一种凝血酶的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种凝血酶的制备方法，其包括：过滤除去猪血浆中的杂质；加入病毒灭活试剂进行病毒灭活处理；加入吸附剂吸附凝血酶原；洗涤和浸泡吸附凝血酶原的吸附剂，再进行透析；激活经透析的溶液中的凝血酶原；将溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；经超滤膜过滤；经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；制成制剂。该制备方法在进一步稳定凝血酶产品的效价的基础上，更有效地减少了凝血酶产品中的杂质及降低杂蛋白浓度，并使病毒充分灭活后被除去。
【专利说明】一种凝血酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化制药领域，涉及一种凝血酶的制备方法，具体涉及一种有效降低 杂质和去除/灭活病毒、效价稳定的凝血酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶是一种广泛存在于人体和动物血液中的丝氨酸蛋白酶，它是血液凝血级联 反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。当循环凝血因子在暴露的血管外组 织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板催化纤维蛋白原 转化为纤维蛋白，促进血块稳定，从而在血栓性疾病的引发和发展中发挥核心作用。由于凝 血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使其转变为纤维蛋白、加速血液的凝固而止血， 因此临床上将其用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血，特别是 用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血及外伤出血等。
[0003] 目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的。其中， 由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是 由人血及牛血等血液制备的。但是，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的 制备方法都会存在以下几个问题：（1)凝血酶产品效价不稳定；（2)产品杂质及杂蛋白浓度 偏高；(3)存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐 患。
[0004] 中国发明专利申请CN1031160486(以下简称在先专利）公开了一种猪凝血酶的 制备方法，该方法包括以下步骤：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原； 四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该专利申请 并未公开用于病毒灭活的试剂和纳米膜的种类，而且所述方法得到的产品杂质含量偏高， 其广品的效价也有待进一步提_。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种凝血酶的制备方法， 该制备方法在进一步提高凝血酶产品的效价的基础上，更有效地去除了凝血酶产品中的杂 质并使病毒充分灭活后被除去。
[0006] 用于实现上述目的的技术方案如下：
[0007] -种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
[0008] (1)过滤除去猪血浆中的杂质；
[0009] (2)向步骤（1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；
[0010] ⑶向步骤⑵得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽 滤；
[0011] (4)以包含11. 7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤（3)得到 的吸附凝血酶原的吸附剂；
[0012] (5)将步骤（4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克 /升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；
[0013] (6)将步骤（5)得到的滤液置于2. 94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；
[0014] (7)将步骤（6)得到的经透析的溶液加热至33-36°C，加入体积比为7%的溶液A， 再加入体积比为7 %的溶液B和体积比为7 %的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以 35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液； 溶液B为向步骤（6)得到的经透析的溶液加入体积比为7 %的溶液A并搅拌后，加入体积比 为7%的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液； [0015] (8)将步骤（7)得到的溶液的pH调节至5. 2-5. 6,静置后离心，将上清液的pH调 节至6. 0-6. 5,静置；
[0016] (9)将步骤（8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；
[0017] (10)将步骤（9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；
[0018] (11)将步骤（10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除 去病毒；
[0019] (12)将步骤（11)得到溶液制成制剂。
[0020] 在上述制备方法的步骤（1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地， 所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更 优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅 匀，在0-10°C下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15°C，离心时间为15-20分钟， 收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述 经过抗凝预处理的猪血浆在〇-l〇°C下保存0-6小时或者-18°C以下冰冻贮存二年以内备 用；优选地，所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤。
