专利名称：一种调控蛋白SnpR及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物及利用其进行抗生素生物转化生产的领域，特别涉及一种新型的调节蛋白SnpR及其基因，并通过SnpR调节启动子SnpA的转录水平，从而提高了柔红霉素C-14羟化酶的表达，从而实现在培养液中直接将柔红霉素转化成阿霉素。
背景技术：
柔红霉素和阿霉素是临床上重要的蒽环类抗生素，主要用于多种实体瘤和急性白血病的治疗，在临床上作为一线抗肿瘤药物使用。阿霉素是柔红霉素C-14位羟化的衍生产物，具有比柔红霉素更广的抗肿瘤谱和更小的毒副作用。目前工业上采用化学半合成法从柔红霉素转化生产阿霉素，从由微生物产生的柔红霉素出发经过七步反应获得阿霉素。总收率从柔红霉素算起最高为40％，而在生产中一般为33％左右。不仅工艺复杂、转化率低，而且污染环境严重。
国外主要研究了波赛链霉菌(S.peucetics)和链霉菌(S.sp.)C5这两个菌株中的柔红霉素和阿霉素代谢生物合成途径，经过近二十余年的努力取得了许多研究成果。一般认为柔红霉素C-14羟化酶基因doxA的表达产物是催化柔红霉素转化成阿霉素的关键酶，国外通过克隆实验从波赛链霉菌29050和波赛链霉菌27952及链霉菌S.sp.strain C5中获得了doxA。
目前在链霉菌中经过详细分析并用于基因doxA表达的启动子有金属蛋白酶基因SnpA启动子，并发现该启动子受其调控蛋白SnpR调控(激活)，但未有将其应用在生物转化阿霉素生产中的报道(J.Bacteriol.1996，178(11)3389，其中SnpR序列见Genbank，登录号为AY072041)。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一即为提供一种新的调控蛋白SnpR及其基因，该SnpR蛋白可调节启动子SnpA的转录水平，并提高了柔红霉素C-14羟化酶的表达。
本发明人从国内柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomycescoeruleorubidus)SIPI-1482基因中通过PCR的方法扩增了含核糖体结合位点的、大小为1.3Kb的编码C-14柔红霉素羟化酶的doxA基因及受SnpR调控的SnpA启动子，测序后发现doxA基因序列和Genbank中报道的序列(登录号为U50973)的同源性为100％；而本发明的SnpR序列和Genbank中报道的序列(登录号为AY072041)的同源性为99.4％，氨基酸同源性为96.5％；启动子SnpA同源性为100％。因此，本发明的调控蛋白SnpR是一个新的蛋白，编码其的基因，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
而本发明的调控蛋白SnpR，是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种表达柔红霉素C-14羟化酶的载体及其基因工程菌，其包括上述编码调控蛋白SnpR的基因核苷酸序列。
本发明可利用现有技术将上述SnpR蛋白基因、启动子SnpA及doxA基因序列串联，克隆至载体中构建柔红霉素C-14羟化酶的表达载体。并进一步利用该表达载体转化宿主细胞，构建表达柔红霉素C-14羟化酶的基因工程菌。
在本发明一优选例中，从天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482基因组中扩增出带有核糖体结合位点GGAGG序列的doxA基因，克隆至质粒pUC18。同时扩增出SnpA序列及SnpR激活蛋白的序列也置于pUC18中。将doxA与SnpA和SnpR三片段亚克隆至质粒pBluescript IIKS(-)(pBlue2KSM)构建成载体pYG905，再将此串联片段(PstI-HindIII片断)与含有硫链丝菌素(tsr)抗性基因的载体pYG57(PstI-HindIII大片段)连接构建重组质粒pYG908，转化变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24原生质体，并在含30μg/ml硫链丝菌素(tsr)的R2YE培养基上筛选阳性克隆，得到本发明的表达载体及基因工程菌。
本发明要解决的技术问题之三是提供上述编码调控蛋白SnpR的基因在利用柔红霉素生物转化制备阿霉素中的应用。
换言之，本发明要解决的技术问题之四是提供一种将柔红霉素生物转化为阿霉素的新方法。
该方法利用上述的表达载体质粒pYG908转化宿主细胞为转化体，培养转化体，该转化体发酵将柔红霉素生物转化成阿霉素。
众所周知，该宿主细胞通常为不产柔红霉素的链霉菌属细胞，本发明优选变铅青链霉菌TK24，由此构建成的转化体为基因工程菌pYG908/TK24。
本发明从已公开的国内柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomycescoeruleorubidus)SIPI-1482基因中克隆了转录调控蛋白SnpR激活的金属蛋白酶基因SnpA启动子，并证明受SnpR调节的SnpA启动子的效率高。由此通过该新型调控蛋白SnpR调节启动子SnpA的转录水平，大大升高的转录水平提高了柔红霉素C-14羟化酶的表达，从而实现在培养液中直接将柔红霉素转化成阿霉素。
