具有提高的发酵大豆粉产率的杆菌属菌株及使用该菌株生产发酵大豆粉的方法与流程

本发明涉及具有提高的发酵大豆粉(fermented soybean meal)产率的新的杆菌属菌株和使用该菌株生产发酵大豆粉的方法。更具体地，本发明涉及具有提高的发酵大豆粉产率的新的解淀粉芽孢杆菌(淀粉液化芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens)菌株，该解淀粉芽孢杆菌菌株在抗营养因子的移除和蛋白酶活性方面是极佳的，并且呈现针对病原体的高抗微生物活性和发酵期间减低的粘性物质产率；使用该菌株生产发酵大豆粉的方法；由该方法生产的发酵大豆粉；以及包括发酵大豆粉的饲料组合物。

背景技术：

因为疾病诸如对人类致命的牛海绵状脑病经证明是由于向饲料添加的动物蛋白质组分引起的，所以存在用植物蛋白质替换添加至饲料中的动物蛋白质的快速全球趋势。

脱脂大豆粉(在下文称为“大豆粉”)是作为动物蛋白质诸如鱼粉、肉骨粉或血浆的替代品用于饲料市场的植物蛋白质的最普遍来源。大豆粉亦称为豆油粕(豆油饼，soybean oil cake)，其为由豆油提取产生的固体副产物。在韩国，用作植物蛋白质来源的大豆粉占总粉料供应的60％，每年达2百万吨(韩国饲料配料协会(Korea Feed Ingredients Association)，2004)。

大豆粉含有基于干重的按重量计55～56％的蛋白质、按重量计13～14％的可溶性碳水化合物和按重量计21～22％的不溶性碳水化合物。另外，大豆粉含有按重量计约1％的粗脂肪和按重量计约4～6％的石灰(In-Kyu Han,植物蛋白质饲料，食品加工，Sun-Jin Publishing Co.,67-107,1998)。

同时，大豆粉含有各种抗营养因子(ANF)，其可在用作饲料时有问题地损害消化率(Li等人，J.Anim.Sci,.68：1790,1990)。在抗营养因子中，胰蛋白酶抑制剂(TI)为代表性的，并且在陆生动物中，已知膳食性TI干扰胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的适当酶促功能，导致总蛋白质的可利用性的减小。具体地，因为这些抗营养因子大大地影响幼年牲畜，所以大豆粉在用于幼年牲畜的饲料中的使用受到限制。另外，红细胞凝集物质、血凝素、在牲畜中引起腹泻及腹痛的寡糖，诸如棉子糖、水苏糖等，或抑制营养吸收的多糖是已知的。其中一些通过热处理被破坏。然而，在此过程期间，大豆蛋白质变性并且因此其溶解度降低，并且必需蛋白质诸如赖氨酸等可遭破坏。最近，为了大豆蛋白质的更有效使用，已开发了通过除去抗营养因子增加功效的加工方法。

当前加工的大豆产品——诸如大豆蛋白质浓缩物、分离的大豆蛋白质、或水解的大豆蛋白质通常通过化学处理或酶促处理来生产。然而，化学加工方法是昂贵的，并且引起降低蛋白质溶解度的问题，因为蛋白质的变性或可溶性氨基酸的损失由于在生产过程期间的热处理、化学处理或加热干燥而发生。由于此原因，在化学加工方法期间进行热处理，但没有引起广泛的蛋白质变性，并且因此，抗营养因子、胰蛋白酶抑制剂显著地存在于大豆磨粉(soybean mill)中。

作为用于解决化学加工方法的问题的手段，已开发了通过使用杆菌细菌或真菌的生物学加工方法来制备的发酵大豆粉产品(韩国专利第10-0645284号、第10-0459240号及第10-0925173号)。此发酵处理加工方法用于去除多种抗营养因子，以及使蛋白质或碳水化合物在发酵过程期间降解成可消化的低分子形式，进而生产在消化率和吸收率方面极佳的用于饲料的高质量蛋白质材料。