[0021] 在上述制备方法的步骤（2)中，优选地，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0. 3% 的磷酸三丁酯和重量比浓度为1 %的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0. 3 %的磷酸三 丁酯和体积比浓度为1%的TritonX-100的水溶液。
[0022] 在上述制备方法的步骤（3)中，优选地，所述吸附剂为DEAE-SephadexA-50型离子 交换树脂；优选地，所述吸附剂与血浆的质量比为〇. 5?2. 5 :1000,优选为1. 5 :1000。
[0023] 在上述制备方法的步骤（4)中，优选地，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升? 200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克。
[0024] 在上述制备方法的步骤（5)中，优选地，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升? 60毫升：1000克，更优选为35毫升：1000克。
[0025] 在上述制备方法的步骤（6)中，优选地，所述透析用溶液与血浆的比为2500毫 升?3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克。
[0026] 在上述制备方法的步骤（8)中，优选地，采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将pH调节 至5. 2-5. 6 ;优选地，采用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至6. 0-6. 5。
[0027] 在上述制备方法的步骤（9)中，优选地，所述膜吸附器为纤维素膜吸附器，例 如SartobindQSingleSep型囊式膜吸附器；优选地，所述洗脱的洗脱剂为先用浓度为 0? 15mol/L的NaCl水溶液，再用浓度为0? 25mol/L的NaCl水溶液。
[0028] 在上述制备方法的步骤（10)中，优选地，所述超滤膜的截留分子量为10K-150K; 更优选地，所述超滤膜过滤为先用截留分子量为150K的超滤膜过滤，再用截留分子量为 10K的超滤膜过滤；进一步优选地，所述截留分子量为150K的超滤膜为截留分子量为150K 的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜，所述截留分子量为10K的超滤膜为截留分子量为10K的中 空纤维聚砜超滤膜。
[0029] 在上述制备方法的步骤（11)中，优选地，所述过滤除菌的滤膜依次为0.8ym、 0. 45um和0. 22um的聚偏二氟乙烯膜。
[0030] 在本发明的一个优选的技术方案中，所述凝血酶的制备方法包括以下步骤：
[0031] (1)在20±2°C下，分别经70目、100目、200目滤网过滤除去经过抗凝预处理猪血 浆中的杂质；
[0032] (2)向步骤⑴得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，在24°C下进行病毒灭活 处理4-6小时；所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0. 3%的磷酸三丁酯和重量比浓度为1% 的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0. 3%的磷酸三丁酯和体积比浓度为1 %的Triton X-100的水溶液；
[0033] (3)在20±2°C下，向步骤⑵得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，搅拌 45分钟后静置30分钟以吸附凝血酶原，经200目滤布过滤后抽滤；所述吸附剂与血浆的质 量比为1. 5 :1000 ;
[0034] (4)以包含11. 7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤（3)得到 的吸附凝血酶原的吸附剂；所述洗涤用溶液与血浆的比为160毫升：1000克；
[0035] (5)在室温下，将步骤（4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯 化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中30分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫 升：1〇〇〇克；再将吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中20 分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为15毫升：1000克，合并两次的滤液；
[0036] (6)在0_4°C下，将步骤（5)得到的滤液置于2. 94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进 行透析5-5. 5小时；所述透析用溶液与血浆的比为3000毫升：1000克；
[0037] (7)将步骤（6)得到的经透析的溶液加热至33_36°C，加入体积比为7%的溶液A， 5分钟后再加入体积比为7%的溶液B和体积比为7%的溶液C，搅拌15分钟后4°C下静置 1小时；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液，并经 加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤（6)得到经透析的溶液加入体积比为7% 的溶液A并搅拌后，加入体积比为7%的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为 1摩尔/升的氯化钙水溶液；
[0038] (8)采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将步骤（7)得到的溶液的pH调节至5. 2-5. 6， 在4°C下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟，采用饱和碳酸氢钠溶液将上 清液的pH调节至6. 0-6. 5,在4°C下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟；
[0039] (9)将步骤⑶得到的上清液以0? 4Mpa的压力、0? 03?20升/分钟的流速通过 膜吸附器后，先用浓度为〇.15mol/LNaCl水溶液洗涤，再用浓度为0.25mol/LNaCl水溶液 洗脱得到洗脱液；
