专利名称：编码白树种子储藏蛋白多肽的脱氧核糖核酸顺序的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及免疫毒素白树种子储藏蛋白(gelonin)，具体地说涉及白树种子储藏蛋白分子生物学，包括人工合成白树种子储藏蛋白基因的方法。
人们目前对细胞毒性感兴趣在于它们可能用来特定地作用于靶肿瘤细胞。植物毒素白树种子储藏蛋白就是这样一类物质。白树种子储藏蛋白是一种(分子量约20～30，000千道尔顿)糖蛋白，从多叶白树(Geloniummultifoum)的种子纯化而得到。它属于一类能使核糖体失活的植物毒素。这类毒素的其它成员包括红豆因、蓖麻毒素和modeccin的链。象红豆因和蓖麻毒一样，白树种子储藏蛋白通过破坏哺乳动物核糖体的60S亚基而抑制蛋白质合成。尽管蓖麻毒的A链是常用的免疫毒素，但白树种子储藏蛋白对化学和物理处理似乎比RTA更稳定(Barbieri等著的《CancerSurv.1》489-520页(1982))。另外，白树种子储藏蛋白本身不与细胞结合，所以不具有毒性(除非浓度很高)，并且在实验室的操作中很安全。核糖体的失活是不可逆的，其作用似乎不需要辅因子参与，并且效率较高，这提示白树种子储藏蛋白可以象酶一样起作用。
白树种子储藏蛋白和红豆因是抑制蛋白质合成的最有效毒素。白树种子储藏蛋白的抑制蛋白合成的活力比红豆因A链高10～1000倍。红豆因和蓖麻毒这样的肽由两条链组成，A链是毒性单位，B链与细胞结合。与红豆因和蓖麻毒不同，白树种子储藏蛋白由单链组成，并且由于它没有一与细胞结合的B链，所以相对来说其本身对完整细胞没有毒性(Stripe等著，J.Biol.Chem.2556947-6953页(1980))。哺乳动物的细胞显然不能与白树种子储藏蛋白分子结合和/或使其进入细胞。白树种子储藏蛋白与靶肿瘤细胞的单克隆抗体的连接，与如针对黑素瘤细胞上抗原的单克隆抗体ZME连接可以使白树种子储藏蛋白特定地与细胞结合并进入使白树种子储藏蛋白抗体复合物进入细胞。用毒素白树种子储藏蛋白而不用其它毒素如红豆因A链其优点在于与红豆因A链相比，白树种子储藏蛋白对正常组织的毒性较低。与针对相关抗肿瘤抗原的单克隆抗体结合白树种子储藏蛋白是一种可选择用于治疗肿瘤的有效的免疫毒性剂。
几个研究者将白树种子储藏蛋白作为细胞毒性剂，用化学的方法使其与单克隆抗体或肽激素的细胞靶配位体相连接。但对白树种子储藏蛋白和细胞靶点的化学修饰会减少有效定位和白树种子储藏蛋白本身的胞毒潜力。而自然来源的白树种子储藏蛋白，其细胞毒性在收获过程中和在植物生长时又受到影响。用化学方法或重组技术生产的人工合成的白树种子储藏蛋白毒素可提供充足的、可再生的毒素来源。所以，用重组技术来制备一种白树种子储藏蛋白的合成基因和制备合成基因的方法是非常必要的。
本发明提供了白树种子储藏蛋白合成基因的核苷酸顺序和它的制备方法。白树种子储藏蛋白合成基因的DNA(脱氧核糖核酸)顺序在顺序编号1中给出。本发明也提供了含这些DNA顺序的表达载体和这些表达载体转化后的细胞。
本发明的一个实施例提供了生产克隆和表达编码白树种子储藏蛋白的合成基因方法。首先，设计编码来源于纯化的白树种子储藏蛋白最初氨基酸顺序的双链DNA片段，氨基酸顺序改造这个DNA片段使其有利于基因的合成、克隆、表达或生物化学操作。接着，设计、合成、纯化能连在一起形成目的基因的一组合成寡聚核苷酸(也叫低聚核苷酸)并使其5′磷酸化。接着，这些寡聚核苷酸退火后连接形成完整的基因。合成基因与一适当克隆载体连接，并测出克隆基因的核苷酸顺序。进行定点诱变以纠正克隆基因中所有不希望的突变之后，基因被亚克隆入适当的表达载体中。含合成白树种子储藏蛋白基因的表达载体被放入适当的载体宿主中，然后在适于生产白树种子储藏蛋白产品的条件下保存表达宿主，并从表达该基因的细胞中分离、纯化白树种子储藏蛋白蛋白质。
