专利名称：药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物。
背景技术：
流感病毒存在甲、乙、丙型3种，甲型是人兽共患感染病。甲型流感病毒根据其膜表面存在的16种血凝素(HA)和9种神经氨酸酶(NA)的组合的不同存在多种亚型。并且，流感病毒根据HA的抗原性分类为低致病性病毒和高致病性病毒，低致病性病毒只会局部(呼吸器官或肠道)感染，而HA的抗原性为H5型和H7型的高致病性病毒会感染全身的脏器并增殖，使宿主死亡。流感病毒感染细胞时，需要HA与细胞表面的受体结合。流感病毒与受体结合而侵入细胞内，在细胞内增殖。此时，低致病性病毒需要利用局部分泌至细胞外的蛋白酶来使HA 裂解，藉此获得细胞感染能力，所以HA裂解和感染是偶联的。另一方面，高致病性病毒在细胞内增殖后，在释放至细胞外时HA就裂解而获得细胞感染能力。因此，存在于细胞外的高致病性病毒已具有感染力，所以HA的裂解和感染是不偶联的。于是，高致病性病毒的HA被称为自我裂解型(Kawaoka, Y.和 Webster, R. G. , Proc. Natl Acad. Sci. USA 85卷，324 — 328 页，1988)。另外，流感病毒所感染的受体具有动物种特异性，因此禽流感病毒通常不会感染人类。但是，有人指出禽流感病毒存在发生突变、改变受体识别、从而感染人类的危险性。至今为止，已确认多起从禽类到人类的感染，但尚未确认人类之间的感染。但是，一旦高致病性的禽流感病毒获得对人类的感染能力，则由于人类不具有对禽流感病毒的免疫力，因此可以预见其流行会迅速扩散。因此，期待开发出针对高致病性流感病毒的预防药和治疗药。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是提供一种流感病毒感染抑制剂。解决问题的手段
至今为止，尚不知晓高致病性流感病毒如何能侵入全身的细胞。其原因在于，如上所述，高致病性流感病毒在细胞外就已发生HA裂解，因此对全身的细胞的感染无法通过裂解中所用的蛋白酶的表达模式(発現〃夕一>)来说明。另外，已知高致病性流感病毒在HA裂解位点具有连续的碱性氨基酸的特异性序列RERRRKKR(序列编号I)，但该序列的功能尚不清楚。本发明人在考察该氨基酸序列的功能的过程中发现，具有该氨基酸序列的肽起到透膜肽(CPP;细胞穿透肽(Cellpenetrating peptide))的作用。于是,可以认为高致病性流感病毒利用该功能进行全身性感染，因此，本发明人制备了针对该氨基酸序列的多克隆抗体，结果成功地抑制了具有该氨基酸序列的肽向细胞内的侵入。由此可见，针对该氨基酸序列的抗体能抑制高致病性流感病毒的感染，从而完成了本发明。本发明的一种实施方式是一种抗体或其片段或者一种表达载体，所述抗体或其片段识别具有RR序列的肽，特别是识别具有氨基酸序列RERRRKKR(序列编号I)的肽，所述表达载体至少表达所述抗体及所述片段中的任一种。所述抗体或其片段优选识别RR序列作为表位，特别优选识别RERRRKKR(序列编号I)的氨基酸序列作为表位。此外，所述抗体或其片段既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。本发明的另一种实施方式是一种药物组合物或者一种侵入抑制剂，所述药物组合物含有抑制RR序列、特别是RERRRKKR(序列编号I)的细胞导入作用的抑制物质，所述侵入抑制剂抑制具有RR序列、特别是RERRRKKR(序列编号I)的氨基酸序列的肽向细胞内的侵入。所述抑制物质可以是所述抗体或其片段，或者是表达所述抗体及所述片段中的任一种的表达载体。所述高致病性流感病毒可以是甲型H5N1亚型。
