基于pd-l1的免疫疗法

基于pd-l1的免疫疗法
【专利摘要】本发明涉及预防和治疗临床病症的领域，所述临床病症包括癌症、自身免疫疾病和传染病。具体而言，本发明提供了包含PD-L1或其肽片段的疫苗组合物，所述疫苗组合物能够激发可用于治疗癌症、自身免疫疾病或传染病的免疫反应。
【专利说明】基于PD-L1的免疫疗法
[0001]本申请中引用的全部专利和非专利参考文献通过引用方式完整地并入本文。
发明领域
[0002]本发明涉及预防和治疗临床病症的领域，所述临床病症包括癌症、自身免疫疾病和传染病。具体而言，本发明提供了包含ro-Li或其肽片段的疫苗组合物，所述疫苗组合物能够激发可用于治疗癌症、自身免疫疾病或传染病的免疫反应。
[0003]发明背景
[0004]免疫系统具有识别并摧毁肿瘤细胞的能力；然而，尽管瘤性转化与免疫原性抗原表达有关，但免疫系统经常不能有效地针对这些抗原发生反应。免疫系统对这些抗原变得耐受。当这种情况出现时，肿瘤细胞不可控地增殖，导致恶性癌形成，伴随受累个体预后不良。为了成功的进行癌症免疫疗法，必须解决所获得的耐受性状态。
[0005]系列证据表明,T细胞是针对抗癌细胞的免疫反应中的主要效应子。免疫调节蛋白如吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和程序性细胞死亡I配体I (ro-Ll)在抗癌免疫反应的免疫抑制和耐受性诱导中发挥重要作用。CTLA-4是T细胞反应的关键负向调节物，其可以限制抗肿瘤免疫反应。最近，CTLA-4抗体伊匹木单抗在临床III期研究中显示效果后由FDA以及EMEA批准用于治疗黑色素瘤。对抗肿瘤特异性免疫力和干扰有效抗癌免疫疗法 的另一种核心机制需要致耐受性树突细胞(DC)从中发挥重要作用，从而使免疫反应偏离有效免疫的特定环境。
[0006]编程死亡-1 (PDl)是调节性表面分子，它传输对维持T细胞针对其同族抗原的功能性沉默重要的抑制性信号。其配体，称作ro-Ll和ro-L2，或B7-H1和B7-H2，表达炎性微环境中的APC、肿瘤细胞、胎盘和非造血性细胞上。干扰ro-1或其配体ro-Ll增加抗肿瘤免疫力。PD-Ll的上调似乎是癌症可以用来规避宿主免疫系统的机制。PD-Ll在肿瘤上的表达与许多癌症的不良临床结果相关，所述癌症包括胰癌、肾细胞癌，卵巢癌、头颈癌和黑色素瘤(Hamanishi 等人,2007, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.104:3360-3365 ；Nomi 等人，2007，Clin.Cancer Res.13:2151-2157 ；Hino 等人，2010，Cancer.116:1757-1766)。因此，分析来自肾细胞癌患者的196份肿瘤试样发现ro-Li的高度肿瘤表达与肿瘤侵A性增加和增加4.5倍的死亡风险相关(Thompson等人,2004, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.101:17174-17179)。具有较高I3D-Ll表达的卵巢癌患者比具有较低I3D-Ll表达的那些患者具有明显较差的预后。在ro-Ll表达和表皮内CD8+T-淋巴细胞计数之间观察到了反相关性，这表明肿瘤细胞上的ro-Ll可以抑制抗肿瘤⑶8+T细胞(Hamanishi等人，2007，见上文)。
[0007]发明简述
[0008]本发明解决了癌症的免疫抑制问题，这基于发明人令人惊讶的发现了癌症患者中针对表达ro-Li的细胞的自发性细胞毒免疫反应。这些研究结果开启了可总体适用于控制癌症疾病的新的治疗和诊断方法。
[0009]有趣地，所述研究结果不限于癌症，还可用于以存在表达ro-Ll的不利细胞为特征的其他临床病症。
[0010]本发明通过直接杀死表达ro-Ll的癌细胞和通过杀死表达ro-Ll的调节性细胞，而靶向癌症疾病。这一点通过使T细胞能够识别表达ro-Ll的细胞而实现。同样地，当临床病症是感染时，使T细胞能够杀死表达ro-Ll的APC/DC。
[0011]因此，癌细胞和APC中免疫抑制酶ro-Ll的表达与靶向这些表达ro-Ll的细胞的本发明方法关联。这种方法，尤其由于它杀死APC/DC，而与本领域的普遍意见抵触，其通常尝试抑制ro-Ll以便消除APC/DC周围的耐受性环境，同时保留认为发动有效免疫反应所需的这些细胞。
[0012]另外，针对表达ro-Ll的细胞的自发性细胞毒免疫反应的研究结果尤为令人惊讶，原因是表达ro-Ll的细胞拮抗其他免疫疗法的期望效果。因此，靶向ro-Ll和靶向肿瘤的免疫疗法的组合是高度协同的。
[0013]体内存在对ro-Ll特异的τ细胞反应表明，癌症患者能够应答于存在的ro-Ll肽而在体内产生针对ro-Li的τ细胞反应。因此满足了产生τ细胞反应的两个条件:τ细胞存在于癌症患者中和它们具有扩充能力，这在本申请中显示。这符合免疫学领域的常识:提供额外ro-Li蛋白质或ro-Li肽将导致ro-Li特异性τ细胞反应的产生。