本发明的另一实施例提供了含有核苷酸和片段及其衍生物的序列的合成DNA，它编码的Selonin或多肽抑止细胞内蛋白质的合成而又不与细胞表面的受体结合，其核苷酸顺序是见顺序编号1。同时也提供了带有合成白树种子储藏蛋白DNA的表达载体及带有表达合成白树种子储藏蛋白基因的宿主细胞。
本发明的还有一个实施例提供了植物毒性蛋白白树种子储藏蛋白与抗体结合而形成的一种免疫毒素。
从本发明目的出发，术语“片段”是指顺序编号1中的任何能产生抑制细胞蛋白质合成但不与表面受体相结合的蛋白质的部份。“衍生物”是指含有替换的一种或多种单个核酸，它们产生同样的蛋白质或多肽。
本发明了解到并针对前述的长期需要，充分满足那些需要并提供不同的实施例。那些受益于本发明的示范和描述的本领域熟练人员，会很清楚本发明的其它及进一步目的和优点，其它的内行人员也一样。参照附图，下面就描述目前的较佳实施例以揭示本发明。尽管为保证完整且帮助理解，这些描述很具体，但这并不是有意要改变专利的目的，即使后来者对本发明进行改变和形成或另外加入进一步的改进，本发明仍受专利保护。为了使本发明上述的目的、优点和特征以及其他要说明清楚的事项能被详细了解，对本发明上述简要概括更具体的描述可参见实施例及其附图。附图构成本说明书的一部分，值得一提的是，尽管附图描写了本发明的较佳实施例，但并不认为是限制它的范围。本发明也认可其它有同样效果的相当实施例。
图1是化学合成寡聚核苷酸方法的图示。
图2是固相基因装配过程的描写。
图3是白树种子储藏蛋白基因装配过程的图示。
图4示出寡核苷酸在白树种子储藏蛋白基因中的排列。
图5描写了用于组装白树种子储藏蛋白基因的低聚核苷酸顺序。
分子生物学的最近发展已使许多编码在生物医学和农业上有重要意义的蛋白质的基因的克隆、表达和遗传工程成为可能，此领域中的最近一个重要的进展是能够设计并生产合成基因。合成基因能编码已知氨基酸顺序的蛋白质以及不是天然存在的新的蛋白质，这对有医疗价值的蛋白质特别有用。例如白树种子储藏蛋白设计、合成、克隆并表达以蛋白质的氨基酸顺序为基础的基因是可行的。即使有关天然基因的特定信息还不知道时，比如，基因还未克隆，此设计、顺序、克隆和表达仍然是可能的。还有，基因合成有利于对不同基因产品的工程化，这些产品具有天然蛋白没有的特性。例如，对通常仅在植物或动物中发现的蛋白质的基因可被设计，合成并克隆到载体中，此载体能在微生物宿主内产生大量的蛋白质。
合成基因的一个优点是与遗传密码的多重性有关。许多氨基酸在一个基因内大多数氨基酸可由多个三联密码子编码，不同生物体趋向于使用不同类型的蛋白质的密码子(S.Aota等.，《NucleicAcidsRes.》第16卷附卷pp.r315-r391(1987))。也就是说，一种有机体“较好”的密码子与另一种有机体较好的密码子的是不同的。这种现象据信是与tRNA分子的多重性的差别有关，这种多重性表现为对一种给定的氨基酸，可以有多个特异接受相同性的tRNA相对应的相同。即使基因产品是来自“异源”的宿主生物体，且该生物体对某些氨基酸较好的密码子与表达宿主不一样，同样能设计出带有给定表达系统所较好的密码子合成基因。已经表明，如果在基因设计中选择的密码子是与微生物宿主常用密码子相应的，合成的哺乳动物蛋白质的基因能在微生物宿主中产生较大量的蛋白质产品。此现象在白树种子储藏蛋白基因的设计中(最初从植物来)也已考虑到引入大肠杆菌表达宿主。为在一个不同的宿主系统中表达，一个本技术领域的一般人员可容易地重新设计白树种子储藏蛋白基因使其具有不同宿主的最佳密码子。
合成基因的另一个优点实际上在此案中是通过重复的基因密码来实现。即编码目的基因的DNA顺序可被修饰，(不改变编码的氨基酸顺序)使整个基因含有最大量的限制酶识别的单一位点。大量单切位点的存在大大有利基因的生物化学操作。例如，可以切开基因的一段并用不同的DNA顺序取代它(通过位置相近的单一限制酶切位点实现)，使新的遗传信息通过重组DNA技术引入基因。此过程有用的操作包括把突变引入基因的特定区域，校正基因合成装配和克隆过程中出现的突变，并产生嵌合基因或融合基因，以编码具有不同蛋白质的功能区域的蛋白质。