然而，固态发酵通常用于发酵处理加工方法中，并且固态发酵具有这样的缺点：连续地供应空气以维持需氧条件，和去除发酵过程期间产生的发酵热量。另外，发酵处理加工方法需要48小时或更长的长发酵时间用以去除高于最佳水平的抗营养因子。这样的长发酵时间减少发酵罐之转换率，并且引起总生产成本的增加。

因此，本发明人已开发出通过使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TP6菌株(KFCC11343P，登陆号KCCM11438P)的固态发酵来生产发酵大豆粉的方法，该枯草芽孢杆菌TP6菌株具有发酵大豆粉的生产所需的极佳特性，以便在发酵大豆粉的生产期间显著地缩短发酵时间(韩国专利公开第10-2011-0027535号)。通过此方法，通过使用在抗营养因子的移除及蛋白酶活性方面极佳的枯草芽孢杆菌TP6菌株，可甚至以较短发酵时间生产出质量相当于或高于常规的发酵大豆粉之发酵大豆粉。

然而，此方法是有问题的，原因在于：枯草芽孢杆菌TP6菌株具有低的抑制病原体增殖的能力，并且因此病原体亦在发酵期间，当大豆粉在发酵期间被大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌(Salmonella)污染时增殖。

因此，本发明人已做出大量努力来选择具有有助于大豆粉的固态发酵的改进特性的发酵菌株。因此，发明人已开发出解淀粉芽孢杆菌K2G菌株，其在抗营养因子的去除、蛋白酶活性和针对病原体的抗微生物活性方面是极佳的，并且在发酵期间具有降低的粘性物质产率。另外，本发明人发现当菌株用于进行大豆粉的固态发酵时，具有提高的消化率和吸收率及饲料功效的高质量发酵大豆粉可由于以下原因甚至相较于常规方法的短发酵时间而得以生产：通过大豆蛋白质水解的低分子化和粗蛋白质的含量增加、胰蛋白酶抑制剂的失活、或抗营养因子诸如非消化性多糖的含量减少，进而完成本发明。

公开内容

技术问题

本发明的目标为提供具有提高的发酵大豆粉产率的新的解淀粉芽孢杆菌菌株。

本发明的另一目标为提供通过使用解淀粉芽孢杆菌菌株的固态发酵生产发酵大豆粉的方法。

本发明的又一目标为提供通过该方法生产的发酵大豆粉。

本发明的又一目标为提供包括发酵大豆粉的饲料组合物。

技术方案

在用于实现上述目标的一个方面，本发明提供用于通过固态发酵生产发酵大豆粉的新的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株(KCCM11471P)。

根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的特征在于，其在抗营养因子的去除活性、蛋白酶活性及针对病原体的抗微生物活性方面是极佳的，并且在发酵期间具有降低的粘性物质产率，由此，通过固体发酵生产高质量发酵大豆粉。

具体地，根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株产生具有强活性的蛋白酶，以便钝化各种多糖抗营养因子，诸如抑制大豆粉消化的胰蛋白酶抑制剂(TI)，并且将高分子量大豆蛋白质水解成低分子量蛋白质，进而显著地提高发酵大豆粉的消化率和吸收率。

另外，当根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株通过利用大豆粉的组分中的碳水化合物生长时，其将碳水化合物转化成构成细胞的蛋白质。因此，发酵大豆粉中粗蛋白质的相对含量增加，此为高质量饲料生产中的重要因素。

在一个优选实施方式中，本发明人从各种传统发酵食品中分离了14种具有极佳蛋白酶产率的菌株，以便选择可用于通过固态发酵生产发酵大豆粉的发酵菌株(参见表1)。

从分离的14种菌株，选择CJ823菌株，其中该菌株显示针对大肠杆菌和沙门氏菌的最佳抗微生物活性，大肠杆菌和沙门氏菌是在牲畜中引起食物中毒的代表性病原体。

与枯草芽孢杆菌TP6菌株(KFCC 11343P；韩国专利公开第10-2011-0027535号)相比，选择的CJ823菌株显示针对大肠杆菌和沙门氏菌的明显极佳的抗微生物活性，该枯草芽孢杆菌TP6菌株已用作通过固态发酵的发酵大豆粉常规生产方法中的发酵菌株(参见表2)。

