一种铜绿假单胞菌msha菌毛株肿瘤疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种以铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）MSHA（甘露糖敏感血凝）菌毛株为佐剂的肿瘤疫苗及其制备方法；所述肿瘤疫苗含有一组合物，该组合物中包括肿瘤抗原和灭活的铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
【专利说明】一种铜绿假单胞菌MSHA菌毛株肿瘤疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤主动特异性免疫治疗(active specific immunotherapy,ASlWjJ域，主要涉及一种以铜绿假单胞菌MSHA菌毛株为佐剂的肿瘤疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤细胞具有多种肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen, TSA)和肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA),因此可以利用肿瘤细胞作为肿瘤抗原制成肿瘤疫苗，免疫人体后能够诱导抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗肿瘤的目的。虽然肿瘤疫苗的开发已经有几十年的历史，但肿瘤疫苗的免疫效果并不令人满意，因此人们采用各种技术来增强肿瘤疫苗的免疫原性，包括近年来出现的转染了各种基因的肿瘤细胞。
[0003]最直接的肿瘤疫苗制备方法，就是将肿瘤细胞加工处理后，加上免疫佐剂来免疫患者。其中，免疫佐剂能够增加肿瘤抗原的免疫原性，从而增强肿瘤疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应，而免疫佐剂的选择就成为肿瘤疫苗研制的关键因素之一。可用于肿瘤疫苗的免疫佐剂很多，包括脂质体、微生物及其抽提成分等。为了达到最佳的免疫效果，针对不同来源和种类的免疫佐剂，必然需要与肿瘤抗原进行不同的药物组合。
[0004]因此，本领域迫切需要提供新的肿瘤疫苗佐剂，以及相应佐剂与肿瘤抗原的合适比例。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种新的肿瘤疫苗及其制备方法。
`[0006]在本发明的第一方面，提供了一种组合物，所述组合物包括肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
[0007]在另一优选例中，所述组合物包括肺癌肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株，并且10 μ g肺癌肿瘤抗原:1 X 107 — 9X 108个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株；更佳地，所述组合物中是10 μ g肺癌肿瘤抗原:1 X IO7 — 5X IO8个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株；最佳地，所述组合物中是10 μ g肺癌肿瘤抗原:1 X IO7 — I X IO8个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
[0008]在另一优选例中，所述肿瘤抗原来自肿瘤细胞的裂解产物，所述铜绿假单胞菌MSHA菌毛株已完全灭活。
[0009]在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组合物的制备方法，所述的方法包括步骤:将肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株直接混合。
[0010]在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组合物的用途，用于制备治疗或预防癌症的肿瘤疫苗。
[0011 ] 在另一优选例中，所述的癌症选自肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、神经胶质瘤、血液系统肿瘤；更佳地，所述的癌症是肺癌。
[0012]在本发明的第四方面，提供了一种铜绿假单胞菌MSHA菌毛株的用途，用作肿瘤疫苗的佐剂。
