本发明属于饲料防霉保鲜技术，具体涉及一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法及其应用。
背景技术：
饲料产业发展应朝“绿色无公害”和“新型高端”饲料发展，实现“量”与“质”同步提升，加快产业转型。饲料在存放过程中容易发生霉变，轻则影响产品外观，如表面裂纹、白斑；结块或容易解崩、产生酸败或不良气味影响诱食和捕食；严重将导致霉菌毒素的产生。防止饲料霉变通常通过控制水分和添加防霉添加剂。目前使用最广泛的添加剂是丙酸及其盐类(包括丙酸钠、丙酸钙、丙酸铵和二丙酸铵)。在实际生产中，对高档的饲料，尤其是高值水产饲料如鳗鱼、鲍鱼饲料等，控制较低的水分不利于喂养时饲料的复水，影响饲料的柔软性，从而不利于鱼类捕食。另一方面，在高水分却不改变饲料pH值，不影响饲料水质和饲料品质的前提下，丙酸及其盐类防霉剂难以在货架期内保持无霉变发生。因此需要寻找具有抗菌力、安全性、适口性、适用性和经济性兼具的防霉添加剂。生物抑菌剂以其安全性高、能耗低的优势成为开发新热点。目前常用的微生物源抑菌剂主要有乳酸菌素和纳它霉素。纳它霉素是针对真菌的防霉保鲜剂，但其不溶于水和有机溶液。本专利采用一株具有显著抑制饲料霉菌活性的枯草芽孢杆菌（保藏号：BSh0851）；并对其发酵活性代谢物质进行了结构鉴定，表明其为脂肽类表面活性物质；并经过液体发酵条件优化后，活性物质产量可达450 mg /L，具有很好的发酵优势。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法及其在鱼饲料防霉中的应用，为饲料，特别是含水量稍高的鱼饲料防霉保鲜提供新的途径。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌代谢产物的制备方法，包括如下具体步骤：
（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r·min-1，培养24h；种子培养基的配方为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；
（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏15g，无水葡萄糖15g，MgSO4 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0；分装，装液量为三份之一体积；灭菌备用；
（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%vol；于37℃、转速100r·min-1条件下培养24h；
（4）将步骤（3）的发酵液6000r·min-1 离心10min，去除菌体后，上清液进行冷冻干燥，得到含枯草芽孢杆菌表面活性肽的冻干粉。其活性物质含量为50mg/g。
其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtulis）BSh0851，保藏日期为2009年12月13日，保藏单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3502。该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，V-P阳性。
本发明的另一目的在于提供一种所述枯草芽孢杆菌表面活性肽冻干粉末在鱼饲料防霉中的应用，其具体步骤为：
（1）将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以1g/L的添加量添加入鱼油中；
（2）以每50L鱼油覆膜1吨鱼饲料产品，且饲料含水率在10%左右；
（3）对所生产的饲料定期进行外观和菌落生长检测。
此枯草芽孢杆菌活性肽冷冻干燥浓缩物可有效抑制饲料中的真菌生长，包括鱼饲料中常见的多种酵母菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉和白地霉。采用0.05%的冷冻干燥浓缩粉对酵母菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉和白地霉进行平板抑菌实验，结果表明，7d后，抑菌圈直径分别为无生长（完全抑制）、0.3cm、0.45cm、0.6cm、0.8cm和1.4cm。
将冷冻干燥粉末以1g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油。使用本发明的保鲜剂对饲料进行防霉处理，正常放置6个月，肉眼未可见霉变。
本发明的有益效果如下：
首先，应用该枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性肽其发酵产量高、提取工艺简单。其次，该枯草芽孢杆菌代谢的活性肽对多种霉菌具有生长抑制作用，对鱼饲料霉变起到很好的预防效果；该工艺不需要调整饲料配方，操作便捷、可操作性强，且活性肽使用量少、节约成本。
具体实施方式：