此合成基因的设计也能改变可以非编码“旁侧”DNA顺序以利用基因的克隆和表达。例如，可把限制性核酸内切酶识别顺序加入基因的旁侧区域，使基因特定连接到所用的克隆载体。另外，遗传信号也可加入合成基因用于在体内控制基因的表达。
另外，基因的从新设计使将基因产品在体内定位于某一组织或细胞器成为可能，这可提高基因产品的治疗作用。比如，通过把一顺序加入相关的基因可使治疗剂位于特定细胞类型，此顺序能编码与靶细胞表面受体特异结合的多钛区域。
合成基因设计进一步包括短DNA链的化学合成和将寡聚核苷酸连接到较长的双链DNA片段。DNA的化学合成可避免低效偶合，当连续把大量G或C残基加入链时常出现这种情况。同样，也希望能避免链内次级结构(发夹结构)或分子内互补的形成，它们会在寡聚核苷酸退火时干扰基因的正常装配。
基因装配的过程包括下列步骤，第一，写出与目的编码区域的相应的两链核苷酸顺序，提供两股之间最佳的互补配对碱基。然后加入任意所需的旁侧顺序，例如可在编码顺序邻近加入限制性核酸内切酶识别位点。然后，基因被分组成重叠的单链片段。用自动化DNA合成仪化学合成单链片段。结合成基因的连续核苷酸互补重迭的长度是可选择的，但典型的为6～20碱基。在合成基因的所有寡聚核苷酸化学合成后，最好用聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法纯化。然后用多钛激酶和腺苷5′-三磷酸盐使纯化的低聚核苷酸5′-磷酸化。然后在单一混合物、3-10个重叠的核苷酸中，或通过分步加入寡核苷酸到固相载体上，一起对链状物退火。组装的基因末端形成用于基因克隆的限制位点。为方便DNA测序组成的基因典型地先克隆到单链载体M13。如果有必要，可用寡核苷酸定点诱变校正突变。
合成基因的所希望有的特点(最佳密码子使用，单限制位点，次级结构的消除等)可在几种任意的商用微机DNA顺序分析程序帮助下进行设计。
本发明使用了两个最新的进展，使基因更快、更经济地合成，且为蛋白质工程创造了机会(K.L.Beattie等人，《Biotechnol.Appl.Biochem.，》10，510-521(1988);K.L.Beattie和R.F.Fowler，《自然》，352，548-549(1991))。第一个进展是图1中所描写的大量低聚核苷酸的快速经济合成技术。此技术使在一天里就能制备组装一个基因所需的所有的合成DNA。参考图1，核苷衍生化控制的孔玻璃被放入单个合成片中，片由Teflon圆柱体组成，具有孔的末端，以使液体流过一系列的片。同时，通过用氨基磷酸脂方法让反应剂流过柱体来把A，G，C或T加到与CPG相连并在片中的DNA链上(L.J.McBride和M.H.Carnthers，TetrahedroLett.，24，245-248(1983))。在每次化学反应循环完成之后，片被分入不同的柱中，以提供在每张片中不同核苷酸顺序的合成。一张通过四次循环的片的连续位置(涂黑)被示出，此使AGCT被加入到不断加长的DNA链中。
第二利于基因合成的技术进展是提供一种把合成低聚核苷酸分步加到固相载体上以形成基因的方法。参照图2，目的基因被设计成从由一系列重叠互补的低聚核苷酸装配合成。合成从一端结合于固相载体的一个寡核苷酸开始，5′-磷酸化核苷酸被连续(摩尔过量)加到载体结合的链上。在每用一步退火反应前，非结合的DNA被冲洗去。整个合成用DNA连接酶处理以封住裂口，然后在载体结合的低聚核苷酸中所含的唯一限制位点进行酶切，从载体上释放基因。被释放的DNA被连接到一适当的测序和表达载体中。