另外，据确认，CJ823菌株在实际发酵过程期间有效地抑制沙门氏菌的生长，并且因此适合于高质量发酵大豆粉的生产(参见表3)。

因而，CJ823菌株产生高浓度的蛋白酶并且显示针对病原体的极佳抗微生物活性，但产生粘着的粘性物质，这是由于通过在发酵过程期间产生的酶而衍生自未加工大豆的糖和蛋白质的左聚糖(levan)形式的果聚糖和聚谷氨酸的聚合。粘性物质的产生可在发酵过程的控制和发酵大豆粉大量生产后的发酵产品的转移方面引起问题。

因此，本发明人引起CJ823菌株中的UV诱导突变，以便开发具有降低的粘性物质产率同时维持其自身酶促/生理特性的突变体菌株(参见图3)。

首先，使CJ823菌株暴露于254nm UV，并且随后根据菌落形状和由于含脱脂乳的选择培养基中粘性物质产生导致的亮区的形成，选择16种突变体菌株。使选择的16种突变体菌株经受固态培养，并且随后分析蛋白酶活性和γ-PGA(聚-γ-谷氨酸)含量以最终选择显示最高蛋白酶活性和相对低γ-PGAA含量的U304突变体菌株(参见表4)。

对于最终选择的U304突变体菌株的鉴定，主要分析其糖同化作用。结果，发现就生物化学特性而言，U304突变体菌株具有与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌98％的相似性(参见表5)。

另外，16S rRNA序列分析的结果显示U304突变体菌株具有SEQ ID NO.1的16S rRNA序列。基于此序列，分析此菌株与已知菌株之间的序列同源性及系统发生关系。因此，U304突变体菌株显示与解淀粉芽孢杆菌99.92％的相似性，和在系统树中与解淀粉芽孢杆菌的最高系统发生关系(参见表5)。

当将生物化学特性、序列同源性和系统发生关系整合在一起(taken together)时，根据本发明的U304突变体菌株被定名为解淀粉芽孢杆菌K2G。

根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株是改良菌株，其通过明显地降低聚合物诸如聚-γ-谷氨酸的产量而具有降低的粘性物质产率，同时保持亲本菌株的特性，包括高蛋白酶产率和针对病原体诸如大肠杆菌或沙门氏菌的极佳抗微生物活性。因此，其可以非常有效地用于通过固态发酵生产发酵大豆粉。

为确认有效性，检查了通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的固态发酵的粗蛋白质含量的变化。结果，发现通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株发酵的大豆粉显示在24小时发酵之后，粗蛋白质含量相当于或高于通过枯草芽孢杆菌TP6菌株发酵的大豆粉(参见表6)，该枯草芽孢杆菌TP6菌株已知为常规大豆粉发酵菌株。

另外，检查了通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的发酵的大豆粉中胰蛋白酶抑制剂(TI)含量的变化。结果，发现通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株发酵16小时的大豆粉中的TI含量相当于通过枯草芽孢杆菌TP6菌株发酵24小时的大豆粉中的TI含量，暗示抗营养因子的减少可通过仅16小时发酵以相当水平实现(参见表7)。

这些结果表明相较于常规菌株，在通过固态发酵生产发酵大豆粉之后，根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株能够经过短的发酵时间来生产发酵大豆粉，该发酵大豆粉具有作为高质量蛋白质饲料的高含量的粗蛋白质和低含量的抗营养因子。本发明在以下方面是极佳的：减少的发酵时间增加发酵罐的转变率以增加每年可生产的批料的数量，并且因此可以较低成本向消费者提供高质量发酵大豆粉。

因此，本发明人根据布达佩斯条约以登录号KCCM11471P于2013年11月7日将解淀粉芽孢杆菌K2G菌株保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)，该解淀粉芽孢杆菌K2G菌株在抗营养因子的去除活性、蛋白酶活性和针对病原体的抗微生物活性方面是极佳的，并且具有降低的粘性物质产率以便用于通过固态发酵生产高质量发酵大豆粉。

在另一方面，本发明提供通过使用解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的固态发酵生产发酵大豆粉的方法。