本发明以饲料外观为评判指标，以饲料含菌量作为辅助指标用于评判本保鲜剂对饲料防霉的效果。
将刚挤压膨化制成的饲料和反接根霉和曲霉的饲料，采用不同浓度梯度的活性肽鱼油覆膜，并采用空白鱼油做1组对照。
枯草芽孢杆菌代谢产物的制备，包括如下具体步骤：
（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r·min-1，培养24h；种子培养基的配方为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；
（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏15g，无水葡萄糖15g，MgSO4 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0；分装，装液量为三份之一体积；灭菌备用；
（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%vol；于37℃、转速100r·min-1条件下培养24h；
（4）将步骤（3）的发酵液6000r·min-1 离心10min，去除菌体后，上清液进行冷冻干燥，得到含枯草芽孢杆菌表面活性肽的冻干粉。其活性物质含量为50mg/g。
实施例 1：对比实施例
将刚挤压膨化制成的饲料用空白鱼油喷淋，制成饲料成品，作为对照组。
实施例2
将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以0.5g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油喷淋。
实施例 3
将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以1g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油喷淋。
实施例4
将冷冻干燥所得枯草芽孢杆菌表面活性肽以2g/L的添加量添加入鱼油中。在饲料加工最后一道淋油工序中，使用该鱼油。
饲料评判标准为：具有光泽，饲料表面看不到菌丝生长，不见白斑或起丝（无霉变，记为“-”）；无光泽，饲料表面出现轻微斑点或菌丝，但内部没有斑点或菌丝（轻度霉变，记为“+”）；出现轻微白斑或菌丝，但内部未见菌丝（一般霉变，记为“++”）、出现明显白斑或裂纹，内部可见菌丝（完全霉变，记为“+++”）。
采用马铃薯培养基（添加氯霉素抑制枯草芽孢杆菌生长）进行真菌培养，将直径0.8cm的饲料颗粒置于培养基中，28℃培养，判断饲料表面菌在培养基中的生长情况，并以菌落在饲料边缘长度（cm）作为染菌程度。
实施案例外观结果见表1，菌落生长情况见表2。
表1 饲料外观评价表
表2 饲料表面霉菌生长情况表
对高水分（含水量10%）饲料而言，由表1饲料外观评价可以看出，采用枯草杆菌活性肽含量为1g/L的鱼油覆膜，可在60d内保持无霉变状态，而对照组20d出现轻微霉变。表2表示饲料携带菌量的程度和被抑菌活性物质抑制生长的水平，枯草杆菌活性肽含量为1g/L的鱼油覆膜后，尽管仍在初期便携带菌，但被抑制的程度优于对照和低浓度实施案例。
实施例5
枯草芽孢杆菌的分离和鉴定
（1）该菌株分离自蜜蜂体内。从蜂箱中随机取意大利蜜蜂工蜂成虫30只，放在无菌的离心管中。在无菌操作下，加入70%的酒精浸泡5 s，取出虫体置于0.1%升汞液中消毒2 min，移至灭菌水中换洗3次，然后把虫体置于无菌的离心管中，加入5 mL的无菌水，震荡，取50μL涂布于培养基上，检查体表灭菌是否完全。消毒后的蜂体放在消毒的蜡盘中于超净工作台上解剖。取出其肠道在无菌的研钵中加入1 mL无菌水研磨，将研磨液用无菌水稀释成10-1-10-6，各稀释度取50 μL用平板涂布法进行分离，各稀释度重复3次，在30℃的恒温培养箱中培养72 h后，标记表征不同的菌落以便纯化培养，并按可数性原则对每个平板上不同的菌落进行计数。挑取表征不同的单菌落细菌划线纯化、获得纯培养、斜面保种。选取菌落生长稀疏、适当稀释度计算菌落数，求出3个重复的平均值。计算出每克(毫升)肠道中的细菌数。每克（mL）肠道中的细菌数(菌落形成单位)=平板上菌落数×稀释倍数／平板上加菌液的量（mL）。
（2）蜜蜂肠道细菌的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠；蔡妙英，2001）和《伯杰氏细菌鉴定手册》（1984）第八版实验方法，进行革兰氏染色，鞭毛染色，芽孢染色，葡萄糖氧化发酵，接触酶，吲哚，V-P，M.R，明胶液化，产H2S，苯丙氨酸，脱氨酶，柠檬酸盐、丙二酸盐、蔗糖、乳糖和甘露糖利用，硝酸盐还原等实验进行各科的分属，并对各属鉴定特征进行描述。
鉴定得到分离纯化的目的菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，V-P阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。