专利名称：针对人Cbfal基因的siRNA和其表达载体以及它们在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及一种特异性抑制人Cbfa1基因表达的siRNA与其表达载体以及它们在制药中的应用。
背景技术：
1.RNA干扰技术RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种高效、特异(专一性)的基因阻断技术，被广泛运用于基因治疗研究、功能基因组研究、药物筛选、病毒感染研究、信号传导途径研究等领域。与用反义寡核苷酸技术的基因治疗相比，双链RNA干扰技术的优点是①靶向性、专一性强。②双链RNA干扰技术有放大持续作用，时间短，见效快，且实验重复性和稳定性均很好。③双链RNA干扰技术所用合成的双链RNA剂量小，比反义技术剂量小近万倍。④双链RNA可用载体进行表达，一次转染可持续表达一个月以上，稳定并且表达量较高。目前RNAi技术已经开始被应用于临床实验性治疗，第一例是一名患有视网膜黄斑变性的患者。目前正在临床或实验室研究阶段的采用RNA干扰技术治疗的疾病还有哮喘、Huntington′s病、艾治病、肝癌、炎性疾病、脊髓侧索硬化、肝炎、心血管病和糖尿病等严重影响人类健康的疾患。RNA干扰技术给那些以往一些无法治疗、难以治愈或难治性的疾病带来了新的曙光。
2.目前骨关节炎(osteoarthritis，OA)的治疗状况OA是全球最常见的肌-骨骼系统慢性退变性疾病之一。OA临床治疗手段极其有限，归纳起来主要有下面两类针对缓解疼痛症状的药物治疗改善关节功能的手术治疗。其中药物治疗主要有两类(1)主要采用针对缓解疼痛的抗炎治疗。这类药物只是一定程度的缓解疼痛，并不能解除疼痛，并且还会带来很多副作用，如胃肠道系统并发症；(2)局部关节内注射透明质酸制剂，用于缓解疼痛症状和促进早期OA病变组织修复。这两类药物治疗是否能够有效改善病变组织结构或者延缓OA进展还存在很大争论。手术治疗是目前治疗OA晚期功能障碍的唯一有效手段。但是它存在很多不足之处，如手术风险、手术相关并发症和高昂的手术费用；而且这种膝、髋关节置换是有一定有效期限的，通常在10到20年左右需要做关节翻修手术。因此我们需要研究更为有效的治疗方法，阻止其发展到晚期关节功能障碍的阶段，提高患者的生活质量，减少疾病给其带来的巨大的经济负担。软骨细胞肥大分化(即成熟分化)在OA中起了很非常重要的作用，是导致OA病变不可逆性的原因之一。
3.核心结合因子(core binding factor 1，Cbfa1)与软骨细胞肥大分化以及骨关节炎的关系软骨细胞肥大分化(即成熟分化)在OA中起了非常重要的作用，是导致OA病变不可逆性的原因之一。阻断软骨细胞肥大分化可以明显缓解或预防病变进展。我们准备采用通过RNAi技术阻断Cbfa1表达，进而阻断软骨细胞肥大分化的途径，来治疗OA。我们的立论依据是(1)Cbfa1是调控软骨细胞成熟分化和成骨细胞分化重要的转录调控因子。无论在胚胎期还是出生后，Cbfa1都严格定位于骨骼系统的细胞系，而不表达于其他组织细胞。Cbfa1(-/-)小鼠动物模型中，成骨细胞分化完全受阻，未见骨组织形成，软骨细胞不能分化成熟，停留在肥大软骨细胞前的状态，但软组织结构没发现异常改变。Cbfa1高表达会诱导正常关节软骨细胞发生肥大分化，促进碱性磷酸酶活性和基质钙化。而在成熟分化的软骨细胞中抑制Cbfa1表达，会显著抑制碱性磷酸酶活性和基质钙化。(2)Cbfa1是基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP13)/胶原酶3转录合成所必要的调控因子，MMP13是II型胶原的主要降解酶，是导致软骨结构持续破坏的原因之一。成骨细胞和软骨细胞成熟分化为肥大软骨细胞细胞后期，可以发现MMP13表达增高现象，但是在软骨细胞中没有发现有MMP13表达。在人骨性关节炎的关节软骨细胞中同时发现有Cbfa1和MMP13表达，Cbfa1和MMP13的分布一致，Cbfa1表达变化影响MMP13的表达水平。Cbfa1(-/-)小鼠中无MMP13表达。因此阻断Cbfa1表达的同时会阻断或减少MMP13的表达。(3)应用Cbfa1(+/-)实验小鼠研究发现，Cbfa1表达量减少会减轻OA的病变程度，延缓疾病进展。(4)OA是一种局部病变，可以采用局部直接注射的给药方式。
发明内容
为此，本发明的目的是提供一种特异性有效抑制Cbfa1基因表达的siRNA和能够产生上述siRNA的表达载体。它们可以特异地靶向作用于人Cbfa1mRNA，从而抑制Cbfa1表达，阻断成骨细胞分化以及软骨细胞肥大分化。
本发明的另一个目的是提供上述siRNA或产生siRNA的表达载体在制备治疗骨关节炎，以及与成骨细胞分化或软骨细胞肥大分化相关疾病的药物中的应用。
此类含有针对Cbfa1基因siRNA以及其表达载体的骨关节炎药物适于局部直接灌注，或注射。