图1SnpR+SnpA的PCR扩增电泳图，其中1.2.3分别为天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA为模板，退火温度为62.8℃，65.5℃，68℃的PCR图，4为DNA分子量标准DL3000。
图2重组表达质粒pYG908的构建图谱。
图3pYG908的酶切验证图谱，其中1.λDNA(HindIII)，2.DL3000，3.pYG908(EcoRI-PstI)，4.pYG908(PstI-HindIII)。
图4表达质粒pYG908的PCR验证图谱，其中1.2.3为以pYG908为模板，分别以Sa+da，da+ds，Sa+Ss为引物，4.DL3000，5.λDNA(HindIII)，6.7.8为以变铅青链霉菌TK24为模板，分别以Sa+da，da+ds，Sa+da为引物，9.pYG905为模板，Sa+da为引物其中S代表SnpR+SnpA，d代表doxA，s代表sense(正向)，a代表antisense(反向)。
图5本发明工程菌pYG908/TK24表达产物的SDS-PAGE图，其中1.pYG908/TK24，2.对照工程菌pYG57/TK24，3.TK24，4.蛋白标准分子量Mark。
图6本发明工程菌pYG908/TK24的CO结合差光谱图。
图7A～C本发明工程菌pYG908/TK24及对照菌发酵产物的HPLC图。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明。
下列实施例中的材料与方法为所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
所使用的工具酶均购自Takala公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。
所使用的胶回收试剂盒购自上海生工公司，使用方法参考商品说明书。
下面的商品化质粒和大肠杆菌株用于DNA文库构建和基因克隆。
pUC18(Takala，日本)pBluescript II KS(-)(可从Promega公司购得)pYG57(中国医药工业杂志，2004，35(1)13)变铅青链霉菌TK24(可从ATCC购得)
未特殊说明的培养基和试剂均为常规市售产品。
实施例1 doxA基因及snpR+snpA的PCR扩增及测序结果以已公开的天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组为模板，对于doxA基因采用97℃ 5min，95℃ 30s，72℃ 5min，循环30次，72℃ 10min进行扩增，能扩增出单一的目的条带，大小为1.3Kb左右。而snpR+snpA的扩增采用了梯度PCR，设计的引物为正向引物CGGAATTCGCGCATCGATGACTCCTCGAG(下划线为EcoRI)，反向引物AACTGCAGGTACCGCCGACCCGCTGCAT(下划线为PstI)。退火温度分别为62.8℃，65.5℃，68℃，从图1中可以看出在62.8℃没有扩增出目的条带。为增强扩增特异性，采用了68℃退火。
对上述含核糖体结合位点的doxA基因进行了测序，发现它的序列和Genbank中报道的序列(登录号为U50973)的同源性为100％，而SIPI-1482来源的snpR序列和Genbank中报道的序列(登录号为AY072041)的同源性为99.4％(SEQ ID No.1)，氨基酸同源性为96.5％(SEQ ID No.2)，启动子snpA同源性为100％。
实施例2 重组质粒构建、酶切验证及P C R检验将上述doxA与snpA和SnpR基因序列克隆至pUC18。将其中切下来的doxA与snpA和SnpR三片段亚克隆至质粒pBluescript II KS(-)，再将此串联片段(PstI-HindIII片断)与含有硫链丝菌素(tsr)抗性基因的载体pYG57(PstI-HindIII大片段)连接构建重组质粒pYG908，转化TK24原生质体，并在含30μg/ml硫链丝菌素(tsr)的R2YE培养基上筛选阳性克隆，得到本发明的表达载体及基因工程菌pYG908/TK24，重组质粒pYG908的构建过程参见图2所示。
对重组质粒pYG908用相应的酶均能切出snpR+snpA及doxA的片段，及它们两者的串联片段(图3)。通过对重组质粒进行稀释为模板，引物的不同组合Sa、da、ds、Ss，其序列分别为SsCGGAATTCGCGCATCGATGACTCCTCGAG(EcoRI)，SaAACTGCAGGTACCGCCGACCCGCTGCAT(PstI)，dsGGAATTCGGAGGGGTGCCTCATGAGCGGCGAG(EcoRI)，daCCCAAGCTTCCATCAACGCAGCCAGACGG(HindIII)，也均能扩增出相应的目的片段(大小为1.3Kb)及串联片段(大小为2.6Kb)，而对照TK24均不能扩增出来(图4)。由此判定链霉菌表达质粒构建正确。
实施例3 重组蛋白的表达将基因工程菌pYG908/TK24接入YMB培养基(配方参见链霉菌操作手册)20ml(+tsr 30μg/ml)，30℃，250r/min摇床振荡培养2d后作为种子，然后以10(v/v)％接种量接入上述培养基中后继续培养2d，离心(10000r/min，10min)收集菌丝体，再用100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤菌丝体，然后超声破碎(工作5s，停5s，循环80次)，离心后收集上清，用于SDS-PAGE蛋白电泳分析。