具体地，根据本发明的制备方法的特征为包括以下步骤：

a)添加水至大豆粉以进行热处理；

b)冷却经热处理的大豆粉，并且随后将解淀粉芽孢杆菌K2G菌株接种于其中；和

c)通过接种于大豆粉中的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的固态培养获取发酵大豆粉。

步骤a)是添加水至作为原料的大豆粉以进行热处理的步骤。在固态发酵之前，将适量的水直接喷洒于未加工的大豆粉上，并且将其混合以控制水分含量，接着进行热处理持续预定时间。

根据本发明的一个优选实施例，步骤a)中的水被添加以便大豆粉中的水含量为30％至80％(v/w)、更优选30％至70％(v/w)，并且更优选40％至60％(v/w)。具有在以上范围内的水含量的大豆粉就以下方面而言是优选的：防止由于低水分的发酵延迟、大豆粉的转移和发酵之后的干燥方法所需的高成本的节省(改进，improvement)、和加热效率。

随后，添加水的大豆粉经受热处理。进行热处理用于以下目的：杀死未加工大豆粉中的各种微生物(germ)、大豆细胞壁的破坏、和蛋白质的变性，进而提供用于期望微生物的积极(活性，active)生长的环境。热处理方法可通过本领域中已知的各种方法来进行，但优选使用蒸汽或过热蒸汽。

根据本发明的优选实施方式，步骤a)的热处理使用70℃至130℃的蒸汽进行10分钟至60分钟，或使用200℃至300℃的过热蒸汽进行数秒至数分钟的短时间，更优选70℃至130℃的蒸汽进行10分钟至30分钟，并且最优选80℃至121.1℃的蒸汽进行10分钟至30分钟。

若热处理的温度低或处理时间短，则存在的问题是对各种微生物的灭菌效应不足，或后续发酵过程进行不顺利。若热处理的温度高或处理时间长，则在大豆粉中发生蛋白质变性，从而减小消化率，导致最终产物的质量的劣化。因此，优选的是采用在可接受范围内的热处理温度和时间来避免这些问题。

通过热处理，可预期的是：存在于大豆粉中的污染物几乎全部被除去，形成适于后续固态发酵的化学环境，并且抗营养因子诸如抑制消化率的胰蛋白酶抑制剂(TI)轻微减少。

步骤b)是冷却经热处理的大豆粉至适于固态发酵的温度，并且随后将解淀粉芽孢杆菌K2G菌株接种于其中的步骤。在本发明中，大豆粉的冷却通常在热处理之后进行，其中冷却方法可通过使用冷却运输机的转移方法来容易地进行，以便防止过热和通过增加冷却速率均匀地冷却。

根据本发明的优选实施方式，步骤b)中的大豆粉被冷却至30℃至50℃、更优选35℃至45℃，并且更优选37℃。

在冷却经热处理的大豆粉之后，优选的是照原样或通过用灭菌水稀释将根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的预培养基均匀地接种于所制备的大豆粉培养基中。

接种于经热处理的大豆粉中的发酵菌株的数量是影响大豆粉的固态发酵的重要因素。在接种于经热处理的大豆粉中之后即刻的发酵菌株的数量优选为1×10⁵至1×10⁹CFU/g。

若接种量小于1×10⁵CFU/g，则需要少量的种子发酵培养液，而存在的缺点在于需要很多时间用于大豆粉的发酵，增加了生产所需的发酵时间和污染的可能性。相比之下，若接种量大于1×10⁹CFU/g，则发酵时间可相当大地减少，而存在的缺点在于用于接种的种子微生物的生产成为困扰的问题。具体地，因为发酵效能很大地受发酵菌株的生长特性及发酵罐的类型的影响，所以优选的是考虑生产步骤中的菌株的特性来适当地决定接种量。

步骤c)是通过接种于大豆粉中的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株的固态发酵来获取发酵大豆粉的步骤。例如，发酵使用填充床发酵罐来进行。

填充床发酵罐被分成各种类型，诸如分批、封闭和连续搅拌釜反应器。本发明的方法不限于其中任一种，只要其对大豆粉的固态发酵是有用的。优选地，其可根据生产规模来选择。

根据本发明的优选实施方式，将解淀粉芽孢杆菌K2G菌株接种的大豆粉以5cm至50cm的厚度应用于填充床发酵罐，并且在20℃至50℃发酵12小时至72小时。此时，优选的是大豆粉填充床较厚，并且在30℃至45℃进行发酵12小时至48小时。最优选地，发酵在37℃进行24小时。