[0013]据此，本发明提供了新的肿瘤疫苗佐剂，以及相应佐剂与肿瘤抗原的合适比例。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1显示了不同剂量肿瘤抗原对肿瘤生长的影响。
[0015]图2显示了不同剂量铜绿假单胞菌MSHA菌毛株对肿瘤生长的影响。
[0016]图3显示了不同剂量组合的肿瘤疫苗对于肿瘤生长的影响。
[0017]图4显示了不同剂量组合的肿瘤疫苗对于生存率的影响。
【具体实施方式】
[0018]发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种全新的肿瘤疫苗佐剂，即铜绿假单胞菌MSHA菌毛株，并且在该发现的基础上提供了一种新的肿瘤疫苗。
[0019]如本文所用，“肿瘤疫苗”是指带有肿瘤抗原的物质，可用于治疗和/或预防肿瘤。
[0020]如本文所用，“肿瘤抗原”是来自肿瘤细胞的裂解产物。由于肿瘤细胞的裂解产物中，包含肿瘤的绝大部分可溶性成分，因此其中既有肿瘤特异性抗原(tumor specificantigen,TSA),也有肿瘤相关性抗原(tumor associated antigen,TAA)。在本发明的一个实施例中，使用小鼠肺癌3LL细胞制备肿瘤抗原。
[0021 ] 如本文所用，“佐剂(adjuvant) ”或“疫苗佐剂”可以互换使用，都是指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
[0022]如本文所用，“铜绿假单胞菌MSHA菌毛株”在中国专利申请200510059850.X中有记载，即绿脓杆菌甘露糖敏感血凝菌毛株，相关内容在此并入本申请中。菌种保藏号为CGMCCO1900本发明中所用的铜绿假单胞菌MSHA菌毛株，预先经1%甲醛完全灭活。
[0023]如本文所用，“治疗(treatment or treating) ” 一词包括可导致欲求的药学和/或生理效果的防止性(即，预防性)、治愈性或缓和性处置。该效果较佳是指医疗上可部分或完全治愈或防止癌细胞的生长。此外，“治疗”一词在此是指基于可部分或完全减轻、延迟发生、抑制进程、减轻严重性、和/或减少一种特定疾病、异常和/或医疗状况之一或多个病征出现机率的目的，而对受测个体(或患者)，尤指具有一种医疗状况、一种该医疗状况的症状、一种因该医疗状况而引起的疾病或病症、或是一种会使朝向该医疗状况发展的先期状况的个体，施用或施加本揭示内容的化合物。可对尚未出现特定疾病、异常和/或医疗状况的明显病征的个体，和/或仅对该特定疾病、异常和/或医疗状况产生早期病征的个体进行治疗，以期降低产生该特定疾病、异常和/或医疗状况相关的病理的风险。在本文中，所述病征、疾病、异常和/或医疗状况可以是原位癌或转移性癌。若能减少一或多个病征或临床指标即代表该治疗是“有效”的。
[0024]“预防(prophylaxis) ”在此是指对一种未来事件的防治手段。基于本文中预防癌细胞或因手术或诊断程序进而潜藏地增加了该些癌细胞转移的文意，因此，可在实施该手术或诊断程序之前、同时或之后，实施本文所述的预防性处置手段。
[0025]如本文所用，“施用(administered、administering或、administration)”一词在此是指直接施用所述的化合物或组合物，或施用活性化合物的前驱药(prodrug)、衍生物(derivative)、或类似物(analog)等,而可在施用个体体内形成该活性化合物的一相当用 量者。
[0026]本文中交替使用“个体(subject) ”或“患者(patient) ”等词,其是指可接受所述化合物和/或方法治疗的动物(包括人类)。“个体”或“患者”在此涵盖了雄性与雌性两种性别，除非另有具体说明。因此“个体”或“患者”包含任何哺乳类动物，包括，但不限于，人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述化合物进行治疗而获益。适合接受本发明化合物和/或方法治疗的动物较佳为人类。一般来说，“患者”一词及“个体” 一词在本文中可彼此交替使用。
[0027]虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
[0028]除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。 [0029]本发明提供一种组合物，其中包括肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株；所述的肿瘤抗原包括但不限于，3LL肺癌肿瘤抗原。