可选择许多表达合成基因的载体-宿主环境来生产编码蛋白质。这在“MethodsinGazymolgy第152卷，1987年，《AcademiPress》中有具体讨论。简单讲，特殊的表达载体是可用于细菌、真菌动物和植物宿主的。大肠杆菌是表达外源基最常用的宿主，啤酒酵母也是一个常用的宿主。如前所述，如果克隆基因被化学合成，在基因设计时为增加表达水平使用的是表达宿主的最佳密码子。大多数表达载体在与克隆位邻近的地方含有遗传控制因子，它促使高水平基因表达。表达载体中可诱导的启动子典型的是从细菌(如tac，trp)和病毒(如λ，SV40)衍生出来的。“信号顺序”元素有时被包含在载体中，以把基因产品运到宿主细胞之外。信号顺序能利于纯化和减少蛋白降解。在合成基因的情况下，任何希望的遗传控制因子都可被包括在“装配”的双链DNA中。一些表达载体在紧靠克隆位置的地方含编码顺序，这样，外源编码顺序正确插入阅读框架导致融合蛋白质的产生。在合成基因的情况下，可在组合顺序中提供附加的编码顺序。基因产生为融合蛋白质有几个优点，包括增加表达、较大的稳定性、高亲合力纯化(利用能与附加的多肽成份结合的载体上的配位体)和基因产品在细胞内定位(例如，定位于表面具有附加多肽成份受体的细胞类型)。在白树种子储藏蛋白治疗的进一步发展中，基因工程与后面的特征将被结合。
在编码植物毒素白树种子储藏蛋白的DNA顺序的克隆和表达中，可用多种载体。这些包括，例如，由染色体片段，非染色体和合成的DNA顺序组成的载体，如各种已知SV40的衍生物、已知的细菌质粒，(例如，来自于大肠杆菌的质粒col El，pCR1，pBR322，pMB9和它们的衍生物)，广泛宿主质粒，((例如)，RP4)、噬菌体DNA(例如，各种噬菌体入衍生物，如NM989和其它DNA噬菌体DNA，如M13和丝状单链DNA噬菌体)、酵母质粒(如2ll质粒或它的衍生物)和从质粒和噬菌体DNA的共同衍生的载体，(如可用于噬菌体DNA或其它表达控制顺序的修饰过的质粒)。
在每种特定的克隆或表达载体中，可选择各种位点来插入本发明的DNA顺序。这些位点通常存在于限制核酸内切酶的酶切位点，且为此技术领域一般人员所熟知。各种把DNA顺序插入这些位点以形成重组DNA分子的方法也是被熟知的。它们包括，例如，dG-dc或dA-dT加尾，直接连接、合成接头、核酸外切酶和多聚酶修补反应后连接，或用DNA聚合酶和一适当的单链样板延长DNA链后再连接。当然，本发明所用的克隆和表达载体对于选择的DNA片段的插入是不需有限制核酸内切酶切位点的。而不同的，此载体可通过另外的方法来与片段连接。
为表达本发明的DNA顺序，这些DNA顺序与一种或多种表达载体中的表达控制顺序连接。这种有效连接可在选择的DNA顺序被引入克隆载体之后或之前，使表达控制顺序能控制并促进引入的DNA顺序的表达。
控制DNA顺序表达的多种表达控制顺序都可在这些载体中应用以表达本发明的DNA顺序。这样有用的表达控制顺序包括，例如SV40的早期和晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC或TRC系统，噬菌体入的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白质的控制区域，3-磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶基因的启动子，酸性磷酸酶，比如Pho5基因的启动子，酵母α-配合因子的启动子和其他已知的控制原核细胞或真核细胞或它们的病毒及这些顺序的结合基因表达的顺序。在哺乳动物细胞中，通过将表达单位与脱氢叶酸还原酶基因连接并选用中国仓鼠卵巢细胞作宿主也可能扩增表达单位。
载体或表达载体和引入选择的DNA片段位点的选择和本发明所用的表达控制顺序由各种因素决定。例如，这些因素包括对一特定限制酶可能的位点数目，被表达的蛋白质大小，表达特征比如与载体顺序相关的起始和终止密码子的地点。其他因素也为本技术领域一般人员所熟知。对一特定磷酯酶抑制蛋白质顺序，其插入位点，载体的选择、表达控制顺序是由这些因素内的平衡决定，在一给定情况下，不是所有选择都是等效的。
含与表达控制顺序有效相连的目的基因的重组DNA分子可被用于转化多种适当的宿主以使这样的宿主(转化子)表达基因或它们片段产生杂交DNA编码的多肽或多肽的部分。