如图5所示，从菌丝体的蛋白电泳结果分析可知基因工程菌pYG908/TK24产生了47kD左右的条带，大小和理论上编码423个氨基酸的柔红霉素C-14羟化酶基因的大小46.7k D相似，对照工程菌pYG57/TK24(由表达质粒pYG57转化TK24菌株所得)为doxA基因协同Dnrv作用受ermE启动子控制的工程菌，其45KD左右的条带与对照TK24没有明显的区别，说明不产生柔红霉素C-14羟化酶。
实施例4 CO结合差光谱分析(中国医药工业杂志，2004，35(1)13)pYG908/TK24工程菌株在上述YMB培养2天后转接至GMS培养基30℃培养两天后收集菌丝，匀浆处理。以TK24作为对照进行CO结合差光谱分析实验。实验样品和对照及参比先用连二硫酸钠(Na2S2O4)进行还原，然后再用样品和对照通CO 3min(各自参比均不通气)，400～500nm进行扫描。
从CO结合差光谱(图6)可以看出，pYG908/TK24在450nm处有一小峰，这从另一个角度证明C-14柔红霉素羟化酶基因得以表达。因为C-14柔红霉素羟化酶基因是一P450氧化酶，当用连二硫酸钠还原以后再用CO还原在450nm处有较小的一吸收峰。
实施例5 基因工程菌发酵转化柔红霉素为阿霉素从斜面上将实施例2所得基因工程菌pYG908/TK24及对照TK24菌株的新鲜孢子接种到20ml YMB(工程菌株培养时还要加5μg/ml tsr)培养基中，30℃、250r/min振荡培养2d后作为液体种子。将上述液体种子以10％(v/v)接种量接入GMS培养基(工程菌株培养时还要加5μg/ml tsr)后，在相同条件下培养3d后加入柔红霉素到终浓度为2μg/ml，然后继续培养3d后停止发酵。然后将培养液用5mol/L NaOH调节pH到8.5，加入等体积抽提剂(氯仿∶甲醇＝9∶1)后在30℃、220r/min抽提30min。离心(Beckman AvantiJ-25，转子JA17，8,000r/min，10min)分离上述抽提混合液，弃去上层的水相和菌体，收集得到的有机相溶液在旋转蒸发仪上抽干，红色产物用适当体积甲醇溶解，然后对该产物进行HPLC分析。
将柔红霉素作为底物加入到发酵培养基，通过HPLC图(见图7)可以看出对照TK24菌没有产生和阿霉素(英文缩写dxr)保留时间相同的峰(图7B)，但仍可以看见残留的柔红霉素(英文缩写dnr)的峰，同时也看到柔红霉素峰之前有一保留时间和它很接近的峰，根据文献报道有可能为酮还原酶作用柔红霉素产生的产物。而本发明基因工程菌能产生一保留时间和阿霉素标准样品(图7A)保留时间相同的峰(见图7C)，可初步认为是阿霉素。同时柔红霉素的峰仍然存在，说明也有部分没有转化，同时也有其他副产物生成。
序列表<110>上海医药工业研究院<120>一种调控蛋白SnpR及其基因和应用<130>051760C<160>2170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1306<212>DNA<213>天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)<220>
<221>promoter<222>(1)..(267)<223>
<220>
<221>CDS<222>(268)..(1206)<223>
<400>1gaattcgcgc atcgatgact cctcgaggtg gggggatgag tcagacatcg tgagtgtccg 60tgcccgtacg gccgttgtga tgatggcaac cgccgatagg gccgccctat ccccctccgt120ccccacctgc cccgccctgc ccggcggccc cggccggggc ccctcccgat ccgggccgac180gcctcgcgcc gtgaaggccg atggtcctga tcggtcgcca tttgtatgtc tggtgaaggc240tgaacttccg ccttaccctc ccaggac atg gag ctt gag gtc agg cac ctc agg294Met Glu Leu Glu Val Arg His Leu Arg
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Met Glu Leu Glu Val Arg His Leu Arg Ala Leu Cys Ala Ile Ala Asp1 5 10 15Thr Gly Ser Leu His Arg Ala Ala Arg Gln Leu Gly Val Thr Gln Pro20 25 30Ser Leu Ser Thr Gln Leu Arg Arg Ile Glu His Glu Leu Gly Gly Ala35 40 45Leu Phe Val Arg Ala Arg Ala Gly Cys Arg Pro Thr Pro Leu Gly Arg50 55 60Leu Val Leu Ser Arg