靶向egfr的载铂类药物白蛋白纳米粒及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种特异靶向人表皮生长因子受体（EGFR)的载铂类药物白蛋白纳米 粒、制备方法及其用途。 (二）
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位最常见的恶性肿瘤，在中国 女性中发病率居第一位。全世界每年有20多万妇女死于宫颈癌。据29个省、市、自治区的 调查表明，我国宫颈癌死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌症的第二位。发病年龄以 40岁到50岁为最多。卵巢癌是妇科肿瘤中恶性程度最高的疾病，居妇科恶性肿瘤死亡率 首位，严重威胁着女性的生殖健康。卵巢癌发病隐匿，极易发生侵袭和远处转移，约70%? 80%的卵巢癌患者诊断时即属于III/IV期，其五年生存率仅为30%左右。宫颈癌和卵巢癌 的治疗以彻底的肿瘤减灭术为主，但由于其转移方式多表现为腹腔内散在的广泛种植，故 依靠手术彻底切除肿瘤尚不可能，残存的散在肿瘤结节，必须依靠手术后的化疗。最常用的 是以铂类为主的一线联合化疗方案，但因化疗药物缺乏选择性且具有毒性反应，它在杀死 肿瘤细胞的同时往往也杀死了正常的细胞，导致患者出现骨髓抑制、肾功能不全、消化道反 应、心脏传导障碍等情况，生活质量严重下降，一些患者甚至因化疗引起的感染及出血等并 发症而死亡，致使药物利用度有限，使用剂量受限。此外，还有一些年老体弱或有心、肝、肾 功能不全的患者无法耐受化疗的毒性反应而不能进行化疗，导致卵巢癌迅速进展而死亡。 因此，需要一种有效的靶向给药系统使药物到达肿瘤区。这种系统不仅可以提高药物在肿 瘤区的浓度，更有效地杀伤肿瘤细胞，，而且可以减小对正常细胞、组织的损害。纳米粒作为 靶向性制剂载体已成为国内外研宄的热点，通过载药纳米粒载体将治疗药物靶向地导向病 灶部位，可以达到靶向给药的目的，而又对非靶组织、器官、细胞的影响很少。近年来的研宄 发现，将纳米粒与具有特异肿瘤靶向的活性分子或特殊基团相连，可使之具备肿瘤特异靶 向功能，从而在很大程度上提高了肿瘤细胞内的药物浓度。
[0003] 核酸适配体（Aptamer)是一段DNA (脱氧核糖核酸）或者RNA (核糖核酸）序列，是 利用体外筛选技术--指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。具有高特 异性与亲和性"靶向配基"的筛选，是制约主动靶向给药系统研宄的瓶颈。以往修饰肿瘤药 物的"靶向配基"是抗体、多肽和叶酸等分子，但这些配基修饰的靶向药物在实际应用中均 存在着难以克服的缺陷。单克隆抗体潜在的免疫原性和制备的困难大大限制了其临床的应 用和产业化的进程；叶酸等小分子虽然有诸多优点，但要求病变组织细胞过多表达叶酸受 体，靶向作用才得以实现，而核酸适体却具有以下优点：高亲和力、强特异性，靶标普适性， 成本低廉、筛选制备计数成熟、无免疫原性、受体范围广泛。
[0004] 首个核酸适配体药物"Macugen"由美国FDA在2005年批准上市，成为核酸适配体 领域的一个里程碑。美国Achemix、SomaLogic，德国Noxxon AG等多个公司正在开发核酸适 配体药物和诊断试剂。肿瘤细胞靶向给药是提高肿瘤治疗效果减少毒副作用的有效途径。 将药物偶联于肿瘤细胞特异性配体上是靶向给药的主要方法。核酸能特异性结合细胞并且 随之内化，是理想的靶向细胞输送剂。核酸适体"靶向配基"介导或修饰的药物及药物纳米 制剂，为主动靶向肿瘤细胞给药系统构建开拓了新方向。
[0005] 白蛋白是一类在血浆中大量存在的蛋白。药物载体研宄中常见的白蛋白包括人血 清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白，分别可以从人血清、牛血清、蛋清中获取。人血清白 蛋白是人体内最丰富的血浆蛋白，人血清白蛋白在体内具有多种作用，如：1)增加长链脂 肪酸的溶解度；2)结合胆红素；3)与多种药物结合，如青霉素类、磺胺类、吲哚类、苯二氮卓 类等药物。白蛋白分子中存在多种药物结合位点，对不同种类的药物均能有效负载；同时 其具有水溶性高、稳定性好、可降解等特点，其生物相容性高，已被美国食品药品监督管理 局（FDA)批准用于人体，因此白蛋白是药物输送的理想载体。基于白蛋白的纳米粒子用于 药物输送，可提高疏水性药物的溶解度，并改善药物的代谢动力学。通过控制纳米粒子的粒 径，可提高被动靶向作用，提高药物在肿瘤处的摄取。同时，白蛋白上存在的氨基、巯基等， 可以进一步修饰主动革巴向基团以提高革巴向性。紫杉醇 -白蛋白纳米粒（nab-paclitaxel， Abraxaiie? )是第一个应用白蛋白纳米粒技术的上市药物，FDA于2005年1月批准其用 于乳腺癌的治疗，SFDA于2008年批准其在中国上市。该制剂利用了肿瘤细胞摄取营养物 质的途径，将白蛋白传送的营养物质替换为抗肿瘤药紫杉醇，不仅避免了表面活性剂（如 聚氧乙烯蓖麻油）的使用，减少了由此带来的过敏反应，同时使药物富集于肿瘤病灶部位。
[0006] 已知肿瘤的发生、发展是由细胞信号网络调控的多基因参与的极其复杂的过程， 表皮生长因子受体（EGFR)信号通路在正常组织中多呈关闭状态，而在肿瘤组织中被激活 开放，而且其活跃程度与肿瘤病情进展呈正相关。本发明人和国内外的许多研宄均提示人 宫颈癌、卵巢癌组织和细胞株中均高表达EGFR。本发明人利用EGFR的核酸适配体修饰载药 的白蛋白纳米粒，靶向结合细胞表面EGFR高表达的宫颈癌和卵巢癌细胞，提高细胞内药物 摄取量，从而使药物特异性作用于宫颈癌和卵巢癌细胞，发挥药效，实现靶向治疗。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有临床中的问题，提供一种EGFR核酸适配体修饰的载铂 类药物白蛋白纳米粒，具有特异性靶向和主动靶向性、EGFR高表达的宫颈癌、卵巢癌肿瘤细 胞的载铂类药物白蛋白纳米粒，使包裹的铂类药物在血液中能长效循环、对癌组织具有双 重靶向性、释药速率可调，以期最大限度的提高疗效、降低其毒副作用。本发明的目的还提 供一种上述EGFR核酸适配体修饰的载铂类药物白蛋白纳米粒的制备方法及其应用。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 一种特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒，由白蛋白 与铂类药物制成白蛋白载铂纳米粒后，再通过PEG在其表面化学交联EGFR核酸适配体 (EGFR apt)制得，粒径为20?500nm，多分散指数在0. 1?1之间；所述白蛋白载钼纳米粒、 EGFR核酸适配体、PEG摩尔用量之比为0. 01?0,1 :0. 1?10 :0. 1?10,上述为制备载铂 类药物白蛋白纳米粒的主要原料，并未包括制备过程中所用的辅料和溶剂等；