[0014]与B细胞上单独可以识别抗原的膜结合型抗体相反，T细胞识别一种复合物配体，所述复合物配体包含与称作主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质结合的抗原肽。在人类中，这种分子称作人白细胞抗原(HLA)。HLA I类分子以细胞内部蛋白质降解产生的肽为对象并且将这些在细胞表面的肽呈递至T细胞。因此，这使得T细胞能够扫描细胞变异。当T细胞在HLA分子环境下遭遇抗原时，它经历克隆性扩充并分化成记忆T细胞和各种效应T细胞。因此，自发性免疫反应的鉴定是抗原作为T细胞靶的证据。这证明特定T细胞已经被活化并已经在体内得到扩充。
[0015]在本申请实施例1和3中使用的酶联免疫斑点(ELISP0T)方法是非常敏感的测定法，其证明了存在体内免疫反应，不存在原初T细胞。同样地，肽-MHC-四聚体已成功地用来鉴定并研究对肿瘤相关抗原(TAA)特异的T细胞，所述T细胞内源地或在患者中接种后形成。四聚体也已经用来分离并扩充用于过继细胞免疫疗法的TAA特异性T细胞。本申请证明了 ro-Ll-四聚体特异性τ细胞的存在(见实施例3)，还证明了体内进行的ro-Ll反应。
[0016]本发明涉及一种用作药物的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含SEQ ID N0:1的PD-Ll或与之相同至少70%的其功能同源物或免疫原性活性肽片段或者编码所述ro-Ll、其所述功能同源物或所述肽片段的核酸，所述免疫原性活性肽片段包含ro-Li或其所述功能同源物的至少8个氨基酸的连续序列；和佐剂。
[0017]在本发明涉及一种包含疫苗组合物和其他免疫刺激性组合物的组分套装的方面，提供了基于以上所公开疫苗的免疫疗法组合的协同效应。
[0018]本发明还提供了本发明疫苗与其他癌症疗法如化疗药组合的方面。
[0019]本发明还提供了本发明疫苗与其他抗感染治疗如免疫疗法和/或抗生素组合的方面。
[0020]本发明 还提供了通过落在本发明范围内的上文描述的任何手段治疗临床病症如癌症或感染的方法；所述手段包括向患有该临床病症的个体施用有效量如上文公开的疫苗组合物或包含前述疫苗连同另一种免疫刺激性组合物和/或化疗药的组分套装。
[0021]因此本发明的目的还在于ro-Ll或其包含ro-Ll或其功能同源物的连续序列的免疫原性活性肽片段或以上疫苗组合物在制造用于治疗或预防癌症疾病的药物中的用途。
[0022]附图简述
[0023]图1显示通过IFN-Y ELISP0T的测量，证明存在针对PDLlOl、PDL111和PDLl 14的T细胞反应。将TOL特异性点的平均数目(扣减在不添加肽情况下的点之后)计算为每位患者每5x10s个PBMC的数量(白三角形)。分析来自乳腺癌患者(BC)、肾细胞癌患者(RCC)、恶性黑色素瘤患者(MM)以及健康个体(HD)的PBMC。将利用或不利用I3DLl肽的细胞以每孔5xl05个细胞一式两份铺种之前，用肽刺激T细胞一次。
[0024]图2显示通过ELISP0T测量证明存在针对I3DLlOl的T细胞反应:(a)将TOL-1Ol特异性点的平均数目(扣减在不添加肽情况下的点之后)计算为每位患者每5xl05个PBMC的数量(白三角形)。分析来自乳腺癌患者(BC)、肾细胞癌患者(RCC)、恶性黑色素瘤患者(MM)以及健康个体(HD)的PBMC。分离PMBC并且将利用或不利用TOLlOl肽的细胞直接离体以每孔5x10s个细胞一式两份铺种。(b)通过TNF- a ELI SPOT所测量的针对I3DLlOl的T细胞反应。将PDL特异性点的平均数目(扣减在不添加肽情况下的点之后)计算为每位患者每5x10s个PBMC的数量(白三角形)。分析来自乳腺癌患者(BC)、肾细胞癌患者(RCC)、恶性黑色素瘤患者(MM)以及健康个体(HD)的PBMC。将利用或不利用I3DLlOl肽的细胞以每孔5xl05个细胞一式两份铺种之前，用肽刺激T细胞一次。
[0025]图3显示TOLlOl特异 性T细胞的功能能力:(a)通过51Cr-释放测定法测量利用T细胞大体积培养物(T-cell bulk culture)以不同的效应子对靶比率对用I3DLlOl肽(红色)或无关肽(蓝色)(HIV-lpol476_484)脉冲标记(pulse)的T2-细胞的溶解。(b)通过51Cr-释放测定法测量利用T细胞大体积培养物以不同的效应子对靶比率对乳腺癌细胞系MDA-MB-231 的溶解。
[0026]图4显示针对I3D-Ll的天然T细胞反应。(A)通过IFN-yELISPOT测量的针对PD-LlOl肽(PDL115-23 ;LLNAFTVTV)的T细胞反应。一位肾细胞癌(RCC)患者和两位恶性黑色素瘤(MM)患者针对I3D-LlOl的ELISP0T反应的例子。(B)总计，来自23位癌症患者和24位健康供体的PBMC用肽刺激一次并使用IFN- y ELIPOT筛选针对TO-LlOl的反应。将ro-Lioi特异性点的平均数目(扣减在不添加肽情况下的点之后)计算为每位患者每5x10s个PBMC的数目。Mann-Whitney检验揭示与健康供体相比，癌症患者中TO-LlOl特异性T细胞反应频率较高，P-值=0.06。(C)来自六位黑色素瘤患者(MM.03、丽.04、丽.05、MM.13和MM.135)、一位乳腺癌患者(CM.21)和一位肾细胞癌患者(RCC.46)的PBMC中响应于I3D-LlOl (黑色棒)或在无肽情况下(灰色棒)的IFN- Y ELISP0T的例子。⑶来自六位黑色素瘤患者(MM.03、丽.04、丽.05、丽.13和丽.19)、一位乳腺癌患者(CM.21)和一位肾细胞癌患者(RCC.46)的PBMC中响应于TO-LlOl (黑色棒)或在无肽情况下(灰色棒)的TNF-a ELI SPOT。全部实验均一式三份进行并且分布不拘再抽样(DFR)检验证实了针对PD-L101的显著反应。
