Src激酶抑制剂在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途的制作方法

技术领域：

本发明属于生物学领域，涉及一种src激酶，具体来说是一种src激酶抑制剂在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。

背景技术：
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急性肾损伤(aki)是一类包括缺血再灌注(i/r)在内的多种原因导致的临床急危重症。大量研究证明aki的病死率高达40-60％，目前仍缺乏行之有效的治疗方式，探索急性肾损伤的发病机制和治靶点至关重要。

此外，aki可发展为慢性肾脏病，最终进展为终末期肾病。aki的分子机制至今尚未完全明确，没有改变aki自然病史的治疗方法。因此，阐明aki发病机制和寻找治疗新方法对于改善aki预后非常必要。

aki的病理生理学与肾小管上皮细胞损伤和坏死相关。虽然肾小管损伤和坏死由多种因素导致，肾实质的完整性受损起着重要作用。细胞间连接的完整性主要由紧密连接蛋白调节，后者由跨膜蛋白组成，zonularoccludins(如zo-1),claudins(如claudins-1和-4)和粘附连接蛋白(如e-cadherin)。i/r损伤可触发紧密和粘附连接蛋白的分布改变和降解，导致屏障功能丧失，进而导致回漏和肾功能受损。因此，紧密和粘附连接蛋白的破坏可能是aki治疗的早期潜在治疗靶点。

缺血性aki中的紧密和粘附连接蛋白的改变和破坏有多条信号调节通路，包括src，后者被证明主要聚集在细胞-细胞接触点和局部粘附中。

src通过酪氨酸416位点磷酸化而被激活，激活后的src可引起一些紧密和粘附蛋白，如e-candherin和某些claudin的酪氨酸磷酸化。src还被证明可以抑制紧密连接蛋白聚集。此外，src能激活其他细胞信号传导途径，如erk1/2,stat3和nf-kb。体外和体内试验均证实erk1/2活化对于肾小管上皮细胞凋亡不可或缺。stat3和nf-kb的活化与很多炎性细胞因子和趋化因子的表达相关。而且，src活化参与了基质金属蛋白2和9的表达和激活，后者在缺血性aki中表达上调，且与微血管渗透性增加和aki预后相关。

大量证据表明src激酶活化参与多个器官急性损伤，包括脑缺血损伤、心肌梗塞、肝细胞损伤、急性肾损伤。。paul等证明src基因缺陷小鼠对缺血性损伤有抵抗作用，使用src抑制剂pp1和pp2可减少野生型小鼠的脑缺血损伤。wies等也证实阻断src基因表达或药理学作用可减轻心肌梗塞后水肿和组织损伤。此外，早期使用src抑制剂可减轻肝细胞损伤和提高氧化偶氮甲烷诱导的急性肝细胞衰竭模型小鼠的存活率。最后，src酪氨酸激酶抑制剂可阻断i/r导致的急性肺损伤。这些证据都强烈的提示src参与了多个器官的急性损伤发病机制。虽然有报道表明src的药理学抑制可抑制顺铂导致的肾小管上皮细胞坏死，且src与pkcδ相互作用，后者是顺铂肾毒性的媒介，src是否参与了aki的发展还不清楚。

技术实现要素：
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针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种src激酶抑制剂在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途，所述的这种src激酶抑制剂在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途要解决现有技术中的药物治疗急性肾损伤的效果不佳的技术问题。

本发明提供了src激酶抑制剂在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。

进一步的，所述的急性肾损伤是由肾缺血引起的。

进一步的，所述的src激酶抑制剂为pp1

(4-amino-5-(methylphenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo-(3,4-d)pyrimidine)。

此外，本发明证实在缺血2小时后给予pp1可起到改善肾功能，减轻肾损伤的作用，提示src抑制剂对于一些未能及时到医院就诊的aki患者具有潜在的肾保护作用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明证明使用pp1抑制src可减轻i/r后的肾脏病理学改变，改善肾功能。本发明的治疗机制包括抑制肾小管细胞凋亡，保护多种连接/粘附蛋白，抑制细胞死亡和炎症信号通路。因此，src激酶可成为治疗aki的重要靶点。

