一种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于天然药物分离提取领域，具体涉及一种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法及其应用。具体制备方法为：以羊肚菌为原料，经固体发酵、产物有机浸提、分离纯化得到吡咯酸化合物。所用的羊肚菌原料为羊肚菌M.co0010（Morehellaesculenta），已于2014年7月6日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014324。根据该制备方法得到了一种吡咯酸化合物，实验证明该吡咯酸化合物具有抗氧化活性，可以用于制备抗氧化药物。本发明制备的吡咯酸化合物有较好的抗氧化活性，可以利用菌株 Morehellaesculenta 发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。
CCTCC NO：M2014324
20140706
【专利说明】一种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物分离提取领域，具体涉及一种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物 的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 天然抗氧化物质具有清除自由基，进而具有抗衰老和预防各种疾病的作用。食药 用大型真菌不但富含氨基酸、维生素、多糖、蛋白质等营养物质，而且其次级代谢产物结构 类型多样，这些次级代谢具有抗氧化、抗细菌、促进神经生长因子合成、酶抑制剂、抗真菌、 细胞毒、受体拮抗剂等多种生物活性。抗氧化功能是食药用菌的重要功能之一，从食药用菌 中分离提取天然抗氧化物质，有助于食药用菌资源的开发利用，丰富了天然药物资源，促进 人类健康发展与疾病预防。基于以上背景，开展本发明的研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对食用菌中含有丰富的天然抗氧化物质，但开发利用程度 低；提供一种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法及其应用。本发明制备的吡咯酸化合物 有较好的抗氧化活性，且培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种羊肚菌，所述菌种为羊肚菌M.co0010(Morehellaesculenta)，已于2014年7月 6日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014324。
[0005] -种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，以羊肚菌为原料，经固体发酵、产物有 机浸提、分离纯化得到吡咯酸化合物。
[0006] 所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，包括以下步骤： (1) 固体发酵：将羊肚菌活化后进行固体发酵；然后进行培养； (2) 产物有机浸提：将步骤（1)培养得到的菌丝体与培养基用有机溶剂浸提；浸提液浓 缩后，用等体积的乙酸乙酯和水进行萃取；取乙酸乙酯相，经脱水、浓缩后，得到有机粗提物 浸膏； (3) 分离纯化：将有机粗提物浸膏用甲醇溶解后，进行凝胶柱层析；采用薄层层析-生 物自显影法(参考文献：谷丽华等.应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等三种中药的 抗氧化活性.药学学报.2006,41(10) :956-962)检测各组分的抗氧化活性，将具有抗氧 化活性的组分收集、合并后，再进行反相硅胶柱层析，收集具有抗氧化活性的组分；最后再 利用正相硅胶柱层析，得到具有抗氧化活性的吡咯酸化合物。
[0007] 步骤（1)所述的培养其条件固体发酵的培养基配方组成为：马铃薯16_25wt%，葡 萄糖 1. 5-2. 5wt%，蛋白胨0? 5-1. 5wt%，l-2wt%琼脂，余量为水；自然 pH，0. 1 Mpa、10(Tl40°C 灭菌15?40min，于25-28 °C恒温培养25-35天。
[0008] 步骤（2)所述的有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、丙酮、冰乙酸中的一种或多种。
[0009] 步骤（3)所述的凝胶柱层析其参数为：SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱，甲醇洗 脱，流速为12 s/滴，每管收集5-10mL，每试管取样进行薄层层析：展开剂为氯仿：甲醇= 10:1，显色剂为l〇wt%的硫酸乙醇，相似组分进行合并。
[0010] 步骤（3)所述的反相硅胶柱层析其洗脱为：用甲醇与水的混合液作为洗脱剂，甲 醇占混合液体积的5-30%，混合液中含有体积分数为0. 1-1%的甲酸，进行梯度洗脱；所述 的正相硅胶柱层析其洗脱为：用氯仿与甲醇的混合液作为洗脱剂，体积比为40:1-120:1， 洗脱剂中含有体积分数为〇. 1-2%。的甲酸。
[0011] 一种如上所述的方法得到的吡咯酸化合物，其分子式为c5h5no2，结构式为：
【权利要求】
1. 一种利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：以羊肚菌为原料，经固体 发酵、产物有机浸提、分离纯化得到吡咯酸化合物。
2. 根据权利要求1所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：包括以 下步骤： (1) 固体发酵：将羊肚菌活化后进行固体发酵；然后进行培养； (2)产物有机浸提：将步骤（1)培养得到的菌丝体与培养基用有机溶剂浸提；浸提液浓 缩后，用等体积的乙酸乙酯和水进行萃取；取乙酸乙酯相，经脱水、浓缩后，得到有机粗提物 浸膏； (3) 分离纯化：将有机粗提物浸膏用甲醇溶解后，进行凝胶柱层析；采用薄层层析-生 物自显影法检测各组分的抗氧化活性，将具有抗氧化活性的组分收集、合并后，再进行反相 硅胶柱层析，收集具有抗氧化活性的组分；最后再利用正相硅胶柱层析，得到具有抗氧化活 性的吡咯酸化合物。
3. 根据权利要求2所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：步骤 (1)所述的培养条件为：培养基配方组成为：马铃薯16_25wt%，葡萄糖I. 5-2. 5wt%，蛋白胨 0· 5-1. 5wt%，l-2wt% 琼脂，余量为水。
4. 根据权利要求2所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：步骤（1) 所述的培养其条件为自然pH，0.IMpa、10(Tl4(rC灭菌15?40min，于25-28 °C恒温培养 25-35 天。
5. 根据权利要求2所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：步骤（2) 所述的有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、丙酮、冰乙酸中的一种或多种。
6. 根据权利要求2所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：步骤（3) 所述的凝胶柱层析其参数为=SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱，甲醇洗脱，流速为12s/滴， 每管收集5-10mL，每试管取样进行薄层层析：展开剂为氯仿：甲醇=10:1，显色剂为10wt% 的硫酸乙醇，相似组分进行合并。
7. 根据权利要求2所述的利用羊肚菌制备吡咯酸化合物的方法，其特征在于：步骤（3) 所述的反相硅胶柱层析其洗脱为：用甲醇与水的混合液作为洗脱剂，甲醇占混合液体积的 5-30%，混合液中含有体积分数为0. 1-1%的甲酸，进行梯度洗脱；所述的正相硅胶柱层析 其洗脱为：用氯仿与甲醇的混合液作为洗脱剂，体积比为40:1-120:1，洗脱剂中含有体积 分数为0.1-2%。的甲酸。
8. -种如权利要求1或2所述的方法得到的吡咯酸化合物， 其特征在于：所述的吡咯酸化合物其分子式为C5H5NO2，结构式为：
9. 一种如权利要求8所述的吡咯酸化合物的应用，其特征在于：用于制备抗氧化药物。
【文档编号】C12P17/10GK104450818SQ201410679109
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】郑永标, 刘艳如, 吴小君 申请人:福建师范大学