[0027]图5显示针对离体F1D-Ll的T细胞反应。(A)黑色素瘤患者(MM.03)中通过离体IFN- Y ELISP0T所测量的针对ro-LlOl肽(PDL115-23 ；LLNAFTVTV)的T细胞反应的例子。(B)来自两位恶性黑色素瘤患者(MM.03和丽.04)和一个肾细胞癌患者(RCC.46)的PBMC中应答于ro-L101(黑色棒)或在无肽情况下(灰色棒)的离体IFN-YELISPOT。全部实验均一式三份进行并且分布不拘再抽样(DFR)检验证实了针对ro-L101的显著反应。(C)与下述各种肽交换的UV敏感配体(KILGFVFJV)的ELISA分析:CMV/HLA_A2 (pp65pos495_503 ；NLVPMVATV)、HIV/HLA-A2(pol476-484 ；ILKEPVHGV)和 PD-L101(PDL115-23 ；LLNAFTVTV)、无UV (不暴露于UV光)和无肽(在无拯救肽(rescue peptide)的情况下)。(D)通过使用四聚体HLA-A2/ro-L101-PE、HLA-A2/HIV-PE以及抗体CD8-太平洋蓝/APC别藻蓝蛋白的流式细胞术染色法可视化的，PD-LlOl特异性T细胞的四聚体分析；来自一位乳腺癌患者(CM.21)(顶部)和一位恶性黑色素瘤患者(MM.05)(底部)的PBMC当中PD-LlOl特异性CD8T细胞的两个例子。直接离体(左侧)、在一次体外肽刺激后(中部)和在三次肽刺激后(右侧)进行染色。
[0028]图6显示I3D-Ll特异性T细胞的细胞毒功能性。(A)51Cr-释放测定法，其代表在第三次肽刺激后，CM.21T细胞培养物溶解的用PD-LlOl肽(TOL115-23)或无关HIV肽(HIV-lpol476-484)脉冲标记的T2-细胞的百分数。⑶在三次肽刺激后，MM.05T细胞培养物溶解的用I3D-LlOl肽(TOL115-23)或无关HIV肽(HIV_lpol476-484)脉冲标记的T2-细胞的百分数。(C)通过GrBELISPOT所测量的针对I3D-LlOl的溶细胞反应。显示来自三位黑色素瘤患者(MM.03，丽.53和丽.135)的PBMC中响应于I3D-LlOl (黑色棒)或在无肽情况下(灰色棒)的GrB ELISP0T应答。全部实验均一式三份进行并且分布不拘再抽样(DFR)检验显示了两位患者中针对F1D-LlOl的显著反应。
[0029]图7显示针对F1D-Ll+癌细胞的溶细胞活性。(A)通过51Cr-释放所测定的,在不同的效应子对靶比率下，PD-LlOl特异性T细胞培养物(CM.21)在具有或没有IFN-Y处理的情况下对HLA-A2+黑色素瘤细胞系丽.06 (左)或丽.07 (右)的溶解。(B)显示在具有或没有IFN- Y处理的情况下丽.07和丽.06上PD-Ll表面表达的直方图。(C)富含TO-LlOl的T细胞培养物对HLA-A2+黑色素瘤细胞系MM.06 (方块)或MM.07 (圆圈)的溶解。
[0030]图8显示ro-Ll依赖性树突细胞的溶解。(A-B) PD-Ll特异性T细胞培养物(顶部)溶解无siRNA的自体mDC (黑色圆圈)、用针对I3D-Ll的siRNA (0.05nmol (黑色方块)、
0.1Onmol (黑色星号)和0.25nmol (黑色三角形))和用对照siRNA (白色圆圈)转染的mDC的百分数。C)流式细胞分析，其显示在无转染情况下的mDC上和用针对I3D-Ll以三个不同浓度(0.05nmol、0.1Onmol和0.25nmol)转染的mDC上以及用对照siRNA转染的DC上PD-Ll表面表达情况。
[0031]图9显示非专业抗原呈递细胞的TAP非依赖性交叉呈递。(A)通过标准51Cr-释放测量的，PD-LlOl特异性T细胞培养物对用PD-LlOl肽(TOL115-23)(黑色方块)、PDLongl(PD-L19-28 ;FMTYWHLLNAFTVTVPKDL)(黑色星号)、PDLong2(PDL1242-264 ;VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG)(黑色三角形)、PD-Ll蛋白(白色方块)或无关HIV肽(HIV-lpol476-484)(灰色圆圈)脉冲标记的HLA-A2+EBV转染的B-细胞系(KIG-BCL)的溶解。(B)通过标准51Cr-释放测量的，PD-LlOl特异性T细胞培养物对用PD-LlOI肽(PDL115-23)(黑色方块)、PDLongl (PD-L19-28 ；FMTYWHLLNAFTVTVPKDL)(黑色星号)、PDLong2 (PDL1242-264 ；VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG)(黑色三角形)、PD-L1 蛋白(白色方块)或无关HIV肽(HIV-lpol476-484)(灰色圆圈)脉冲标记的T2-细胞的溶解。(C)通过用TOLongl或roLongl+HLA-A2阻断抗体脉冲标记的T2-细胞的溶解，来评估I3D-Ll特异性T细胞的HLA-A2限制性杀死作用。(D)显示ro-Ll在KIG-BCL和T2细胞系上表面表达的柱状图。
