[0026] 图3为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂特异识别HELA细胞共聚焦显微镜图；
[0027] 图4为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体外抗卵巢癌效果；
[0028] 图5为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂诱导肿瘤细胞凋亡和坏死效果；
[0029] 图6为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体内抗肿瘤活性；
[0030] 图7为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体内给药对各内脏器官细胞毒性结 果；
[0031] 图8为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体内给药后铂类药物组织分布图。 (五）
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0033] 实施例1 :靶向EGFR载顺铂药物白蛋白纳米制剂制备
[0034] 25 % (w/w)人血清白蛋白水溶液2mL与0. 5mg/ml顺钼水溶液4mL充分混合，加入 6mL无水乙醇，室温搅拌2h，2h后加入终浓度0. 01 % (w/w)的戊二醛，室温搅拌过夜。4°C 下12000rpm离心30min，弃上清，重新分散于IOmL生理盐水中，制备得到载顺钼白蛋白纳米 粒子溶液。
[0035] 取载顺铂白蛋白纳米粒子溶液2mL，加入各100 μ M的EDC和NHS，磁力搅拌下充分 活化反应20min，再加入lmg/ml的EGFR核酸适配体（序列为：5' -NH2-
[0036] C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGUU-3'）溶液 ImL 和5mg/ml的氨基化PEG分子（分子量4000Da) lmL，反应2小时后，取反应液，加入到超滤 管中，8000rpm下离心IOmin，除去EDC/NHS以及未包裹游离的顺钼，制备得到靶向EGFR 载顺铂药物白蛋白纳米粒，其形态规整呈圆形，分散性好，平均粒径为20nm，zeta电位为 +12. lmv，包封率为90. 5%，见图1〇
[0037] 实施例2 :载顺铂高分子纳米粒的体外缓释性实验
[0038] 取一定量的载顺铂纳米粒装入预先处理好的透析袋（MWC0,3500)中，置于装有 18mlPBS(pH = 7. 4)的锥形瓶中，37°C，120rpm/min恒温振荡透析，在预定的间隔时间点取 出透析液2ml，同时补充2ml 37°C的PBS溶液，电感耦合等离子体发射光谱仪测定透析液中 铂的含量。计算不同时间的药物累积释放量，并绘制药物体外释放曲线。结果如图2所示， 由图可见，载顺铂纳米粒能够在体外中性环境下，达到负载铂类药物缓慢释放的效果。
[0039] 实施例3 :宫颈癌HELA细胞对顺铂白蛋白纳米粒的体外摄取实验
[0040] 10% FCS DMEM培养基常规培养人宫颈癌HELA细胞，内含1% (v/v)青霉素-链霉 素（100U/ml青霉素G和lOOyg/ml链霉素），于37°C培养箱内（5%C02)孵育，取对数生长 期细胞进行实验。将HELA细胞接种在24孔板中，每孔细胞的密度为3X 104/ml，37°C，5% CO2的细胞培养箱中培养过夜。避光操作下，分别在不同孔中加入含荧光标记EGFR适配体 的靶向性纳米粒，37°C细胞培养箱中继续培养lh。吸出培养液，37°C PBS洗涤3次。于共聚 焦荧光显微镜下观察细胞对纳米粒的摄入情况，结果见图3。
[0041] 从图3中可以观察到细胞对靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒的特异性摄取作用明显 高于单独EGFR适配体分子组。
[0042] 实施例4 :革巴向EGFR顺铂白蛋白纳米粒体外抑制卵巢癌细胞增殖的效果
[0043] 取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞，制成5X IO4个/ml悬液，以0,1ml/孔铺96 孔板，37°C，5% CO2的细胞培养箱中培养过夜。吸出培养液，将所制备的靶向或非靶向载顺 铂纳米粒用培养液调整到不同浓度，分别加入到96孔板中（另设空白对照和阴性对照）， 每个浓度设5个复孔。为评估二甲亚砜（DMSO)对实验的影响，另设3个DMSO组（浓度为 0· 45%、0· 2%、1%分别与2. 25、1、0· 5mg/ml的材料浓度中DMSO含量一致）。培养24h、48h 后，加MTT 10 μ 1/孔继续培养2h，在酶标仪上于490nm波长处测定OD值。
[0044] 计算细胞存活率：细胞的存活率（％)=实验组OD值/阴性组OD值X 100%。靶 向EGFR或非靶向EGFR载顺铂白蛋白纳米粒对于SK0V3细胞均具有明显的杀伤作用，且随 着浓度的提高及时间延长抑制作用逐渐增强，其中靶向性载顺铂纳米粒对SK0V3的增殖抑 制作用最强，见图4。通过细胞凋亡试剂盒使用流式细胞检测仪检测用药后细胞凋亡和坏死 指数，如图5所示，可见靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒具有显著的诱导细胞凋亡和坏死效果。
[0045] 实施例5 :革巴向EGFR顺铂白蛋白纳米粒体外抑制宫颈癌细胞增殖的效果
[0046] 4-6周龄雌性裸鼠 25只，随机分为5组体，分别为生理盐水对照组，EGFR适配体对 照组（80 μ g/剂量），顺铂对照组（80 μ g/剂量），顺铂白蛋白纳米制剂组（80 μ g顺铂/剂 量），靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒制剂组（80 μ g/剂量），每只裸鼠右前肢肋下接种I X IO6 宫颈癌HELA细胞，待皮下肿瘤长至200mm3时，尾静脉开始分组给药。每周给药2次，每周 测量一次肿瘤尺寸大小，给药28天后，解剖，分离肿瘤组织和各内脏器官，测定肿瘤肿瘤、 肿瘤组织及内脏器官病理切片。体内抗肿瘤效果如图6,肿瘤组织和内脏器官病理切片如图 ?。