附图说明：

图1a、b显示了src激酶在i/r组48小时后明显增高。

图1a、b、c显示了灌注2小时后给予pp1可减轻src磷酸化表达。

图1d显示了p-src416主要表达在损伤肾脏的近端肾小管。

图2a和b表明i/r组血清肌酐和尿素氮(bun)水平较假手术组明显上升，pp1给药后显著降低了血清肌酐和bun水平。

图2c和d表明i/r组肾小管扩张，肿胀，坏死和管腔堵塞。

图3表明i/r组ngal表达在肾小管，但在假手术组无表达(图3a,3b)。pp1组ngal表达明显减弱。与westernblot结果一致(图3c,d)。

图4a表明无论是否使用pp1，假手术组均未检测到tunel阳性细胞，i/r组tunel阳性细胞显著增多，pp1明显降低了i/r组tunel阳性细胞数(图4a,b)。

图4c-e表明i/r组cleavedcaspase3和parp表达增高，而pp1抑制了cleavedcaspase3和parp的表达。

图5a-c表明i/r组e-cadherin和zo-1表达下降，pp1可阻断这一效果。

图5d表明免疫组化染色也显示i/r组肾脏中e-cadherin和zo-1表达下降，而pp1在这种病理状态下维持他们的表达水平。

图6显示了pp1对i/r诱导的肾损伤中claudin1和4表达的影响。westernblot结果表明i/r组claudin1和4表达下降(图6a-c)。免疫组化染色也得到了相似的结果(图6d)。

图7检测了pp1对培养的肾小管细胞氧化应激损伤后的影响。将肾小管上皮细胞用过氧化氢(1mm)处理后e-cadherin表达明显下降(图7a,b)，zo-1表达明显下降(图7a,c)，claudin1(图7a,d)和4表达明显下降(图7a,e)，且pp1处理后显著恢复了e-cadherin和zo-1表达，部分恢复了claudin1和4表达。pp1预处理显著阻断了h2o2诱导的p-src(tyr416)表达(图7f)。

图8显示了pp1在调节i/r诱导的肾损伤中mmp-2和9表达的影响。mmp-2和9表达在i/r诱导的肾损伤中明显增高，pp1可抑制两者表达(图8a、b、c)。

图9显示了pp1对erk1/2活化的影响。如图9a-c所示，i/r组总erk1/2和磷酸化erk1/2表达均增高，pp1可抑制erk1/2磷酸化。

图10显示了src对i/r肾损伤中stat3和nf-kb活化的影响。图10a-d显示i/r损伤诱导了stat3和nf-kb磷酸化，可被pp1抑制。

图11显示了pp1对i/r诱导的肾损伤中巨噬细胞浸润的影响。如图11a、b所示i/r组cd68和mcp-1的表达增高，pp1几乎完全抑制了cd68表达增加，部分抑制了mcp-1表达。免疫荧光染色显示i/r组cd68阳性细胞数增加，pp1显著减少了cd68阳性细胞数(图11d、e)。

具体实施方式：

实施例1：

1.1材料和方法

(1)试剂和抗体

p-stat3,stat3，p-src，src，p-nf-kbp65，nf-kbp65，cleaved-caspase3，cleaved-parp抗体均购于cellsignalingtechnology公司。e-cadherin，cd68，mcp-1，claudin1，claudin4，mmp-2,mmp-9和gapdh抗体购于santacruz公司。tunel试剂盒购于rochelifescience。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(ngal)抗体购于r&dsystems公司。α-tubulin抗体和其他试剂购于sigma公司。

(2)肾功能检测

血清肌酐(scr)和血尿素氮(bun)浓度检测试剂盒分别购于biovision和sigma，根据说明书操作。

(3)肾缺血再灌注肾损伤模型和治疗分组

根据文献报道方法建立小鼠i/r模型。小鼠用ketamine(75mg/kg)和dexdomitor(50mg/kg)麻醉,然后无菌切开左右侧腹部暴露肾脏，分离两侧肾动脉和静脉，37℃下用非创伤性血管夹夹闭血管30分钟。在假手术组，只分离血管，不夹闭。所有的小鼠分为4组，再灌注2小时后给予等量的dmso或pp1(2mg/kg，腹腔注射)。48小时后处死小鼠，收集血液和肾脏标本。所有动物实验均遵守美国实验动物管理和使用条例。