本发明中，含有针对Cbfa1基因的siRNA和其表达载体的药物的主要用途是治疗骨关节炎疾病具体包括如下原发性骨关节炎；继发性骨关节炎；类风湿性关节炎；以及组织工程软骨或细胞移植治疗关节软骨缺损远期发生的骨关节炎；以及与成骨细胞分化或软骨细胞肥大分化相关疾病，在本说明书中，术语“治疗”指的是预防性或防止性治疗以及治疗性或缓和疾病的治疗，包括治疗有患病危险或者怀疑已经患病的患者以及病态的或者已经被诊断患有疾病或医学状况的患者。
本发明的目的是这样实现的一种特异性抑制人Cbfa1基因表达的siRNA，其特征在于它包含表1中6种siRNA的其中任意一种或几种，它们的碱基序列及作用部位(见表1)。
所述的针对Cbfa1基因siRNA，它们可通过人工合成以及质粒、病毒表达载体表达形成，其特征在于该siRNA在3′端有2～6个dT或U修饰。
包括表1中所述的siRNA的表达载体。
所述的针对Cbfa1基因的siRNA和/或其表达载体在制备治疗骨关节炎，以及与成骨细胞分化或软骨细胞肥大分化相关的疾病的药物中的应用。
本发明的详细描述本发明通过设计6种针对人Cbfa1mRNA序列的siRNA[见表1]，并且设计相应的shRNA结构，然后采用双向或发夹结构合成DNA链，通过重组将其构建入质粒载体或进一步构建入病毒载体。酶切鉴定法证实插入片断正确。测序进一步证实基因无点突变。将载有Cbfa1shRNA病毒载体转染包装细胞后，获得慢病毒上清。体外实验验证Cbfa1shRNA表达载体抑制Cbfa1的表达效率。结果显示本发明靶点1序列的Cbfa1siRNA表达载体抑制效率最好，达到了大于90％，其他的5个的siRNA序列的抑制Cbfa1表达的效率也均达到了大于70％。小鼠骨关节炎动物模型验证，其具有明显延缓疾病进展，减轻关节病变程度。
表1干扰人Cbfa1基因表达的siRNA序列和作用位点
本发明的优点是本发明设计的针对Cbfa1的siRNA和其表达载体，能够有效抑制Cbfa1基因表达75～90％以上，能有效阻断软骨细胞肥大分化以及成骨细胞分化，基本无毒副作用，作用剂量小，特异性非常高。
图1设计双链shDNA寡核苷酸链的模式2shRNA重组到质粒载体结构图示图3pEN_hH1c质粒图谱图4psiCHECKTM-2图谱图5含有序列1(SEQ ID NO.1)Cbfa1shRNA的质粒载体抑制Cbfa1表达的效果6pDSL_hpUGIP图谱图7将质粒中的H1-Cbfa1-shRNA重组到病毒载体的演示图具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1.构建Cbfa1siRNA真核表达质粒载体1、根据Genbank数据库中的Cbfa1mRNA NM_001024630，NM_001015051和NM_004348序列，结合Ambion在线软件和Maurice Ho设计的软件设计选择6条19nt的核苷酸序列作为RNAi靶点，它们能够同时阻断3个转录本的表达(见表1)。
我们以序列1(SEQ ID NO.1)为例靶点序列5’-GCACACCACTGTCCATTTA-3’2、构建Cbfa1shRNA表达框架结构；设计寡核苷酸链，末端引入BamH1和Xho1酶切位点，中间Loop序列TTCAAGAGA，设计模式图见图1。分别合成两条含有shRNA对应序列的互补DNA寡核苷酸单链。
正义寡核苷酸链5’-GATCCCCGCACACCACTGTCCATTTATTCAAGAGATAAATGGACAGTGGTGTGCTTTTTC-3’(SEQ ID NO.7)反义寡核苷酸链3’-GGGCGTGTGGTGACAGGTAAATAAGTTCTCTATTTACCTGTCACCACACGAAAAAGAGCT-5’(SEQ ID NO.8)3、构建重组质粒的过程(如图2所示)。取上述的正义和反义寡核苷酸链片断各10μg，退火形成互补双链。将中间载体pEN_hH1c(ATCC)(见图3)BamH1和Xho1双酶切后，凝胶电泳回收大片段。质粒载体系统与shRNA重组(具体操作见AfCS protocol PP00000230.)，转化大肠杆菌进行扩增、纯化重组的质粒DNA，限制性内切酶筛选正确克隆的质粒，基因测序保证序列的正确性，无基因突变4、将目标基因Cbfa1cDNA连接融合到双荧光酶(萤火虫荧光酶和Renilla荧光酶)报告基因载体系统psiCHECKTM-2(Promega)(见图4)中的Renilla基因结构中，构建psiCHECKTM-2Cbfa1；5、通过转染试剂将psiCHECKTM-2Cbfa1分别与pEN_hH1cCbfa1shRNA、无关序列阴性对照和Renilla-shRNA阳性对照共同转染到HEK239细胞中；应用双荧光酶报告分析系统，检测萤火虫和Renilla的荧光酶活性，测定Renilla/萤火虫荧光酶活性比，同时比较pEN_hH1cCbfa1shRNA组和阴性、阳性对照组的Renilla/萤火虫活性比值；结果显示针对序列1(SEQ ID NO.1)的干扰能够有效抑制Cbfa1表达达到95％(见图5)。