[0047] 结果表明靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒具有最优异的体内抗肿瘤效果，并且具有 很好的生物安全性，对内脏器官没有显示明显的细胞毒性。
[0048] 铂类药物组织分布测定：取其心、肝、脾、肾、（以上均为整个器官）分散在1至3mL PBS或者生理盐水漂洗一下，可以直接用剪子将器官剪碎再装入15mL离心管中。加入浓硝 酸6ml左右，盖子拧紧，静置过夜。第二天，将脏器放入水浴锅中，80°C煮煮沸，4000转/min 离心lOmin，立即将上清取出，送样测电感耦合等离子体质谱（ICP)。铂类药物在动物各器 官组织中生物分布图如图8。
[0049] 结果表明，靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒给药组顺铂药物在肿瘤组织中蓄积量最 高，而在心、肝、脾、肾各组织中残留量则最低，显示了其优异的体内靶向抗肿瘤活性。
【主权项】
1. 一种特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒，由白蛋白与 铂类药物制成白蛋白载铂纳米粒后，再通过PEG在其表面化学交联EGFR核酸适配体制得， 粒径为20?500nm，多分散指数在0. 1?1之间；所述白蛋白载铂纳米粒、EGFR核酸适配 体、PEG摩尔用量之比为0. 01?0,1 :0. 01?10 :0. 01?10 ; 所述铂类药物为下列之一：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、络铂等铂类化合物。 所述EGFR核酸适配体序列包含如下序列： 5 ' -NH2-C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGUU-3 '。
2. 如权利要求1所述的载铂类药物白蛋白纳米粒，其特征在于所述PEG为氨基化水溶 性PEG分子，分子量在200?5000之间。
3. 制备权利要求1所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米 粒的方法，所述方法包括： (1) 将浓度10?30%的人血清白蛋白与0. 5?10mg/ml的铂类药物溶液按照其中人 血清白蛋白与钼类药物比例为Img :2?80mg比例充分混合，室温搅拌0. 5?2小时，搅拌 过程中加入等体积无水乙醇，再加入终浓度0. 01 %的戊二醛，搅拌12?24小时后，4°C下 12000rpm离心30min，弃上清，离心后产物重新分散于分散介质中，制得白蛋白载钼纳米粒 溶液；所述分散介质为下列之一：水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5%葡萄 糖溶液或生理盐水； (2) 取步骤（1)制得白蛋白载铂纳米粒溶液，加入碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚 胺，磁力搅拌下充分活化反应10?30min，再加入0. 1?10mg/ml的氨基化EGFR适配体分 子和0. 1?10mg/ml的氨基化PEG分子，室温反应2小时后，取反应液，加入到超滤管中， 4000?IOOOOrpm下离心5?15min，除去碳二亚胺盐酸盐和N-轻基瑭?自酰亚胺和未包裹游 离的铂类药物，制得所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒； 所述白蛋白载铂纳米粒、EGFR核酸适配体、PEG、碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺摩尔 用量之比为 〇· 01 ?〇· 1 :〇· 1 ?10 :〇· 1 ?10 :〇· 5 ?1 :0· 5 ?10。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述分散介质中还添加有药学上可接受的辅 料，所述辅料为下列之一或其中两种以上的混合物：维生素 E、维生素 C、反丁烯二酸、苹果 酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述铂类药物为顺铂，步骤（1)中分散介质为 生理盐水。
6. 权利要求1所述的载铂类药物白蛋白纳米粒在制备治疗EGFR蛋白高表达的肿瘤的 药物中的应用。
7. 权利要求6所述的应用，其特征在于所述载铂类药物白蛋白纳米粒用于制备治疗宫 颈癌或卵巢癌的药物。
8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述铂类药物的给药剂量为0. 01?20mg/ kg/每次，给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为0. 3?600mg/kg。
【专利摘要】本发明属于药物制剂领域，涉及一种靶向识别肿瘤细胞EGFR受体的铂类药物白蛋白纳米制剂。本发明以白蛋白负载铂类药物、以药用聚乙二醇(PEG)为分散交联剂、以氨基化EGFR核酸适配体作为靶向修饰分子，制成可溶性白蛋白纳米(Apt-PtNPs)制剂。该纳米粒可与肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合并发生细胞内吞，从而降低铂类药物的毒副作用，达到减毒增效的目的，并能够通过促使EGFR蛋白磷酸化抑制EGFR表达，进而发挥协同铂类药物抗肿瘤效果。可用于抗肿瘤药物的制备，尤其在宫颈癌和卵巢癌的治疗研究中证明，该纳米粒靶向性好，杀伤作用强，在肿瘤基因治疗与化疗药物联合治疗中具有很好的应用前景。
【IPC分类】A61K47-42, A61K9-00, A61K47-18, A61K47-34, A61P35-00, A61K33-24
【公开号】CN104606127
【申请号】CN201510029918
【发明人】亓立峰
【申请人】浙江峰盛生物工程有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月21日