本发明的又一种实施方式是一种抑制高致病性流感病毒对细胞的感染的高致病性流感病毒感染抑制剂、或一种由高致病性流感病毒引起的流感的预防或治疗用的药物，其中，所述高致病性流感病毒感染抑制剂或药物含有抑制RR序列、特别是RERRRKKR(序列编号I)的细胞导入作用的抑制物质。所述细胞优选不具有功能性流感病毒受体，特别优选呼吸器官和肠道以外的细胞，为呼吸器官或肠道的细胞时，优选流感病毒受体的功能被抑制。所述抑制物质可以是所述抗体或其片段，或者是表达所述抗体及所述片段中的任一种的表达载体。所述高致病性流感病毒可以是甲型H5N1亚型。本发明的又一种实施方式是一种高致病性流感病毒的预防方法或治疗方法，其包括对健康人或已感染高致病性流感病毒的流感患者给予抑制RR序列、特别是RERRRKKR (序列编号I)的细胞导入作用的抑制物质的工序。所述抑制物质可以是所述抗体或其片段，或者是表达所述抗体及所述片段中的任一种的表达载体。所述高致病性流感病毒可以是甲型H5N1亚型。还可以在抑制低致病性流感病毒的感染通路的同时对所述患者给药，例如可以并用神经氨酸酶抑制剂。所述神经氨酸酶抑制剂优选选自下组奥司他韦、扎那米韦、它们的盐、它们的水合物以及它们的混合物。[相关申请的交叉引用]
本申请要求基于2009年11月20日提出的日本专利申请2009-26539的优先权，通过弓I用该基础申请而将其包括在本说明书中。
图I是本发明的一个实施例的图，其表不的内容是具有RR序列的妝侵入细胞内。A、B中，左上方均为GFP的荧光信号，右上方均为使用抗GFP抗体的抗体染色的信号，左下方均为DAPI的核染色信号，右下方均为GFP的荧光信号-使用抗GFP抗体的抗体染色的信号-DAPI的核染色信号的三重照片。图2是本发明的一个实施例的图，其表示的内容是识别具有RR序列的肽的多克隆抗体抑制该肽向细胞内的侵入。左栏的4张照片所示为DAPI的核染色信号，右栏的4张照片所示为使用抗GFP抗体的抗体染色的信号，上4张照片所示为使用了用识别具有RR序列的肽的多克隆抗体进行了处理的GFP-RR融合蛋白的实验的结果，下4张照片所示为使用了用免疫前的兔血清进行了处理的GFP-RR融合蛋白的对照实验的结果。
图3是本发明的一个实施例的图，其表示的内容是识别具有RR序列的肽的多克隆抗体的Fab片段抑制该肽向细胞内的侵入。A所示为使用了用免疫前的兔血清进行了处理的GFP-RR融合蛋白的对照实验的结果，B所示为使用了用识别具有RR序列的肽的多克隆抗体进行了处理的GFP-RR融合蛋白的实验的结果。图4是本发明的一个实施例的图，其表示的内容是使高致病性流感病毒感染已用唾液酸酶除去了细胞表面的唾液酸的细胞时，RR序列特异性抗体具有感染抑制效果。A所示为用PBS进行了处理的高致病性流感病毒的感染的实验结果，B所示为用含RR序列特异性抗体的血清进行了处理的实验结果。B右图是用DAPI将细胞核染色的照片。
具体实施例方式对实施方式和实施例没有特别说明的情况下,采用J. Sambrook, E. F. Fritsch& T. Maniatis (编)，分子克隆实验指南(Molecular cloning, a laboratory manual)(第3版)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press),纽约冷泉港，(2001) ；F. M. Ausubel，R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K.Struhl (编)，新编分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology),约翰韦利森出版社(John Wiley & Sons Ltd.)等标准的试验方案集中记载的方法或者对其进行修饰、改变后的方法。使用市售的试剂盒或测定装置的情况下，如无特别说明，则采用它们附带的试验方案。本发明的目的、特征、优点及其技术思想通过本说明书的记载而为本领域技术人员所知，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员即可容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式及具体实施例等表示本发明的优选实施方式，是为了例举或说明而示出的，本发明并不限定于此。对本领域技术人员而言明确的是，在本说明书中揭示的本发明的思想及范围内，可以基于本说明书的记载进行各种修饰。