[0030]在本发明的一种实施方式中，本发明提供的组合物中含有的铜绿假单胞菌MSHA菌毛株和3LL肺癌细胞抗原的数量关系大约为:1 X IO7 — 9X IO8个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株:10 μ g肿瘤抗原；较佳地，大约为I X IO7 — 5 X IO8个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株=IOyg肺癌细胞抗原；更佳地，大约为I X IO7 — I X IO8个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株:10 μ g肺癌细胞抗原。
[0031]本发明提供的上述组合物可以用作或用于制备针对相应肿瘤的肿瘤疫苗，其中的铜绿假单胞菌MSHA菌毛株可以发挥佐剂的作用。
[0032]在本发明的一种实施方式中，将含有本发明提供的上述组合物的肿瘤疫苗对个体的施用方式为在第3天，第10天，第17天分别进行皮下注射I次，共注射3次。
[0033]本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0034]本发明的主要优点在于:
[0035]1、首次发现了铜绿假单胞菌MSHA菌毛株作为肿瘤疫苗佐剂的新功效。
[0036]2、寻找到铜绿假单胞菌MSHA菌毛株和肿瘤抗原的合适比例以获得有效的肿瘤疫苗。[0037]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按
重量计。
[0038]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0039]下述实施例中涉及的铜绿假单胞菌MSHA菌毛株(PA-MSHA)购自北京万特尔生物制药有限公司。
[0040]实施例1
[0041]肺癌3LL移植瘤模型
[0042]采用动物皮下移植瘤模型，分别对肿瘤疫苗的两种组分(PA-MSHA和肿瘤抗原)及其组合的剂量进行筛选。实验动物采用6~8周龄的雌性C57BL/6小鼠，移植肿瘤细胞采用小鼠肺癌3LL细胞株。
[0043]具体造模方法为:将1 X IO5个小鼠3LL肺癌细胞，接种于C57BL/6小鼠右侧皮下，肿瘤细胞接种的当天作为实验起始时间(第O天)。给药时间为第3天、第10天和第17天，给药途径为肿瘤接种部位周围的皮下注射。以肿瘤体积作为疗效评价指标，每周测量三次，连续观察20天。治疗结束后，继续观察各组小鼠的生存期。
[0044]实施例2
[0045]肿瘤抗原的制备
[0046]将传代培养3天的小鼠肺癌3LL细胞，在液氮中冷冻10分钟，再置于37°C水浴中，温育10分钟，此过程重复进行三次，以使肿瘤细胞完全裂解。然后，将细胞裂解物离心，提取裂解物上清，用酶标仪测定蛋白含量，即得到肿瘤抗原(Ag)。
[0047]实施例3
[0048]不同剂量肿瘤抗原对肿瘤生长的影响
[0049]本发明涉及的肿瘤疫苗组合中，包括两种成分，PA-MSHA和肿瘤抗原，为了确定二者的合适的组合比例，应先固定其中一种成分。例如将3LL肿瘤抗原(Ag)采用恒定剂量。即采用小鼠皮下移植瘤模型，对3LL肿瘤抗原单用时的合适剂量(1118、1(^8、2(^8)进行了筛选。
[0050]雌性C57BL/6小鼠，6~8周龄，共20只。每只小鼠皮下注射I X IO5个3LL肺癌细胞，并随机分为4组，其中3个实验组和I个对照组，每组5只小鼠。在小鼠接种肿瘤细胞后的第3天，第10天，第17天，分别给予3LL肿瘤抗原(低、中、高剂量组)或PBS (对照组)，皮下注射，每次100 μ 1。
[0051]各组小鼠给药剂量分别如下:
[0052]?对照组(PBS)
[0053].Ag低剂量组(1 μ g3LL肿瘤抗原)
[0054]籲Ag中剂量组(10 μ g3LL肿瘤抗原)
[0055].Ag高剂量组(20 μ g3LL肿瘤抗原)
[0056]小鼠肿瘤生长曲线结果显示，1 μ g、10 μ g和20 μ g肿瘤抗原组与PBS组相比，均无显著性差异，说明单纯注射3LL肿瘤抗原的抑瘤效果不理想。但是，10 μ g和20 μ g抗原组的肿瘤体积均有下降趋势。以IOyg作为瘤苗组合中抗原的参考剂量(图1)。
[0057]实施例4
[0058]不同剂量PA-MSHA对肿瘤生长的影响
[0059]雌性C57BL/6小鼠，6~8周龄，共20只。每只小鼠皮下注射I X IO5个3LL肺癌细胞，并随机分为4组，其中3个实验组和I个对照组，每组5只小鼠。在小鼠接种肿瘤细胞后的第3天，第10天，第17天，分别给予PA-MSHA (高、中、低剂量组)或PBS (对照组)，皮下注射，每次100 μ I。