多种宿主在产生本发明的抗原和DNA顺序中也是有效的。这些宿主包括，例如，细菌，如大肠杆菌、杆菌属和链霉菌属，真菌如酵母菌和动物如CHO细胞和组织培养中的植物细胞。适当宿主的选择由本技术认识到的多种因素来决定。它包括，例如与选择载体的相容性、辅产品的毒性、得到目的多肽容易性、表达特征、生物安全性和费用。从这些因素的单独一个不能作出对一个特定重组DNA分子或多肽的宿主的绝对选择。而一定取决于这些因素的平衡，对一个特定重组DNA分子的表达是不会所有的宿主都等效的。
如前所述，被引入到克隆或表达载体选择的位点的DNA顺序可包括不是为目的多肽编码的基因部分，或可仅包括蛋白质的整个基因的一段，只要求不论使用什么DNA顺序，转化的宿主都能产生实际上是含有与白树种子储藏蛋白相同功能行为的多肽或蛋白质白树种子储藏蛋白。例如，本发明的DNA顺序以相同的阅读框架被融入表达载体中的一部分DNA顺序中，此顺序分别编码至少一种真核或原核或原核载体蛋白质，或至少一种真核或原核信号顺序或这两者的结合。这种构建可有利于目的DNA顺序表达，改进宿体细胞中目的多肽的纯化或分泌和较好地成熟。DNA顺序也可包括ATG起始密码子，以单独或与其他密码子一起直接与目的多肽的第一氨基酸的密码子顺序融合。这种构建能使比如甲硫氨酰基或其他肽基多肽产生，是本发明的一部分。此N端甲硫氨酸或肽然后可用各种已知的方法在细胞内或外的切除，也可使用与甲硫氨酸或成分中其他相连的融合物配合使用的多肽和本发明的方法。
实施例合成和组装白树种子储藏蛋白基因实施例1把5′-生物素低聚核苷酸结合到抗生蛋白链菌素涂覆的乳汁微球体上。
0.2mlDYNABEADSM280抗生蛋白链菌素(Dynal公司)样品被放入1.5ml的Eppendof试管。试管对着一块磁板(AdvancedMagnetiesInc.)保持几分钟以使磁乳汁微球体被吸引到试管的一边，然后倒掉液体。这些珠(beads)用0.2ml退火缓冲液(成份下面给出)在室温洗涤2次，然后再悬浮于0.2ml退火缓冲液中。
在珠悬浮液中加入1mol的5′-生物素低聚核苷酸，30分钟之后室温下珠用0.2ml退火缓冲液洗涤2次，再悬浮于0.2ml退火缓冲液中。在洗涤中对未结合的低聚核苷酸的分光光度计分析表明约300pmol的低聚核苷酸结合在珠上。
实施例2退火/洗涤循环，重复加入每个连续的低聚核苷酸在用于基因组装前，用聚丙烯酰胺胶电泳纯化低聚核苷酸并用T4多肽激酶使5′-磷酸化。
在150pmol载体结合的低聚核苷酸中加入750pmol重叠互补的低聚核苷酸，退火在0.10ml50mM的磷酸钠缓冲液、pH7.5、1MNacl(退火缓冲液)中在45℃进行5分钟，然后混合物冷却至室温至少7分钟。然后用0.2ml同样缓冲液在室温洗涤珠两次，此循环被重复直到最后的低聚核苷酸加入。
实施例3产物连接和用限制酶消化从载体释放在组合完成后，珠被洗涤并重悬浮于0.04ml连接酶缓冲液中。加入0.005mlDNA连接酶后(NewEnglandBidabs，高活力)，混和物被在室温保温2小时，然后在0.04ml限制消化缓冲液中洗涤和再悬浮。加入10单位限制性核酸内切酶ECoRI后，混和物在37℃保温90分钟。液体被放掉，释放的DNA用乙醇沉淀并且再悬浮于0.01ml连接酶缓冲液中。
实施例4白树种子储藏蛋白基因的组装用图3和图4所描述的两种方式组合基因。低聚核苷酸顺序在图5中说明。基因5′-端组合(约500bpN-端编码区域)从载体结合的Btgell开始，且低聚核苷酸以下列次序加入(每个包括一个退火/洗涤循环)gel39，gel1，gel38，gel2，gel37，gel3，gel36，gel4，gel35，gel5，gel34，gel6，gel33，gel7，gel32，gel8，gel31，gel9，gel30，gel10，gel29，gel11，gel28，gel12，gel27。
基因3′-端的组合(约300bpC-端编码区域)从载体结合Btge12开始，且低聚核苷酸以下列次序加入gel20，gel19，gel21，gel18，gel22，gel17，gel23，gel16，gel24，gel15，gel25，gel14，gel26，gel13.