本发明的方法可进一步包括以下步骤：在步骤c)之后，在低的温度及湿度下干燥和粉碎发酵大豆粉。

大豆粉中的水在发酵过程期间部分地蒸发，但在发酵之后即刻的残余水含量相当地高达20％至50％(v/w)。然而，发酵大豆粉产物的优选最终水含量为10％至12％(v/w)，并且因此需要干燥过程。

当使用根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株进行固态发酵时，发酵大豆粉处于非常好的条件，但轻微形成团聚物(conglomerate)。因此，在干燥过程之后，需要粉碎发酵大豆粉的过程以形成均匀粒度。

干燥及粉碎过程可通过本领域中已知的各种方法来进行。然而，当干燥过程在高温下过度进行时，可杀死发酵大豆粉中的大量活细菌，并且因此应小心地进行。优选地，干燥过程在低温下进行而不杀死活细菌。最优选地，干燥过程在低的温度和湿度下用热空气进行。在粉碎方法中，可根据使用目的并且优选地通过锤磨机将发酵大豆粉磨碎至各种尺寸。

当根据本发明的上述方法使用解淀粉芽孢杆菌K2G菌株进行大豆粉的固态发酵时，大豆粉中包括TI在内的多种抗营养因子减少，消化率和吸收率通过蛋白质的水解和低分子化而提高，并且粗蛋白质的含量亦增加，进而提高作为饲料的绝对价值。因此，作为成为动物蛋白质的替代物的高质量蛋白质饲料材料，其具有高价值。

仍在另一方面，本发明提供饲料组合物，其包括通过以上方法生产的发酵大豆粉。

根据本发明的饲料组合物中发酵大豆粉的含量可根据待应用的牲畜的种类和年龄、应用形式、期望效果等来适当地控制。例如，含量可为按重量计1％至99％、优选按重量计10％至90％，并且更优选按重量计20％至80％，但不限于此。

对于施用，本发明的饲料组合物除发酵大豆粉之外可进一步包括以下一种或多种的混合物：有机酸，诸如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸等；磷酸盐，诸如磷酸钾、磷酸钠、多磷酸盐等；天然抗氧化剂，诸如多酚、儿茶酸、生育酚、维生素C、绿茶提取物、脱乙酰壳多糖、单宁酸等。必要时，可添加其它的典型添加剂，诸如抗流行性感冒剂、缓冲剂、抑菌剂等。另外，可另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂来将组合物配制成可注射制剂诸如水溶液、悬浮液、乳液等；胶囊；颗粒或片剂。

另外，除了主要成分——包括植物蛋白质饲料诸如粉碎或破碎的小麦、大麦、玉米等；动物蛋白质饲料诸如血粉、肉粉、鱼粉等；动物脂肪和植物油——之外，本发明的饲料组合物可与以下一起使用：各种助剂，诸如氨基酸、无机盐、维生素、抗氧化剂、抗真菌剂、抗微生物剂等；营养补充物；生长加速剂；消化-吸收加速剂；以及预防剂。

当本发明的饲料组合物用作饲料添加剂时，饲料组合物可根据典型方法原样添加或与其它组分一起使用。饲料组合物可以速释制剂或缓释制剂的施用形式与无毒性药学上可接受的载体组合制备。食用载体可为玉米淀粉、乳糖、蔗糖或丙二醇。固体载体可以是片剂、粉末、锭剂等施用形式，和液体载剂可以是糖浆、液体悬浮液、乳剂、溶液等施用形式。另外，施用剂可包括防腐剂、润滑剂、溶解加速剂或稳定剂、用于改善炎性疾病的其它剂和对预防病毒有用的物质。

本发明的饲料组合物可应用于动物的膳食，即，应用于包括哺乳动物、家禽、鱼类和甲壳动物的许多动物的饲料中。其可用于商业上重要的哺乳动物，诸如猪、牛、山羊等；动物园动物，诸如大象、骆驼等；牲畜，诸如犬、猫等。商业上重要的家禽可包括鸡、鸭、鹅等，并且商业养殖的鱼类和甲壳动物，诸如鳟鱼和虾类也可被包括。