[0032]发明详述
[0033]本发明的主要目的是提供一种包含ro-Li或其免疫原性活性多肽片段的疫苗组合物，其用作药物用于预防临床病症、降低该临床病症的风险或治疗该临床病症，其中所述临床病症优选地选自癌症、传染病和自身免疫疾病。
[0034]定义
[0035]佐剂:在与ro-Li或其免疫原性活性肽片段的混合施用至个体时增加了针对PD-Ll或其所述肽片段的免疫反应的任何物质。优选地，所述个体是人类并且优选地，所述免疫反应是T细胞反应。
[0036]抗体:免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整免疫球蛋白分子或其保留免疫活性的片段。
[0037]抗原:能够与克隆分布的免疫受体(T细胞或B-细胞受体)结合的任何物质。通常，肽、多肽或多聚多肽。抗原优选地能够激发免疫反应。
[0038]APC:抗原呈递细胞。APC是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC分成两类:专业型(其存在三个类型:树突细胞、巨噬细胞和B细胞)或非专业型(不以组成型方式表达与原初T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物蛋白； 这些蛋白质仅在通过某些细胞因子如IFN-Y刺激非专业型APC时才表达)。
[0039]加强:为了通过加强接种或给药强化免疫，给予额外剂量的免疫剂，如疫苗，所述免疫剂在起始剂量后的某个时间给予以维持由先前剂量的同一药剂激发的免疫反应。
[0040]癌症:本文中，任何良性或恶性的前瘤性或瘤性疾病，其中“瘤性”指细胞异常增殖。
[0041]载体:与抗原结合以辅助诱导免疫反应的实体或化合物。
[0042]嵌合蛋白:由核苷酸序列编码的基因工程化蛋白，其中所述核苷酸序列通过将两个或更多个完整或部分基因或一系列(非)随机核酸剪接在一起产生。
[0043]临床病症:需要就医的病症，本文中尤其与ro-Ll表达相关的病症。这类病症的例子包括癌症、传染病或自身免疫疾病。
[0044]CTL:细胞毒T淋巴细胞。表达⑶8连同T细胞受体并因此能够响应于由I类分子呈递的抗原的T细胞亚组。
[0045]细胞因子:本文中非限定性的使用的生长或分化调节物，并且不应当限制对本发明和权利要求的解释。除细胞因子之外，黏附分子或附属分子或其任意组合可以单独使用或与细胞因子组合使用。
[0046]递送载具:可以借以将核苷酸序列或多肽或二者从至少一种介质运输至另一种介质的实体。
[0047]DC:树突细胞。(DC)是免疫细胞并且形成哺乳动物免疫系统的一部分。它们的主要功能是加工抗原物质并在表面上将它呈递给免疫系统的其他细胞，因此作为抗原呈递细胞(APC)发挥作用。
[0048]片段:用来指核酸或多肽的非全长部分。因而，片段本身分别也是核酸或多肽。[0049]功能同源物:功能同源物可以是与野生型多肽显示出至少一些序列同一性并已经保留野生型多肽功能性的至少一个方面的任何多肽。本文中，PD-Ll的功能同源物具有诱导针对表达ro-Ll的细胞的τ细胞免疫反应的能力。
[0050]个体:通常指任何鸟类、哺乳动物、鱼类、两栖类或爬行类的物种或亚种，优选地是哺乳动物，最优选地是人类。
[0051]感染:本文中，术语“感染”指任何种类的产生免疫反应的临床病症并因此包括感染、慢性感染、自身免疫病和变应性炎症。
[0052]分离:与本文中公开的核酸、多肽和抗体联系使用时，‘分离’指这些实体已经被鉴定并分离和/或从其天然环境(一般是细胞环境)的组分回收。本发明的核酸、多肽和抗体优选地是分离的，并且本发明的疫苗和其他组合物优选地包含分离的核酸、多肽或分离的抗体。
[0053]MHC:主要组织相容性复合物，存在两个主要亚类MHC I类和II类。
[0054]核酸构建体:基因工程化的核酸。一般包含几种元件，如基因或基因片段、启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸尾、接头、多接头、可操作性接头、多克隆位点(MCS)、标记、终止密码子、其他调节元件、内部核糖体进入位点(IRES)或其他。
[0055]病原体:特定疾病致病因子，尤其是可以对其宿主造成疾病的生物因子如病毒、细菌、朊病毒或寄生虫，也称作感染性物质。
[0056]PBMC:外周血单核细胞(PBMC)是具有圆形胞核的血细胞，如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是免疫系统抗击感染并适应于入侵者的关键组分。淋巴细胞群体由T细胞(CD4和CD8阳性约75%)、B细胞和NK细胞(合并约25%)组成。
[0057]药用载体:还称作赋形剂或稳定剂，使用剂量和浓度对其暴露的细胞或个体无毒。经常地，生理可接受载体是pH缓冲的水溶液。生理可接受载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如EDTA ;糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN?、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS?。