参考图3，基因的5′-端(N-端编码区域)通过限制性核酸内切酶EcoRI的消化从载体释放，并且基因的3′-端(C-端编码区域)用限制性核酸内切酶HindⅢ消化从载体释放。参考图4，在低聚核苷酸gel27和gel13中两基因片段含有互补的20个碱基，两基因片段被一起退火，然后连接形成完整的基因。
实施例5合成白树种子储藏蛋白基因的克隆按照分子克隆的标准方法，完整的DNA产品与已用EcoRI和HindⅢ酶切的M13mp19RFDNA连接实验室手册，E.F.Sambrook等人，1989。
实施例6合成的白树种子储藏蛋白基因的序列测定M13mp19中的合成基因顺序用双脱氧法测定。在克隆合成基因中发现两个突变，都在5′-端上(N-端编码区域)实施例7定点诱变校正克隆合成基因的突变进行寡聚核苷酸指导的诱变来校正白树种子储藏蛋白基因中的两种突变，在此过程后使用体外诱变试剂盒(Amersham公司)。
实施例8合成基因克隆λ表达载体用EcoRI和HindⅢ作用从M13mp19载体切下合成白树种子储藏蛋白基因，且此含基因片段用琼脂糖胶电泳纯化并被连接入EcoRI/HindⅢ解理的表达载体pkk223-3(Pharmacia)。
实施例9合成的白树种子储藏蛋白基因在大肠杆菌中的表达分析培养50ml带有合成的白树种子储藏蛋白基因的pkk223-3质粒的大肠杆菌JM105，用IPTG诱导和并裂解以得到粗抽提物，用SDS聚丙烯酰胺胶电泳分析粗提物(旁边使用不含插入片段的表达载体的宿主细胞粗提物作对照)，也进行Weskemblot分析和功能测定，以肯定蛋白质表达和活力。
总之，本发明在此揭示的实施例看来，是能够很好适于完成开始提出的目标和结果的。某些方法和装置上的变化不会离开本发明的实质和范围。应该了解变化是可能的，也应进一步知道下面权利要求中所述的任何因素和步骤是指那些相同的因素和步骤，以实际上是相同或相似的方式完成实际上是相同的结果。不管本发明的原则以何种形式利用，都认为是广义覆盖了本发明。所以，本发明能很好适应于完成提到的目的、结果和优点以及其它固有的东西。
顺序编号1的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度783基对(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构不详(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅲ)假想的是(ⅵ)最初来源(A)有机物多叶白树(GeloninMultiforum)(D)发育阶段种子(F)组织类型核
(Xj)顺序描写顺序编号权利要求
1.一种编码白树种子储藏蛋白的合成基因的生产方法，其特征在于，包括下列步骤设计含编码白树种子储藏蛋白的顺序的第-DNA片段，所述的顺序在白树种子储藏蛋白顺序中含有每种氨基酸所对应的三联密码子，所述的三联密码子是从一组能最大表达编码各种氨基酸的三联密码子中选出的，操作并固定DNA片段于表达载体中，合成所述的第-DNA片段。合成所述第-DNA片段的互补DNA片段；且通过对所述第-DNA片段和互补DNA片段退火形成DNA双链。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的合成步骤包括把所述DNA片段分成一组低聚核苷酸单链重叠片段，所述片段被化学地合成，纯化所述的低聚核苷酸;在5'端磷酸化所述的低聚核苷酸;并对核苷酸链一起退火。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于旁侧顺序是与所述双链DNA连在一起的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括向所述合成基因或旁侧顺序中引入限制性核酸内切酶识别位。
5.如权利要求1所述的把合成基因克隆入表达载体的方法，其特征在于包括下列步骤(a)酶切编码基因的双链DNA基因成线性双链状态;(b)用限制性内切酶酶切表达载体;(c)把所述含基因的线性双链DNA与所述表达载体连接在一起;并(d)把步骤(c)的DNA转入表达宿主中。
6.如权利要求5所述方法的产品。