实施例2.应用上面筛选的最有效的Cbfa1siRNA真核表达质粒载体构建表达Cbfa1siRNA的慢病毒1、应用LR.ClonaseTM II克隆酶反应系统(invitrogen)处理pEN_hH1cCbfa1shRNA载体和pDSL_hpUGIP慢病毒表达载体(见图6)，将质粒中的hH1启动子-shRNA读码框架亚克隆到pDSL_hpUGIP载体中，构建pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA，模式图参见图7。限制性内切酶筛选正确克隆的病毒载体。
2、分别将pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA和pL_UGIP(空白对照，ATCC)与病毒包被载体共同转染HEK293T细胞进行病毒包装，分别构建出表达Cbfa1siRNA的慢病毒和空白对照慢病毒，两者均具有绿荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)报告基因和Puromycin选择性基因；基因测序保证序列的正确性，然后扩增病毒。
实施例3.重组慢病毒pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA抑制软骨细胞肥大分化的体外实验1、联合应用IL-1α(10ng/ml)和维甲酸A(10-5M)作为诱导刺激因素进行研究。(参考文献Glasson SS，et al.Nature.2005；31；434(7033)644-8)2、取活检得到的人关节软骨组织块，在添加IL-1α和维甲酸A无血清的DMEM培养液中培养。
3、实验分3组A组(实验组)应用表达Cbfa1shRNA的慢病毒感染人关节组织块中的软骨细胞；B组(阴性对照组)空白对照腺病毒感染人关节组织块中的软骨细胞；C组(单纯诱导组)体外培养的人关节组织块。3组都在体外培养两天后给予相同的刺激条件[即添加IL-1α(10ng/ml)和维甲酸A(10-5M)]。
4、分别于培养4周和8周后进行检测，观察细胞表型改变，应用定量RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Cbfa1、骨钙素、碱性磷酸酶和磷酸甘油醛脱氢酶、脂蛋白脂酶、脂细胞蛋白2的变化。
5、结果显示阻断Cbfa1表达能够阻断软骨细胞肥大分化。
实施例4.重组慢病毒pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA抑制间充质干细胞向成骨细胞肥大方向分化的体外实验1、联合应用BMP2和TGFβ1作为诱导刺激因素进行研究。
2、培养人间充质干细胞，在添加BMP2和TGFβ1的无血清DMEM培养液中培养。
3、实验分3组A组(实验组)应用表达Cbfa1shRNA的慢病毒感染人MSCs，筛选阳性克隆细胞株；B组(阴性对照组)空白对照慢病毒感染人MSCs，筛选阳性克隆细胞株；C组(单纯诱导组)提取、培养人MSCs。3组细胞都给予相同的刺激条件。
4、体外培养4周，观察细胞表型改变，并且应用定量RT-PCR和Westernblot检测Cbfa1、骨钙素、碱性磷酸酶和磷酸甘油醛脱氢酶、脂蛋白脂酶、脂细胞蛋白2的变化。
5、结果显示阻断Cbfa1表达能够明显阻断间充质干细胞向成骨细胞方向分化。
序列表<110>北京大学第三医院<120>针对人Cbfa1基因的siRNA和其表达载体以及它们在制药中的应用<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>1gcacaccacu guccauuua 19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA
<400>2auacuuccau cuccaaaua 19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>3uacuuccauc uccaaauau 19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>4uggcagcacg cuauuaaau 19