[0040] (10)将步骤（9)得到的洗脱液pH控制为2-13,在5-45°C的温度和不大于0. 3Mpa 压力下先经截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜过滤，再在5-45°C的温度和 不大于0. 12Mpa压力下经截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜过滤，并浓缩滤液；
[0041] (11)将步骤（9)得到的滤液依次经孔径为0.8i! m、0.45i!m和0.22i!m的聚偏二 氟乙烯膜过滤除菌，然后经孔径为0. 1Um的滤膜预过滤，再以200 ±lOKPa的过滤压力经孔 径为20nm的滤器过滤除病毒；
[0042] (12)将步骤（11)得到溶液与药学上可接受的辅料混合，经冻干制成冻干制剂。
[0043] 实验结果表明，相对于现有技术，本发明的制备方法在进一步稳定凝血酶产品的 效价的基础上，更有效地减少了凝血酶产品中的杂质，降低了杂蛋白浓度并使病毒充分灭 活后被除去，从而延长了凝血酶产品的运输、储存和使用周期，消除了安全隐患，更有利于 凝血酶产品在临床上发挥疗效，为广大患者带来益处。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0045] 图1为本发明的凝血酶的制备方法的工艺流程图；其中，洁净区：温度18_26°C;相 对湿度45-65% ;保持一定的正压，与室外的静压差彡10Pa;
[0046] 图2显示了电泳法检测实施例1制备的凝血酶产品的杂质含量的结果；
[0047] 图3显示了超滤前后的蛋白分子量分布的对比结果；其中，图3A:超滤前；图3B: 超滤后。
【具体实施方式】
[0048] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0049] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原 料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0050] 实施例1凝血酶的制备方法
[0051] 一、生产处方
[0052] 1、猪血预处理：
[0053]
【权利要求】
1. 一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤： (1) 过滤除去猪血浆中的杂质； (2) 向步骤（1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理； (3) 向步骤（2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤； (4) 以包含11. 7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤（3)得到的吸 附凝血酶原的吸附剂； (5) 将步骤（4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升 柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤； (6) 将步骤（5)得到的滤液置于2. 94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析； (7) 将步骤（6)得到的经透析的溶液加热至33-36°C，加入体积比为7%的溶液A，再加 入体积比为7 %的溶液B和体积比为7 %的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35 克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶 液B为向步骤（6)得到的经透析的溶液加入体积比为7 %的溶液A并搅拌后，加入体积比为 7%的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液； (8) 将步骤（7)得到的溶液的pH调节至5. 2-5. 6,静置后离心，将上清液的pH调节至 6. 0-6. 5,静置； (9) 将步骤（8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液。 (10) 将步骤（9)得到的洗脱液经超滤膜过滤； (11) 将步骤（10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病 毒； (12) 将步骤（11)得到溶液制成制剂。
2. 根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤（1) 中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新 鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更优选地，所述抗凝预处理包括以下步 骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-KTC下静置后，并于5-8小 时内离心，离心温度为8-15°C，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂 为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-KTC 下保存0-6小时或者_18°C以下冰冻贮存二年以内备用；优选地，所述过滤为分别经70目、 100目、200目滤网过滤。
3. 根据权利要求1或2所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步 骤（2)中，优选地，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3%的磷酸三丁酯和重量比浓度 为1%的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0. 3%的磷酸三丁酯和体积比浓度为1%的 Triton X-100的水溶液。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在上述制备方 法的步骤（3)中，优选地，所述吸附剂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂；优选地，所 述吸附剂与血浆的质量比为〇. 5?2. 5 :1000,优选为1. 5 :1000。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方 法的步骤（4)中，优选地，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升?200毫升：1000克，更 优选为160毫升：1000克。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方 法的步骤（5)中，优选地，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升?60毫升：1000克，更优 选为35毫升：1000克。