[0058]多个:至少两个。
[0059]启动子:DNA链中RNA聚合酶与之结合以启动一个或多个近旁结构基因的信使RNA转录的结合位点。
[0060]Treg:调节性T细胞/T淋巴细胞
[0061]疫苗:能够在动物中诱导免疫反应的物质或组合物。疫苗在本文中也称作“疫苗组合物”或称作“免疫原性组合物”。根据本发明，所述免疫反应优选地是T细胞反应。本发明的疫苗可以作为预防性药物和/或治疗性药物给予。
[0062]变体:给定参考核酸或多肽的“变体”指与所述参考核酸或多肽显示某种程度的序列同一性但是与参考核酸或多肽不同的核酸或多肽。
[0063]PD-Ll
[0064]本发明的ro-Li是“程序性 细胞死亡I”的配体。人ro-Li是
[0065]PD-Ll以高水平在癌细胞中以及在调节性T细胞中表达。因此，本发明的疫苗组合物可用于预防和/或治疗以存在表达高水平的ro-Li的不利细胞为特征的临床病症。
[0066]因此，不仅癌症，还有广泛的感染和尤其慢性感染的感染，以及自身免疫疾病，均是与本发明有关的临床病症。
[0067]由于表达ro-Ll的T细胞拮抗其他免疫疗法的期望效果，所以(例如通过接种)靶向表达ro-Ll的细胞在作用方面与其他抗癌免疫疗法高度地协同。在本申请中证明，CTL限定的ro-Ll表位广泛地适用于治疗性接种并因此具有巨大的免疫治疗价值。
[0068]因此，本发明的一个方面是提供一种包含ro-Ll或其免疫原性活性多肽片段的疫苗组合物，用作治疗临床病症的药物。所述临床病症可以是癌症并且本发明的又一个方面是预防癌症、降低癌症的风险或治疗癌症。另一个方面涉及本发明疫苗组合物与其他药物如免疫治疗药物和/或化疗药组合使用。然而，一个方面涉及如本文所公开的疫苗组合物用于治疗病毒源和/或微生物源疾病的用途并且进一步涉及所述疫苗与其他药物如免疫治疗药物和/或抗生素和/或抗病毒药组合使用。
[0069]本发明的疫苗组合物包含ro-Ll或其免疫原性活性肽片段，用于治疗有需求的个体中的临床病症。优选地，所述ro-Ll是该个体的物种的ro-Ll。因而，如果有需求的个体是特定种类的哺乳动物，则所述ro-Ll优选地是所述特定种类哺乳动物的ro-Ll。在本发明的一个优选实施方案中，疫苗组合物包含SEQ ID NO:1的人ro-Ll或其免疫原性活性肽片段。野生型人ro-Ll，即天然存在的非突变形式的多肽，被确定为SEQ ID N0:1。
[0070]然而，在本发明的某些实施方案中，本发明的疫苗组合物包含如下文定义的ro-Ll的功能同源物或其免疫原性活性肽片段。 [0071]本发明因此涉及疫苗组合物，其包含佐剂和:
[0072]i)SEQ ID NO:1 的 PD-L1 ;或
[0073]ii) SEQ ID NO:1的PD-L1的免疫原性活性肽片段；或
[0074]Iii)与之相同至少70%的SEQ ID NO:1的TO-Ll的功能同源物；或
[0075]iv)与之相同至少70%的SEQ ID NO:1的I3D-Ll的功能同源物的免疫原
[0076]性活性肽片段，其中所述免疫原性活性肽片段是SEQ ID NO:1的TO-Ll
[0077]的免疫原性活性肽片段，其中已经置换最多三个氨基酸，或
[0078]V)编码i)至iv)中任一者的核酸。
[0079]术语“肽片段”在本文中用来定义任何非全长(与SEQ ID N0:1相比)的一串氨基酸残基，所述氨基酸残基直接源自SEQ ID NO:1的连续氨基酸串或据此合成。
[0080]功能同源物可以定义为全长ro-Ll或其片段，其在序列方面不同于野生型ro-Ll，如SEQ ID NO:1的野生型人ro-Ll，但是仍能够诱导针对表达ro-Ll的细胞如癌细胞和DC的免疫反应。这些细胞中表达的ro-Ll可以是野生型或内源突变(如先天性突变体或在细胞分裂期间或其他情况下诱导的突变)。功能同源物可以是野生型ro-Ll的突变形式或可变剪接变体。在另一个方面，如下文描述那样定义ro-Ll的功能同源物。功能同源物可以是，但不限于，全长或片段化ro-Li的具有离体引入的一个或多个突变和/或一个或多个序列缺失和/或添加的重组形式。
[0081]PD-Ll的功能同源物可以是任何蛋白质/多肽，其与SEQ ID NO:1显示出至少一些序列同一性并且具有诱导针对表达ro-Li的细胞的免疫反应的能力。
[0082]因此，本发明的ro-Ll的功能同源物优选地与SEQ ID NO:1的TO-Ll具有至少70%序列同一性，并且因此，功能同源物优选地与SEQ ID NO:1的人I3D-Ll的序列具有至少75%序列同一性，例如至少80%序列同一性,如至少85%序列同一性,例如至少90%序列同一性，如至少91%序列同一性,例如至少91%序列同一性,如至少92%序列同一性,例如至少93%序列同一性，如至少94%序列同一性,例如至少95%序列同一性,如至少96%序列同一性,例如至少97%序列同一性,如至少98%序列同一性,例如99%序列同一性，并且具有诱导针对表达ro-Li的细胞的免疫反应的能力。