<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>5auccaaauuu gccuaacca 19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小双链RNA<400>6auuugccuaa ccagaauga 19<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>stem_loop<222>(27)..(35)<223>人工设计的正义链<400>7gatccccgca caccactgtc catttattca agagataaat ggacagtggt gtgctttttc 60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>stem_loop<222>(23)..(31)<223>人工设计的反义链<400>8gggcgtgtgg tgacaggtaa ataagttctc tatttacctg tcaccacacg aaaaagagct 60
权利要求
1.一种特异性抑制人Cbfal基因表达的siRNA，其特征在于它包含下列6种的其中任意一种或几种，它们的碱基序列以及作用于CbfalmRNA的具体部位如下①正义链5’-GCACACCACUGUCCAUUUA-3’反义链3’-CGUGUGGUGACAGGUAAAU-5’同时作用于CbfalmRNA的3个转录本，具体部位是NM_001024630的第4038～4056位，NM_001015051的第3972～3990位，NM_004348的第4186～4204位。②正义链5’-AUACUUCCAUCUCCAAAUA-3’反义链3’-UAUGAAGGUAGAGGUUUAU-5’同时作用于CbfalmRNA的3个转录本，具体部位是NM_001024630的第2853～2871位，NM_001015051的第2787～2805位，NM_004348的第3001～3019位。③正义链5’-UACUUCCAUCUCCAAAUAU-3’反义链3’-AUGAAGGUAGAGGUUUAUA-5’同时作用于CbfalmRNA的3个转录本，具体部位是NM_001024630的第2854～2872位，NM_001015051的第2788～2806位，NM_004348的第3002～3020位。④正义链5’-UGGCAGCACGCUAUUAAAU-3’反义链3’-ACCGUCGUGCGAUAAUUUA-5’同时作用于CbfalmRNA的3个转录本，具体部位是NM_001024630的第1644～1662位，NM_001015051的第1578～1596位，NM_004348的第1792～1810位。⑤正义链5’-AUCCAAAUUUGCCUAACCA-3’反义链3’-UAGGUUUAAACGGAUUGGU-5’同时作用于CbfalmRNA的3个转录本，具体部位是NM_001024630的第1661～1679位，NM_001015051的第1595～1613位，NM_004348的第1809～1827位。⑥正义链5’-AUUUGCCUAACCAGAAUGA-3’反义链3’-UAAACGGAUUGGUCUUACU-5’同时作用于CbfalmRNA的3个转录本，具体部位是NM_001024630的第1667～1685位，NM_001015051的第1601～1619位，NM_004348的第1815～1833位。
2.根据权利要求1所述的特异性抑制人Cbfal基因表达的siRNA，它们可通过人工合成以及质粒、病毒表达载体表达形成，其特征在于该siRNA在3′端有2～6个dT或U修饰。
3.包括权利要求1或者2所述的siRNA的表达载体。
4.根据权利要求1或者2所述的特异性抑制人Cbfal基因表达的siRNA在制备治疗骨关节炎，以及与成骨细胞分化或软骨细胞肥大分化相关的疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的特异性抑制人Cbfal基因表达的siRNA表达载体在制备治疗骨关节炎，以及与成骨细胞分化或软骨细胞肥大分化相关的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种特异性抑制人核心结合因子(core bindingfactor 1，Cbfa1)基因的siRNA及该siRNA的表达载体和它们在制备与Cbfa1基因有关的疾病的药物中的应用。本发明以RNA干扰技术为基础，设计出一组能诱发RNA干扰的siRNA，通过化学合成、转录合成siRNA，或通过质粒、病毒载体表达一定量的siRNA，从而特异性抑制人Cbfa1基因的表达，达到抑制成骨细胞分化以及软骨细胞肥大分化的目的。该siRNA及其表达载体可以用于制备高效快速、特异性强、副作用少的治疗骨关节炎，以及与成骨细胞分化或软骨细胞肥大分化相关的疾病的药物。
文档编号C07H21/00GK101067134SQ200710090980
公开日2007年11月7日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者孔清泉, 陈仲强 申请人:北京大学第三医院