根据本发明的饲料组合物可以基于牲畜饲料的干重计，以每1kg大约10g至500g、优选10g至100g的量进行混合。在完全混合之后，饲料组合物可作为粉料(mash)提供，或可优选进一步经受造粒、粗放化(extensification)或挤出过程。

有益效果

根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株(KCCM11471P)在抗营养因子的去除活性、蛋白酶活性和针对病原体的抗微生物活性方面是极佳的，并且在发酵期间具有降低的黏性物质产率。因此，当菌株用作种子微生物进行大豆粉的固态发酵时，具有提高的消化率和吸收率及饲料功效的高质量发酵大豆粉可由于以下原因得以生产：通过大豆蛋白质的水解的低分子化、和粗蛋白质的含量增加、胰蛋白酶抑制剂的钝化、或抗营养因子诸如非消化性多糖的含量减少。

附图简述

图1显示用于选择根据本发明的具有高蛋白酶产率的菌株的实施例1的结果；

图2显示测量实施例1中选择的具有高蛋白酶产率的菌株针对大肠杆菌和沙门氏菌的生长抑制活性的结果；

图3显示从根据本发明的具有高蛋白酶产率的菌株选择具有降低的粘性物质产率的突变体菌株的流程图；

图4显示在根据本发明的突变体菌株的选择过程期间用于γ-PGA含量的定性分析的浓度-梯度SDS-PAGE的结果，其中：

泳道M：分子量标记

泳道1：1g/L γ-PGA标准

泳道2：0.5g/L γ-PGA标准

泳道3：0.25g/L γ-PGA标准

泳道4：CJ823菌株

泳道5：U304突变体菌株

泳道6：U305突变体菌株

泳道7：U306突变体菌株

泳道8：U307突变体菌株；

图5为显示根据以上程序选择的突变体菌株解淀粉芽孢杆菌K2G的系统发生关系的系统树；和

图6显示针对通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G的固态发酵获得的发酵大豆粉的水解度的SDS-PAGE结果，

泳道M：分子量标记

泳道1：原料(未加工大豆粉)

泳道2：TP6发酵20小时

泳道3：K2G发酵16小时

泳道4：K2G发酵20小时。

实施例

下文中，本发明将参考实施例来更详细描述。然而，对于本发明所属技术领域的技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明性目的，并且不意欲通过这些实施例限制本发明的范围。

实施例1：具有高蛋白酶产率的菌株的选择

为分离具有极佳蛋白酶产率的菌株，本发明人从各种传统发酵食品(韩国泡菜、发酵大豆瓣酱、传统民俗酒、咸鱼等)分离了大约3000种微生物，并且它们中的大约1300种饲料可接受(韩国饲料成分协会，益生菌)杆菌菌株被鉴定。从这些菌株中，意欲发现具有高蛋白酶表达、抗微生物活性和快速生长率的多功能菌株。

具体地，具有高蛋白酶产率的菌株的选择通过比较亮区的大小来进行，该亮区由于含2％(w/v)脱脂乳(Difco,USA)YM琼脂平板(酵母提取物3.0g、麦芽汁3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂20.0g)上基质的降解而形成(图1)。

将由此选择的具有高蛋白酶产率的菌株分别接种于TSB培养基(酪蛋白的酶促消化物17.0g、大豆粉的酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g，最终pH：25℃下7.3±0.2)中，接着在37℃和200rpm下培养12小时。将各自1.0μl培养液点滴于含脱脂乳YM琼脂平板上。在37℃下将琼脂平板温育16小时，并且测量平板上形成的亮区的直径。

此时，将已在用于通过固态发酵生产发酵大豆粉的常规方法中用作发酵菌株的枯草芽孢杆菌TP6(KFCC 11343P)用作对照组(韩国专利公开第10-2011-0027535号)。