[0083]本发明的序列同一性在整个参考序列范围内确定并且因此与SEQ ID NO:1的序列同一性是在SEQ ID NO:1的整个长度范围内确定的。可以使用许多熟知算法并采用许多不同空位罚分计算序列同一性。相对于全长SEQ ID NO:1计算序列同一性。任何序列比对工具，如但不限于FASTA、BLAST或LALIGN，都可以用于检索同源物并且计算序列同一性。另外，可以使用一系列空位开口和延伸罚分进行序列比对。例如，可以使用空位开口罚分处于5-12范围内，优选为8并且空位延伸罚分处于1-2范围内，优选为I的BLAST算法。
[0084]功能等同物还可以包含正常情况下在人蛋白质中不出现的化学修饰，如遍在蛋白化、标记(例如，用放射性核素、各种酶等标记)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)、或通过插入(或通过化学合成而置换)氨基酸(氨基酸)如鸟氨酸，然而优选功能等同物不含化学修饰。
[0085]与SEQ ID NO:1的TO-Ll相比对氨基酸残基序列所做出的任何变化优选地是保守性置换。本领域技术人员知道怎样做出并评估“保守性”氨基酸置换，借助所述保守性氨基酸置换将一个氨基酸置换为具有一种或多种共有化学和/或物理特征的另一个氨基酸。保守性氨基酸置换不太可能会影响蛋白质的功能性。氨基酸可以根据共有特征分组。保守性氨基酸置换是将预定氨基酸组内部的一种氨基酸替换为该组内的另一种氨基酸，其中预定组内部的氨基酸显示出相似或基本上相似的特征。
[0086]本发明使用的ro-Ll或其功能同源物的免疫原性活性肽片段可以具有任何所需的长度。在一个具体实施方案中，本发明的免疫原性活性肽片段由SEQ ID NO:1所确定的PD-Ll或其功能同源物的50个或更少个氨基酸残基，例如最多45个氨基酸残基，如最多40个氨基酸残基，例如最多35个氨基酸残基，如最多30个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，如18至25个连续氨基酸组成；所述功能同源物是这样一种功能同源物，其中最多三个氨基酸已经替换，如两个氨基酸，如一个氨基酸已经替换为另一个氨基酸，优选地通过保守性替换。
[0087]因此在另一个具体实施方案中，本发明的免疫原性活性肽片段由来自SEQ IDNO:1的ro-Ll或其功能同源物的最多25个氨基酸残基，如最多24个氨基酸残基，如最多23个氨基酸残基，如最多22个氨基酸残基，如最多21个氨基酸残基，如最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，如最多16个氨基酸残基，例如最多15个氨基酸残基，如最多14个氨基酸残基，例如最多13个氨基酸残基，如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，如8至10个连续氨基酸组成；所述功能同源物是这样一种同源物，其中最多两个氨基酸(如一个氨基酸)已经被置换，优选地通过保守性替换。优选地，该肽包含来自SEQ ID NO:1的I3D-Ll的最多10个连续氨基酸残基，如来自如SEQ ID NO:1所确定的I3D-Ll或其功能同源物的9个连续氨基酸残基，如8个连续氨基酸残基，如7个连续氨基酸残基；所述功能同源物是这样一种功能同源物，其中最多两个氨基酸，如一个氨基酸已经置换为另一个氨基酸，优选地通过保守性替换。
[0088]因此在一些实施方案中，本发明的免疫原性活性肽片段是九肽(包含9个氨基酸残基的肽)和一些十肽(包含10个残基)。
[0089]在本发明的一个优选实施方案中，免疫原性活性肽片段包含从由表1中列出的肽组成的组中选出的肽，更优选地包含从由SEQ ID N0:2、12和15组成的组中选出的肽。优选地，所述免疫原性活性肽片段由最多25个氨基酸残基，如最多24个氨基酸残基，如最多23个氨基酸残基，如最多22个氨基酸残基，如最多21个氨基酸残基，如最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，如最多16个氨基酸残基,例如最多15个氨基酸残基,如最多14个氨基酸残基,例如最多13个氨基酸残基，如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，如10个氨基酸，例如9个氨基酸组成，并且包含由表1中列出的肽组成的组中选出的肽序列，更优选地包含从由SEQ ID N0:2、12和15组成的组中选出的肽。
[0090]在本发明的一个非常优选实施方案中，所述免疫原性活性肽片段选自由表1中列出的肽组成的组，并且更优选地选自由SEQ ID NO: 2、12和15组成的组。
[0091]表1
[0092]
【权利要求】