本发明的一种实施方式是一种抑制RR序列、特别是RERRRKKR (序列编号I)的细胞导入作用的抑制物质。该抑制物质优选识别具有RR序列的肽的抗体(以下称为RR肽识别抗体)，但只要抑制RR序列的细胞导入作用则没有特别限制，也可以是适体、环状肽、低分子化合物等。为抗体时，只要在结构上抑制RR序列的功能则没有特别限制，优选识别RR序列作为表位。该抗体既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，还可以是人源化抗体等人工抗体。这些抗体可以按照本领域技术人员熟知的制造方法制造。此时所用的抗原既可以是RR序列本身，或者也可以与半抗原等结合。 RR序列是指高致病性流感病毒在HA裂解位点所具有的碱性氨基酸序列，由5 8个碱基的氨基酸构成。具体而言，包括甲型H5N1亚型流感病毒所具有的RERRRKKR(序列编号I)及其突变型序列(序列编号2 4)以及甲型H7亚型流感病毒所具有的碱性氨基酸序列(序列编号5 9)(参照表I)。 [表 I]
权利要求
1.一种抗体或其片段，其识别具有RR序列的肽。
2.权利要求I所述的抗体或其片段，其特征在于，识别RR序列的氨基酸序列作为表位。
3.权利要求I或2所述的抗体或其片段，其特征在于，RR序列是RERRRKKR，即序列编号I。
4.权利要求I 3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
5.一种DNA，其编码权利要求I 4中任一项所述的抗体或其片段。
6.—种表达载体,其包含权利要求5所述的DNA,能表达权利要求I 4中任一项所述的抗体或其片段。
7.—种药物组合物，其含有抑制RR序列的细胞导入作用的抑制物质。
8.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制物质是权利要求I 4中任一项所述的抗体或其片段，或者是权利要求6所述的表达载体。
9.一种流感预防或治疗用的药物，其含有权利要求7所述的药物组合物。
10.权利要求9所述的流感预防或治疗用的药物，其特征在于，与神经氨酸酶抑制剂并用。
11.一种侵入抑制剂，其抑制具有RR序列的肽向细胞内的侵入，其特征在于，含有抑制所述RR序列的细胞导入作用的抑制物质。
12.权利要求11所述的侵入抑制剂，其特征在于，所述抑制物质是权利要求I 4中任一项所述的抗体或其片段，或者是权利要求6所述的表达载体。
13.—种高致病性流感病毒感染抑制剂，其抑制具有RR序列的高致病性流感病毒向细胞内的感染，其特征在于，含有抑制所述RR序列的细胞导入作用的抑制物质。
14.权利要求13所述的高致病性流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述细胞不具有功能性的流感病毒受体。
15.权利要求14所述的高致病性流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述细胞是呼吸器官和肠道以外的细胞，或者，所述细胞是呼吸器官或肠道的细胞时，流感病毒受体的功能被抑制。
16.权利要求13 15中任一项所述的高致病性流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述抑制物质是权利要求I 4中任一项所述的抗体或其片段，或者是权利要求6所述的表达载体。
17.权利要求13 15中任一项所述的高致病性流感病毒感染抑制剂，其特征在于，所述高致病性流感病毒是甲型H5N1亚型。
全文摘要
本发明的目的是提供一种流感病毒感染抑制剂。具体而言，本发明将识别具有氨基酸序列RERRRKKR(序列编号1)的肽的抗体等抑制RR序列的细胞导入作用的抑制物质制成药物组合物，制造含有该药物组合物的流感病毒感染抑制剂。
文档编号A61P31/12GK102782129SQ20108006155
公开日2012年11月14日 申请日期2010年11月19日 优先权日2009年11月20日
发明者樱井阳, 芝崎太 申请人:公益财团法人东京都医学综合研究所