(4)tunel染色

tunel染色检测细胞凋亡根据试剂盒说明书操作。每个肾脏随机挑选5张切片，每张切片挑选5个视野计数tunel阳性细胞数。

(5)组织学和免疫荧光染色

肾组织经过4％多聚甲醛固定，石蜡包埋。组织切片(3μm)进行pas染色。免疫荧光染色操作方法如前所述。ngal一抗浓度1：200，cd681：150，e-cadherin1：100，zo-11：200，claudin11：200，claudin41：200，荧光连接二抗浓度1：500。dapi染色根据操作说明进行。

(6)细胞培养及处理

小鼠近端肾小管细胞(tkpt)用含5％胎牛血清，0.5％青霉素和链霉素的dmem-f12培养液培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究pp1的影响，pp1直接加入未完全融合的tkpt细胞再继续培养24小时。

(7)westernblot

肾组织提取蛋白，按照文献方法操作。westernblot结果用imagej软件进行灰度分析。

(8)统计分析

使用均值±sem表示数据。多组间比较用单因素方差分析(anova)，两组间数据比较用t检验。以p<0.05为具有统计学意义。

2.结果

(1)pp1抑制了i/r诱导肾损伤中的src活化

本发明研究了pp1第src酪氨酸416位点磷酸化的影响，在假手术组未检测到srctyr416磷酸化的表达，但在i/r组48小时后明显增高(图1a,1b)。再灌注2小时后给予pp1可减轻src磷酸化表达(图1a,1b)。但是，pp1未能改变src表达，尽管src在i/r损伤后较基线水平升高。免疫组化染色显示p-src416主要表达在损伤肾脏的近端肾小管(图1d)。因为酪氨酸416位点磷酸化正性调节src激酶活化本发明的结果表明肾损伤导致肾小管细胞中src活化，pp1是一个潜在的src抑制剂。

(2)pp1改善了i/r肾损伤模型小鼠的肾功能

为探讨pp1对i/r诱导的aki肾损伤的肾功能和病理学改变，本发明收集了pp1给药48小时后的血标本和肾组织。图2a和b表明i/r组血清肌酐和尿素氮(bun)水平较假手术组明显上升，pp1给药后显著降低了血清肌酐和bun水平。图2c和d表明i/r组肾小管扩张，肿胀，坏死和管腔堵塞。pp1显著减轻了肾小管损伤程度。这些结果表明药理学抑制src可保护i/r诱导的aki肾损伤。

(3)pp1阻断了肾小管损伤和凋亡

ngal是公认的急性小管损伤的生物标志物。为探讨src在肾小管细胞损伤中的作用，本发明用免疫组化染色方法检测了pp1对i/r诱导的肾损伤中ngal表达的影响。图3表明i/r组ngal表达在肾小管，但在假手术组无表达(图3a,3b)。pp1组ngal表达明显减弱。与westernblot结果一致(图3c,d)。本发明还用tunel染色检测了pp1对肾小管细胞凋亡的影响。图4a表明无论是否使用pp1，假手术组均未检测到tunel阳性细胞，i/r组tunel阳性细胞显著增多，pp1明显降低了i/r组tunel阳性细胞数(图4a,b)。本发明还用westernblot检测了两个凋亡标志物cleavedcaspase3和cleavedparp的表达，图4c-e表明i/r组cleavedcaspase3和parp表达增高，而pp1抑制了cleavedcaspase3和parp的表达。这些结果进一步证明了src活化可引起肾小管损伤和凋亡，而pp1可阻断这一作用。

(4)pp1阻断了i/r诱导的小鼠肾组织中紧密和粘附连接蛋白的下调

最近的研究表明细胞粘附和紧密连接蛋白，如e-cadherin和zo-1在保持上皮细胞极性和屏障完整性，正常小管液体和溶质的吸收和排泄中起重要作用。aki引起小管粘附和紧密连接破坏。为阐明src在调节细胞粘附和紧密连接蛋白表达中的作用，本发明检测了e-cadherin和zo-1表达，图5a-c表明i/r组e-cadherin和zo-1表达下降，pp1可阻断这一效果。同时免疫组化染色也显示i/r组肾脏中e-cadherin和zo-1表达下降，而pp1在这种病理状态下维持他们的表达水平(图5d)。用pp1阻断src可维持i/r肾损伤中紧密和粘附连接蛋白的表达。