1.疫苗组合物，其包含 a)SEQ ID NO:1的I3D-Ll或与之至少70%相同的其功能同源物或其免疫原性活性肽片段或者编码所述ro-L1、所述功能同源物或所述肽片段的核酸，其中所述免疫原性活性肽片段包含ro-Ll或其功能同源物的至少8个连续氨基酸的序列；和 b)佐剂； 所述疫苗组合物用作药物。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物包含免疫原性活性肽片段，所述免疫原性活性肽片段由SEQ ID NO:1的I3D-Ll的5至50个连续氨基酸序列组成，其中可以置换最多3个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物包含免疫原性活性肽片段，所述免疫原性活性肽片段由SEQ ID NO:1的I3D-Ll的7至40个连续氨基酸序列组成，其中可以置换最多3个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物包含免疫原性活性肽片段，所述免疫原性活性肽片段由SEQ ID NO:1的I3D-Ll的8至20个连续氨基酸序列组成，其中可以置换最多2个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物包含免疫原性活性肽片段，所述免疫原性活性肽片段由SEQ ID NO:1的I3D-Ll的8至15个连续氨基酸序列组成，其中可以置换最多I个氨基酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其包含肽片段，其中所述肽片段由SEQ ID NO:1的I3D-Ll的8至12个连续氨基酸组成。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含由最多50个氨基酸残基，例如最多45个氨基酸残基,如最多40个氨基酸残基,例如最多35个氨基酸残基,如最多30个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，如20至25个氨基酸残基组成的免疫原性活性肽片段。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含由最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，如最多16个氨基酸残基，例如最多15个氨基酸残基，如最多14个氨基酸残基，例如最多13个氨基酸残基，如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，如8至10个氨基酸残基组成的免疫原性活性肽片段。
9.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含所述免疫原性活性肽片段，其中所述肽片段包含选自SEQ ID NO:2、12和15的序列。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含选自SEQID NO:2、3和4的免疫原性活性肽片段。
11.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中当施用至患有以ro-Ll表达增加为特征的临床病症的个体时，所述疫苗组合物能够激发针对表达SEQ ID NO:1的ro-Ll或其功能同源物的癌和/或抗原呈递细胞的免疫反应。
12.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其包含所述免疫原性活性肽片段，其中所述肽片段能够诱导ro-Ll特异性τ细胞的体外生长。
13.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其包含所述免疫原性活性肽片段，其中如EL1-SPOT所测定的，所述肽片段能够诱导ro-Ll特异性的释放IFN- Y的T细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其包含所述免疫原性活性肽片段，其中所述肽片段受MHC I类分子限制。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的疫苗组合物，其包含所述免疫原性活性肽片段，其中所述肽片段受MHC II类分子限制。
16.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在已经用所述疫苗组合物接种的个体中激发T细胞反应。
17.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在接种的个体中激发调节性T细胞的产生，所述调节性τ细胞具有针对表达ro-Ll的癌细胞和/或表达ro-Ll的抗原呈递细胞的细胞毒效应。
18.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其包含肽片段，所述肽片段能够在患有临床病症的个体的PBMC群体中激发PD-Ll特异性的产生INF- Y的细胞，该个体中表达了 SEQ ID NO:1的PD-Ll或其与SEQ ID NO:1具有至少70%同一性的功能同源物。
19.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物用于治疗临床病症。
20.根据权利要求18和19中任一项所述的疫苗组合物，其中所述临床病症是癌症。
21.根据权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述癌症是形成肿瘤的癌症疾病。
22.根据权利要求18和19中任一项所述的疫苗组合物，其中所述临床病症是感染，如传染病。
23.根据权利要求22所述的疫苗组合物，其中所述传染病是胞内感染，例如被选自单核增生李斯特菌(L.monocytogenes)和痕原虫属(Plasmodium)的病原体胞内感染。