[0010] 所述铂类药物为下列之一：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、络铂；
[0011] 所述EGFR核酸适配体长度为30?IOOnt，且包含如下部分连续碱基（>10nt)或 者全部碱基序列：5 ' -NH2-C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCG UU-3'。
[0012] 优选的，所述PEG为氨基化水溶性PEG分子，分子量在200?5000之间。
[0013] 所述载铂类药物白蛋白纳米粒中还可添加药学上可接受的辅料，所述辅料为下列 之一或其中两种以上的混合物：维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚 硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。
[0014] -种制备所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒的 方法，所述方法包括：
[0015] (1)将浓度10?30% (w/w)的人血清白蛋白与0· 5?10mg/ml的铂类药物溶液 按照其中人血清白蛋白与铂类药物比例为Img :2?SOmg比例充分混合，室温搅拌0. 5?1 小时，搅拌过程中加入等体积无水乙醇，再加入终浓度〇. 1% (w/w)的戊二醛，搅拌12?24 小时后，4°C下12000rpm离心30min，弃上清，离心后产物重新分散于分散介质中，制得白蛋 白载铂纳米粒溶液；所述分散介质为下列之一：水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓 冲液、5% (w/w)葡萄糖溶液或生理盐水；
[0016] (2)取步骤⑴制得白蛋白载铂纳米粒溶液，加入碳二亚胺盐酸盐（EDC)和N-羟 基琥?白酰亚胺（NHS)，磁力搅拌下充分活化反应10?30min，再加入0. 1?10mg/ml的氨基 化EGFR适配体分子和0. 1?10mg/ml的氨基化PEG分子，室温反应2小时后，取反应液，加 入到超滤管中，4000?IOOOOrpm下离心5?15min，除去碳二亚胺盐酸盐和N-轻基琥?白 酰亚胺和未包裹游离的铂类药物，制得所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类 药物白蛋白纳米粒；所述白蛋白载铂纳米粒（以铂类药物含量摩尔量计算）、EGFR核酸适 配体、PEG、碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺摩尔用量之比为0. 01?0,1 :0. 1?10 : 0. 1 ?10 :0. 5 ?1 :0. 5 ?10。
[0017] 优选的，所述铂类药物为顺铂，步骤（1)中分散介质为生理盐水。
[0018] 所述分散介质中还可添加药学上可接受的辅料，所述辅料为下列之一或其中两种 以上的混合物：维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、偏亚 硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。
[0019] 所述载铂类药物白蛋白纳米粒是氨基化EGFR apt与白蛋白纳米粒表面的羧基进 行连接，在纳米粒中包裹铂类药物。白蛋白载体具有良好的生物相容性及降解性，安全无 毒。本发明提供的EGFR apt修饰的载钼类药物白蛋白纳米粒，粒径在20?500nm;优选 20?200nm之间；所述的纳米粒粒径为多数分散指数PDI在0. 25?1之间；再加上EGFR 靶向和PEG化，可以有效减少网状内皮系统（RES)吞噬，延长循环时间，提高药物制剂的靶 向性。所述的PEG化表示在白蛋白分子上化学交联氨基化PEG分子。
[0020] 本发明还涉及所述的载铂类药物白蛋白纳米粒在制备治疗EGFR蛋白高表达的肿 瘤的药物中的应用。
[0021] 具体的，所述载铂类药物白蛋白纳米粒可用于制备治疗宫颈癌或卵巢癌的药物。
[0022] 优选的，所述铂类药物的给药剂量（以铂类药物含量计）为0. 01?20mg/kg/每 次，给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为0. 3?600mg/kg。
[0023] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的靶向EGFR载铂类药物白蛋白纳米 粒制备工艺简单，稳定性好，能够特异识别EGFR高表达肿瘤细胞，抑制肿瘤增值，促进肿瘤 细胞凋亡，在抗肿瘤尤其是宫颈癌和卵巢癌临床治疗中具有重要应用前景。 (四）
【附图说明】
[0024] 图1为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂理化性质表征图；
[0025] 图2为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂药物释放曲线；