(5)pp1保持和增加了i/r诱导的肾损伤中claudin1和4表达

除zo-1以外，其他包括claudin1和4在内其他蛋白对紧密连接聚集有作用。本发明检测了pp1对i/r诱导的肾损伤中claudin1和4表达的影响。westernblot结果表明i/r组claudin1和4表达下降(图6a-c)。有趣的是，pp1不仅保持，而且增加了两者的表达。免疫组化染色也得到了相似的结果(图6d)。因此，src激酶对于调节肾脏中claudin1和4表达也起到了重要作用。

(6)使用pp1抑制src可保护培养的肾小管上皮细胞中粘附和紧密连接蛋白下调

为阐明src对肾小管细胞中粘附和紧密连接蛋白的特殊调节作用，本发明检测了pp1对培养的肾小管细胞氧化应激损伤后的影响。将肾小管上皮细胞用过氧化氢(1mm)处理后e-cadherin表达明显下降(图7a,b)，zo-1表达明显下降(图7a,c)，claudin1(图7a,d)和4表达明显下降(图7a,e)，且pp1处理后显著恢复了e-cadherin和zo-1表达，部分恢复了claudin1和4表达。pp1预处理显著阻断了h2o2诱导的p-src(tyr416)表达(图7f)。因此，本发明的结果表明src在调节肾小管细胞中粘附和紧密连接蛋白表达中的作用。

(7)pp1抑制i/r诱导的肾损伤中mmp-2和9表达

mmp-2和9表达增高对上皮屏障作用有损害作用。为研究src在调节i/r诱导的肾损伤中mmp-2和9表达的影响，本发明研究了pp1对这两者表达的影响。mmp-2和9表达在i/r诱导的肾损伤中明显增高，pp1可抑制两者表达(图8a、b、c)。因此，本发明的结果表明src也可以调节i/r诱导的肾损伤中mmp-2和9表达上调。

(8)pp1抑制i/r诱导肾损伤中的erk1/2活化

已有研究证实erk1/2可调节顺铂诱导的肾小管细胞凋亡。因此，本发明研究了pp1对erk1/2活化的影响。如图9a-c所示，i/r组总erk1/2和磷酸化erk1/2表达均增高，pp1可抑制erk1/2磷酸化。因此，src对于i/r诱导的肾损伤中的erk1/2活化非常重要。(9)pp1抑制i/r诱导的肾损伤中stat3和nf-kb磷酸化

业已证明缺血性aki中炎症反应起重要作用。stat3和nf-kb是调节多种细胞因子和趋化因子的转录因子，本发明研究了src对i/r肾损伤中stat3和nf-kb活化的影响。图10a-d显示i/r损伤诱导了stat3和nf-kb磷酸化，可被pp1抑制。虽然总stat3和nf-kb表达在i/r肾损伤中也增高，但pp1不能影响他们的表达。因此，src参与了stat3和nf-kb信号通路活化。

(10)pp1抑制i/r诱导的肾损伤中单核细胞趋化蛋白1表达，减轻了巨噬细胞浸润

已有研究证实src参与了巨噬细胞介导的炎症反应。为阐明pp1对i/r诱导的肾损伤中巨噬细胞浸润的影响，本发明研究了cd68和mcp-1的表达。如图11a、b所示i/r组cd68和mcp-1的表达增高，pp1几乎完全抑制了cd68表达增加，部分抑制了mcp-1表达。免疫荧光染色显示i/r组cd68阳性细胞数增加，pp1显著减少了cd68阳性细胞数(图11d、e)。如论是否给予pp1在假手术组几乎检测不到巨噬细胞浸润(d、e)。这些结果说明src在i/r诱导的肾损伤中对调节mcp-1表达和巨噬细胞浸润起作用。