24.根据权利要求22所述的疫苗组合物，其中所述传染病是病毒性感染，例如被选自HIV和肝炎病毒的病毒感染。
25.根据权利要求18和19中任一项所述的疫苗组合物，其中所述临床病症是自身免疫性疾病。
26.根据权利要求25所述的疫苗组合物，其中所述自身免疫性疾病选自糖尿病、SLE和硬化。
27.根据权利要求20至21中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在患有癌症的个体中激发临床反应，其中所述临床反应以病情稳定、部分反应或完全缓解为特征。
28.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物还包含不是PD-Ll或其免疫原性活性肽片段的免疫原性蛋白质。
29.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂和咪唑并喹啉。
30.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物,其中所述佐剂是MontanideISA佐剂。
31.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞包含所述免疫原性活性肽片段或编码所述免疫原性活性肽片段的核酸。
32.根据权利要求31所述的疫苗组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
33.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述核酸编码如权利要求2至10任一项中所定义的免疫原性活性肽。
34.根据权利要求1或33中任一项所述的疫苗组合物，其中所述核酸包含于载体中。
35.一种组分套装，其包含； a)根据权利要求1至34中任一项所述的疫苗组合物，和 b)包含至少一种第二活性成分的组合物。
36.根据权利要求35所述的组分套装，其中所述至少一种第二活性成分是免疫刺激化合物。
37.根据权利要求35或36中任一项所述的组分套装，其中所述至少一种免疫刺激化合物是一种或多种白介素。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的组分套装，其中所述白介素选自IL-2和/或 IL-21。
39.根据权利要求35所述的组分套装，其中所述第二活性成分是抗癌药。
40.根据权利要求39所述的组分套装，其中所述抗癌药是化疗药。
41.根据权利要求39或40中任一项所述的组分套装，其中所述化疗药选自:辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡钼、卡培他滨、顺钼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、佐柔比星、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、依立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利钼、紫杉醇、培美曲塞、雷利米得、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
42.根据权利要求35至41中任一项所述的组分套装，其中同时或依次施用所提供的组合物。
43.治疗以表达I3D-Ll为特征的临床病症的方法，所述方法包括向患有所述临床病症的个体施用有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的组合物，或根据权利要求35至42中任一项所述的组分套装。
44.根据权利要求43所述的方法，其中待治疗的临床病症是其中表达I3D-Ll的癌症疾病。
45.根据权利要求43和44中任一项所述的方法，其中所述方法与其他癌症疗法组合。
46.根据权利要求45所述的方法，其中其他疗法选自化疗、放疗、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树突细胞治疗。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述临床病症选自传染病和自身免疫疾病。
48.根据权利要求1至34中任一项所述的疫苗组合物或根据权利要求35至42中任一项所述的组分套装在制造用于治疗或预防临床病症的药物中的用途。
49.根据权利要求48所述的用途，其中所述临床病症是其中表达了I3D-Ll的癌症疾病。
50.根据权利要求48或49中任一项所述的用途，其与其他癌症疗法组合。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述其他疗法选自化疗、放疗、用免疫刺激物质治疗、基因治疗、用抗体治疗和使用树突细胞治疗。
52.根据权利要求48所述的用途，其中所述待治疗的临床病症选自传染病和自身免疫疾 病。
【文档编号】A61K39/00GK103917243SQ201280050948
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2011年10月17日
【发明者】梅斯·哈尔德·安德森 申请人:海莱乌医院