铜绿假单胞菌(Aei/i/cV7/0/7aS 中表达3 Ct -轻 基类固醇脱氢酶的DNA序列
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有3α -轻基类固醇脱氢酶（3a -hydroxysteriod dehydrogenase，〗a -HSD)活性的多肽链的DNA序列，包括其互补链序列。其特征在于， 该DNA序列的表达产物具有3 α -羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌 (Aewt/offlmas aerwgifliosaWa-轻基类固醇脱氢酶。该蛋白的酶学性质为首次鉴定，具有 应用于磺酸化胆汁酸临床检测的实用性，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 3 a -轻基类固醇脱氢酶（3 a-hydroxysteriod dehydrogenase，3 a-HSD)是广 泛存在于哺乳动物细胞和原核细胞中的一类氧化还原酶。细菌3 a -HSD是胆汁酸（bile acids，BAs)、横酸化胆汁酸（sulfated bile acids，SBAs)和雄留酮等物质定量分析中不可 缺少的酶试剂，具有较高的实用价值。
[0003] 磺酸化胆汁酸（sulfated bile acids, SBAs)是体内胆固醇代谢产物胆汁酸 (bile acids，BAs)的主要排泄形式之一。在正常生理情况下，体内95%的BAs经肠肝循环 (enterohepatic circulation)回到肝胆系统中，少量BAs会随粪便和尿液排出体外。BAs 在体内会发生磺酸化作用形成SBAs，这是机体减低BAs的毒性作用和增加 BAs溶解性，以利 于BAs排泄的一种机制。研究表明，尿中的BAs主要是以磺酸化的形式存在。通常，健康人 尿液中SBAs的含量极低。当发生肝胆病变时，由于肝胆结构的破坏，大量BAs便会从肝胆 系统中漏出，从而造成尿中SBAs含量异常增高。目前，尿液中SBAs已经被建议作为肝胆疾 病早期诊断和治疗监测的重要指标。在日本，尿中SBAs的含量已经成为肝胆功能评估、肝 癌（liver cancer)和肝硬化（hepatocirrhosis)诊断的重要指标。SBAs的定量检测具有 很高的临床应用价值。
[0004] 在SBAs的各种测定方法中，酶-比色测定法具有操作简单、准确性较高、测试 时间短和设备成本较低等特点，是一种有潜在临床应用价值的检测方法。近年来，本实 验室一直致力于开发满足临床应用需求的SBAs测定方法，先后将流动注射分析技术 (flow injection analysis，FIA)、固定化酶技术（immobilized enzyme)和化学发光法 (chemiluminescence)引入SBAs的酶法测定中，实现了对SBAs的自动分析测定，提高了测 定的灵敏度，并建立了一种新型的SBAs生物传感器，开发了尿中SBAs测定试剂盒。这些分 析测定技术具有极大的临床应用前景。但是，这些测定方法都需要昂贵的3α_羟基类固醇 脱氢酶（3 a -hydroxysteriod dehydrogenase, 3 a -HSD)。昂贵的酶试剂是影响这些 SBAs 检测技术推广应用的主要因素。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是开发一种新型3α_羟基类固醇脱氢酶，
【发明内容】
如下： 1.提供能产生一种新型铜绿假单胞菌aeiiifliosaWa-轻基类固醇脱 氢酶的基因序列信息（SEQ ID NO: 1 )。
[0006] 2.提供一种根据基因信息得到的铜绿假单胞菌aeragiflosa ) 3 α -羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列信息。
[0007] 3.含有铜绿假单胞菌aerwgifliosaW α -轻基类固醇脱氢酶基因的 DNA序列的重组表达载体。
[0008] 4.携带含有铜绿假单胞菌(Aewt/offioftas aerwgifliosaW α -轻基类固醇脱氢酶基 因的DNA序列的重组表达载体的大肠杆菌菌株。
[0009] 5.得到重组3 α -羟基类固醇脱氢酶的酶促反应动力学参数。
[0010] 本发明的各种特征如下： 1.通过生物信息学分析发现铜绿假单胞菌Serwgifl(Osa)PAOl基因组中 第2356713 bp到2357573 bp碱基基因序列（SEQ ID NO: 1)与已知的睾丸酮假单胞菌Gd. (WP_020684122. 1)序列的比对，发现具有51%的同源性，但是功能未 知。本研究通过基因工程技术克隆了该段基因；构建了含有该段基因的克隆载体和表达载 体；在原核大肠杆菌中进行了诱导表达，并对其酶学性质进行了研究，确认了该基因序列表 达的产物具有3 α -羟基类固醇脱氢酶活性。
[0011] 2.通过基因重组技术构建了包含特征1所述的基因序列的重组表达载体，方法 为： Α.铜绿假单胞菌G01SeworOfflmas aerwgifliosa )，其3 α -轻基类固醇脱氢酶基因3-hsdA 原始克隆的大小为1134bp，其聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)体系如 下：
【权利要求】
1?具有 3a-轻基类固醇脱氢酶（3a-hydroxysteriod dehydrogenase，3a-HSD)活 性的多肽链的DNA序列（SEQ ID NO: 1)，包括其互补链序列；其特征在于，该DNA序列的 表达产物具有3a-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌 aerwgifliasa) 3 a -轻基类固醇脱氢酶。
2. 含有权利要求1所述的DNA序列的原核或真核细胞表达载体；其特征在于，是一种 通过DNA重组技术获得的含有权利要求1所述的DNA序列的原核或真核细胞表达载体。
3. 含有权利要求2所述的重组表达载体的宿主细胞；其特征在于，是一种通过基因工 程技术获得的含有权利要求2所述的表达载体的宿主细胞。
4. 通过基因工程技术生产的由权利要求1所述的DNA序列编码的具有3 a -羟基类固 醇脱氢酶活性的蛋白产物。
5. 权利要求4所述的新型3 a -羟基类固醇脱氢酶在磺酸化胆汁酸检测试剂盒等临床 诊断产品中的应用开发。
【文档编号】C12N15/53GK104388440SQ201410591668
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】高秀峰, 陈建敏, 李永生 申请人:四川大学