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方 法的步骤（6)中，优选地，所述透析用溶液与血浆的比为2500毫升?3500毫升：1000克， 更优选为3000毫升：1000克。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方 法的步骤（8)中，优选地，采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将pH调节至5. 2-5. 6 ;优选地，采 用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至6. 0-6. 5。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备 方法的步骤（9)中，优选地，所述膜吸附器为纤维素膜吸附器，例如Sartobind Q Singles印 型囊式膜吸附器；优选地，所述洗脱的洗脱剂为先用浓度为〇. 15mol/L的NaCl水溶液，再用 浓度为〇? 25mol/L的NaCl水溶液。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备 方法的步骤（10)中，所述超滤膜的截留分子量为10K-150K;优选地，所述超滤膜过滤为先 用截留分子量为150K的超滤膜过滤，再用截留分子量为10K的超滤膜过滤；进一步优选地， 所述截留分子量为150K的超滤膜为截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜，所 述截留分子量为10K的超滤膜为截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备 方法的步骤（10)中，所述过滤除菌的滤膜依次为0. 8iim、0. 45iim和0. 22iim的聚偏二氟 乙火布月旲。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述凝血酶 的制备方法包括以下步骤： (1) 在20〒2°C下，分别经70目、100目、200目滤网过滤除去经过抗凝预处理猪血浆 中的杂质； (2) 向步骤（1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，在24°C下进行病毒灭活处理 4-6小时；所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0. 3%的磷酸三丁酯和重量比浓度为1%的 吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0. 3 %的磷酸三丁酯和体积比浓度为1 %的Triton X-100的水溶液； (3) 在20±2°C下，向步骤（2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，搅拌45分 钟后静置30分钟以吸附凝血酶原，经200目滤布过滤后抽滤；所述吸附剂与血浆的质量比 为 1. 5 :1000， (4) 以包含11. 7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤（3)得到的吸 附凝血酶原的吸附剂；所述洗涤用溶液与血浆的比为160毫升：1000克； (5) 在室温下，将步骤（4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化 钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中30分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升： 1000克；再将吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中20分 钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为15毫升：1000克，合并两次的滤液； (6) 在0-4°C下，将步骤（5)得到的滤液置于2. 94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透 析5-5. 5小时；所述透析用溶液与血浆的比为3000毫升：1000克； (7) 将步骤（6)得到的经透析的溶液加热至33-36°C，加入体积比为7%的溶液A，5分 钟后再加入体积比为7 %的溶液B和体积比为7 %的溶液C，搅拌15分钟后4°C下静置1小 时；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液，并经加 热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤（6)得到的经透析溶液加入体积比为7%的 溶液A并搅拌后，加入体积比为7 %的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1 摩尔/升的氯化钙水溶液； (8) 采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将步骤（7)得到的溶液的pH调节至5. 2-5. 6,在4°C 下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟，采用饱和碳酸氢钠溶液将上清液的 pH调节至6. 0-6. 5,在4°C下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟； (9) 将步骤（8)得到的上清液以0. 4Mpa的压力、0. 03?20升/分钟的流速通过膜吸 附器后，先用浓度为〇? 15mol/L NaCl水溶液洗涤，再用浓度为0? 25mol/L NaCl水溶液洗脱 得到洗脱液； (10) 将步骤（9)得到的洗脱液pH控制为2-13,在5-45°C的温度和不大于0. 3Mpa压力 下先经截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜过滤，再在5-45°C的温度和不大 于0. 12Mpa压力下经截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜过滤，并浓缩滤液； (11) 将步骤（9)得到的滤液依次经孔径为0. 8 ii m、0. 45 ii m和0. 22 ii m的聚偏二氟乙 烯膜过滤除菌，然后经孔径为0. 1 U m的滤膜预过滤，再以200 ± lOKPa的过滤压力经孔径为 20nm的滤器过滤除病毒； (12) 将步骤（11)得到溶液与药学上可接受的辅料混合，经冻干制成冻干制剂。
【文档编号】C12N9/74GK104328101SQ201410591661
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】邵春杰 申请人:长春远大国奥制药有限公司