[0060]各组小鼠给药剂量分别如下:
[0061]?对照组(PBS)
[0062].PA-MSHA 高剂量组(IO9 个 PA-MSHA)
[0063].PA-MSHA 中剂量组(IO8 个 PA-MSHA)
[0064].PA-MSHA 低剂量组(IO7 个 PA-MSHA)
[0065]小鼠肿瘤生长曲线结果 显示，IO9个、IO8个、IO7个PA-MSHA组与对照组相比，均无显著性差异，提示单纯注射PA-MSHA的抑瘤效果也不理想。但是，IO7个和IO8个PA-MSHA组的肿瘤体积有一定的下降趋势，提示浓度过高影响PA-MSHA的活性。因此，考虑舍弃IO9个的高浓度组，并增加一个IO6个的低浓度组。因此，最终确定IO8~IO6个作为瘤苗组合中PA-MSHA的参考剂量范围(图2)。
[0066]实施例5
[0067]不同剂量组合的肿瘤疫苗对肿瘤生长的影响
[0068]雌性C57BL/6小鼠，6~8周龄，共30只。每只小鼠皮下注射I X IO5个3LL肺癌细胞，并随机分为6组，其中3个实验组和I个对照组，每组5只小鼠。在小鼠接种肿瘤细胞后的第3天，第10天，第17天，分别给予PA-MSHA与肿瘤抗原的混合液，皮下注射。
[0069]各组小鼠的给药方法如下:
[0070]?对照组(PBS)
[0071]?八8组(1(^831^肿瘤抗原)
[0072].PA-MSHA 组(IO8 个 PA-MSHA)
[0073].PA-MSHA 高剂量 +3LL 组(IO8 个 PA-MSHA+10 μ g3LL 肿瘤抗原)
[0074].PA-MSHA 中剂量 +3LL 组(IO7 个 PA-MSHA+10 μ g3LL 肿瘤抗原)
[0075].PA-MSHA 低剂量 +3LL 组(IO6 个 PA-MSHA+10 μ g3LL 肿瘤抗原)
[0076]小鼠肿瘤生长曲线结果显示，PA-MSHA高剂量+3LL组和PA-MSHA中剂量+3LL组中，小鼠的肿瘤生长进程明显低于对照组(P < 0.05)，且小鼠生存期也较对照组显著延长(P < 0.05)。而PA-MSHA低剂量+3LL组、Ag组和PA-MSHA组，与对照组相比，两项指标均没有显著差异(图3、图4)。
[0077]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术 内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
【权利要求】
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括肺癌肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株，并且IOyg肺癌肿瘤抗原:1X 107 — 9 X 108个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中是10μ g肺癌肿瘤抗原:IX107 - 5 X 108个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物中是IOyg肺癌肿瘤抗原:IX107-1X 108个铜绿假单胞菌MSHA菌毛株。
5.如权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤抗原来自肿瘤细胞的裂解产物，所述铜绿假单胞菌MSHA菌毛株已完全灭活。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤:将肿瘤抗原和铜绿假单胞菌MSHA菌毛株直接混合。
7.—种如权利要求1-5任一项所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗或预防癌症的肿瘤疫苗。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的癌症选自肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、神经胶质瘤、血液系统肿瘤。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的癌症是肺癌。
10.一种铜绿假单胞菌MSHA菌毛株的用途，其特征在于，用作肿瘤疫苗的佐剂。
【文档编号】A61K39/39GK103690941SQ201310744759
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】杨明非, 储以微 申请人:北京万特尔生物制药有限公司