Ala Arg Pro Leu Val Ala Glu Leu Arg Ser Leu65 70 75 80Val Ser Glu Ala Arg Ala Ala Ala Val Gly Gly Arg Gln Leu Arg Val85 90 95Gly Ser Thr Ala Ser Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Arg Leu Arg100 105 110Arg His Trp Gln Glu Pro Thr Leu His Met Asp Val Ser Ala Asn Ala115 120 125Leu Leu Arg Met Val Ala Asp Gly His Leu Asp Val Ala Phe Val His130 135 140Glu Val Glu Gly Ser Pro Leu Arg Val Pro Glu Gly Leu Arg Val Arg145 150 155 160Val Leu Val Gln Arg Glu Pro Gln Phe Val Cys Leu Pro Ala Asp His165 170 175Pro Ala Ala Ala Lys Pro Val Val Arg Leu Ala Asp Leu Ala His Asp180 185 190Arg Trp Met Ile Asp Pro Thr Val Asp Gly Glu Trp Asp Ala Val Arg195 200 205Arg Val Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asp Pro Arg Ile Leu His Gly Asp210 215 220Tyr His Thr Ala Ala Ser Leu Val Ala Thr Gly Glu Val Val Thr Val225 230 235 240Val Gln Pro Thr Ser Pro Ser Arg Ala Glu Thr Ala Val Arg Arg Leu245 250 255His Gly Asp Pro Leu Gly Val Arg Leu Leu Leu Ala Ala Arg Thr Asp260 265 270
Thr Glu Leu Glu Gly Val Tyr Pro Asp Leu Ala Glu Ala Tyr Gly Glu275 280 285Val Ala Arg Gln Ala Pro Ala Tyr Arg Glu Trp Leu Glu Arg Ser Gly290 295 300Ser Gly Ala Leu Val Pro Ala Leu Pro305 310
权利要求
1.一种编码调控蛋白SnpR的基因，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列；2)编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.一种调控蛋白SnpR，是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.一种表达柔红霉素C-14羟化酶的载体，其包括权利要求1所述的编码调控蛋白SnpR的基因核苷酸序列。
4.一种用于表达柔红霉素C-14羟化酶的基因工程菌株，其是将权利要求3所述的表达载体转化到变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24中得到的基因工程菌株。
5.如权利要求1所述的编码调控蛋白SnpR的基因在利用柔红霉素生物转化制备阿霉素中的应用。
6.一种将柔红霉素生物转化为阿霉素的方法，其特征在于利用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，该转化体发酵将柔红霉素生物转化成阿霉素。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于该宿主细胞为不产柔红霉素的链霉菌属细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于该不产柔红霉素的链霉菌属细胞为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24，该转化体为权利要求4所述的基因工程菌株。
全文摘要
本发明公开了一种编码调控蛋白SnpR的基因核苷酸序列及该蛋白的氨基酸序列。提供了含有该基因的表达柔红霉素C－14羟化酶的载体和基因工程菌，及其在利用柔红霉素生物转化制备阿霉素中的应用。并提供一种柔红霉素生物转化为阿霉素的新方法，通过克隆本发明SnpR蛋白基因，及受其调节的SnpA启动子序列至质粒表达载体，来表达编码柔红霉素C－14羟化酶基因doxA，并转化宿主细胞变铅青链霉菌TK24可以在培养液中直接将柔红霉素转化成阿霉素。
文档编号C07K14/195GK1962869SQ20051011013
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月9日 优先权日2005年11月9日
发明者朱春宝, 谢丽萍, 吴大治, 胡又佳, 朱宝泉 申请人:上海医药工业研究院