7.如权利要求1所述的表达基因的方法，其特征在于包括下列步骤(a)把基因克隆入表达载体;(b)在诱导基因产物合成适当数量的条件下，培养含被克隆λ表达载体的基因的宿主细胞;(c)纯化来自于所述细胞的基因产品。
8.一种免疫毒素，其特征在于包括(a)是权利要求7方法生产的产品;且(b)结合于所述产品的抗体。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于进一步包括用SDS胶电泳、Western blot分析，活性检测或其他适当手段检测基因产物的方法。
10.权利要求7方法的产品。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在适当细菌宿主中表达的三联密码子。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于所述宿主是大肠杆菌。
13.如权利要求11所述的方法的产品。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在适当真菌宿主中表达的三联密码子。
15.如权利要求14所述的方法的产品
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于所述的宿主是酵母。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在哺乳细胞中表达的密码子。
18.如权利要求17所述的方法的产品。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于选择提供在昆虫细胞中的表达的密码子。
20.如权利要求19所述的方法的产品。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于选择能在植物细胞中表达的密码子。
22.如权利要求21所述的方法的产品。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所有的低聚核苷酸在一个反应混和物中一起退火来组装基因。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，低聚核苷酸分批退火，随后这些被一起退火并一起连接形成完整的基因。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于白树种子储藏蛋白基因由含有下列步骤的固相组合方法构建a.把一合成低聚核苷酸在或靠近它的一端处与固相载体物质结合;b.冲洗掉多余的非结合的低聚核苷酸;c.加入(摩尔过量低聚核苷酸，此低聚核苷酸与结合于载体上的低聚核苷酸，在其全部或部分长度上，碱基顺序完全互补，并把链一起退火产生双链DNA结构，然后冲洗掉过量的非结合的低聚核苷酸;d.重复步骤C直到整个基因组成;e.用DNA连接酶处理组成的基因以形成完整的双链DNA;并f.用限制性核酸内切酶或其他适当的方法使合成基因从载体中释放。
26.合成的DNA含有编码蛋白质白树种子储藏蛋白或多肽的核苷酸顺序，此蛋白质白树种子储藏蛋白或多肽抑制细胞蛋白质的合成但不与细胞表面受体结合。
27.如权利要求26所述的合成DNA，其特征在于，所述的核苷酸顺序是顺序编号1和片段及其衍生物。
28.如权利要求27所述的合成DNA顺序，其特征在于所述的DNA顺序抑制细胞蛋白质的合成，但不与细胞表面受体结合。
29.一种含有权利要求26或27的DNA的表达载体。
30.如权利要求29所述的载体，其特征在于所述的载体是pkk223-3。
31.如权利要求29所述的载体，其特征在于所述载体是pkc30或它的一种衍生物。
32.一种含有并且能表达权利要求26或27的重组DNA分子的宿主细胞。
33.如权利要求32所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是从细菌、真菌、昆虫细胞、动物和植物宿主中选出的。
34.如权利要求32所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是选自大肠杆菌、假单胞菌、杆菌和酵母。
35.如权利要求32所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是选自大鼠、猪和人组织细胞。
36.如权利要求34所述的宿主，其特征在于，大肠杆菌是JM105大肠杆菌。
37.如权利要求27所述的合成DNA，其特征在于所述的DNA顺序与表达控制顺序有效连接。
38.如权利要求37所述的合成DNA，其特征在于所述的表达控制顺序控制原核生物细胞、真核生物细胞或它们的病毒的基因的表达。
39.如权利要求37所述的合成DNA，其特征在于所述的表达控制顺序是选自早期SV40启动子、晚期SV40启动子、loc系统、TAC系统、TRC系统、TRP系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外被蛋白质控制区域和它们的组合体。
40.如权利要求27所述的合成DNA，其特征在于进一步包括把所述的基因与编码多肽区域的DNA顺序融合，此多肽区域与在所选的靶细胞上的细胞表面受体特殊地结合。
41.如权利要求26所述的生产合成DNA顺序的方法，其特征在于包括下列步骤a.设计含与初级氨基酸顺序相应的三联密码子顺序的双链DNA片段，此最初氨基酸顺序是由纯化白树种子储藏蛋白蛋白确定的，这样就使所述的DNA顺序具有有利于基因的合成、克隆、表达、功能或生物化学操作的特点;b.设计、合成、纯化、5′-磷酸化一系列能连接在一起形成合成基因的低聚核苷酸;c.将低聚核苷酸退火和连接在一起，组成合成基因。
42.一种生产权利要求27所述顺序编号1的合成DNA顺序和片段及其衍生物的方法，其特征在于包括a.设计与由纯化白树种子储藏蛋白蛋白质确定的初级氨基酸顺序相对应的含三联密码子顺序的双链DNA片段，使所述的DNA顺序具有有利于基因的合成、克隆、表达、功能或生物化学操作的特点;b.设计、合成、净化、5′-磷酸化一系列能连接在一起组成基因的合成低聚核苷酸;c.低聚核苷酸退火和组成合成基因。
43.一种免疫毒素，其特征在于包括(a)权利要求42所述方法的产品和(b)与所述产品结合的抗体。
44.一种编码白树种子储藏蛋白的合成基因的生产、克隆并表达方法，其特征在于，包括下列步骤a.设计与由纯化白树种子储藏蛋白蛋白质确定的最初氨基酸顺序对应的含三联密码子顺序的双链DNA片段，使所述的DNA顺序具有有利于基因的合成、克隆、表达、官能或生物化学操作的特点;b.设计、合成、净化、5′-磷酸化一系列能连接在一起组成合成基因的合成低聚核苷酸;c.将低聚核苷酸退火并连接在一起以组成合成基因;d.使合成基因与适当的克隆载体连接在一起;e.确定克隆基因的核苷酸顺序以证实基因的正确性;f.进行定点诱变以校正克隆基因中任何不希望的突变;g.把基因亚克隆入一适当的表达载体中;h.把含合成白树种子储藏蛋白基因的表达载体引入适当的表达宿主;i.在适于生产白树种子储藏蛋白产品的条件下，培养带有白树种子储藏蛋白表达载体的表达宿主;j.从表达基因的细胞分离和纯化白树种子储藏蛋白。
45.一种免疫毒素，其特征在于包含a.权利要求44方法的产品;和b.与所述产品结合的抗体。
46.一种验证权利要求1的组合和克隆基因精确性的方法，其特征在于，进一步包括下列步骤(a)分离含有权利要求1基因的载体DNA;(b)对含基因的载体DNA测序;并(c)用大量克隆重复步骤a和b直到鉴定出含所希望的DNA顺序的克隆。
47.一种校正在权利要求1的克隆基因中出现的用定点诱变校正突变的方法，其特征在于进一步包括下列步骤(a)酶切所述突变基因的DNA;(b)将含突变的DNA链与合成的校正后的低聚核苷酸的引物退火连接，该引物所述的突变位点并含有正确的DNA顺序。(c)用DNA聚合酶延伸通过退火连接于所述含突变的模板链上的校正低聚核苷酸引物。(d)通过转染或转化把步骤C的DNA产品引入适当的宿主细胞中;(e)分离载体DNA;并且(f)把校正后的基因亚克隆入表达载体。
全文摘要
本发明提供了植物毒素白树种子储藏蛋白的合成基因的核苷酸顺序和生产，克隆和表达此合成基因的方法。白树种子储藏蛋白合成基因的DNA顺序在顺序编号1中示出。本发明也提供了含白树种子储藏蛋白DNA顺序的表达载体和用这些载体转化后的细胞。另外，一种含有抗体的免疫毒素也被结合入蛋白质白树种子储藏蛋白。
文档编号C07K14/415GK1070227SQ9211010
公开日1993年3月24日 申请日期1992年9月4日 优先权日1991年9月6日
发明者迈克尔G·罗森布拉姆, 肯尼思L·贝蒂 申请人:研究发展基金会