表1

如表1所示，选择14种菌株作为具有高蛋白酶产率的菌株，并且其全部显示比枯草芽孢杆菌TP6高的蛋白酶活性。

实施例2：对病原体增殖具有抑制活性的菌株的分离

为了分离能够抑制作为在牲畜中引起食物中毒的代表性病原体的大肠杆菌和沙门氏菌的生长或增殖的菌株，和通过将菌株应用在发酵大豆粉的生产中来开发无沙门氏菌无毒产物，使实施例1中分离的14种具有高蛋白酶产率的菌株经受针对病原体的抗微生物活性的测量。

针对病原体的抗微生物活性通过对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhymurium)(ATCC14028)和大肠杆菌(KCCM11835)的菌苔斑点试验(spot-on-the-lawn test)进行测量。

具体地，将14种具有高蛋白酶产率的菌株分别接种于GYP培养基(葡萄糖10.0g、酵母提取物8.0g、多蛋白胨2.0g，pH 7.0)中，接着在37℃和180rpm下液体培养12小时。将各自1.5μl具有高蛋白酶产率的菌株的培养液点滴(spotted)于GYP琼脂平板(葡萄糖10.0g、酵母提取物8.0g、多蛋白胨2.0g、琼脂15.0g，pH 7.0)上，向该GYP琼脂平板各自添加1×10⁵CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028和大肠杆菌ATCC11835，接着在37℃下静置培养15小时。检查形成于点滴在平板上的具有高蛋白酶产率的菌株的菌落周围的抑制带的大小，以测定活性效价。结果显示在下述表2中。此时，枯草芽孢杆菌TP6用作对照组。

表2

在表2中，‘-’或‘+’为基于活细菌的抑制带的直径来测定活性效价，并且‘-’表明无抗微生物或抗微生物活性，‘+’表明抑制带的直径为10.05mm或更小，‘++’表明抑制带的直径为10.05mm至14.05mm，‘+++’表明抑制带的直径为14.05mm至17.05mm，并且‘++++’表明抑制带的直径为17.05mm或更大。

检查14种具有高蛋白酶产率的菌株针对作为牲畜中胃肠疾病的最普遍病因的沙门氏菌和大肠杆菌的抗微生物谱。结果，CJ823显示最佳抗微生物能力。相较于对照组枯草芽孢杆菌TP6，所选择的CJ823显示针对大肠杆菌(++++对+)和沙门氏菌(++++对++)的明显高的抗微生物活性。

实施例3：对沙门氏菌增殖抑制的大豆粉的应用的试验

根据实施例2的结果，琼脂平板上的CJ823显示针对沙门氏菌的极佳的抗微生物活性。然而，进行以下实验以便确认菌株是否也在大豆粉的实际发酵期间展现针对沙门氏菌的增殖抑制能力。

具体地，将CJ823和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028分别以4.5×10⁷CFU/g和1.0×10³CFU/g的密度接种于大豆粉(45％的水分含量)中，该大豆粉在100℃下蒸汽处理30分钟，并且检查在37℃和恒定湿度下24小时的细胞数量的变化。此时，将鼠伤寒沙门氏菌单独接种于大豆粉中，其用作对照组。将鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌TP6的混合物接种于大豆粉中，其用作比较组。

将菌株接种，并且在发酵之前和发酵12、16及20小时之后取出预定量的大豆粉。将大豆粉稀释在0.8％NaCl无菌溶液中，并且随后将其各自以100μl涂布于XLD琼脂平板(酵母提取物3g、乳糖7.5g、蔗糖7.5g、木糖3.5g、L-赖氨酸5g、柠檬酸铁铵0.8g、酚红0.08g、NaCl 5g、脱氧胆酸钠2.5g、硫代硫酸钠6.8g、琼脂13.5g，最终pH：25℃下7.4±0.2)以计数鼠伤寒沙门氏菌菌落的数量，结果显示在以下表3中。

假设鼠伤寒沙门氏菌污染发生在蒸汽处理过的大豆粉中主要发酵菌株CJ823的增殖期间，测量两种菌株之间的比。实际污染比率可依据发酵大豆粉的生产的环境条件而不同。

表3

如表3所示，在仅利用鼠伤寒沙门氏菌接种的对照组中，随着培养时间增加，细菌的数量在20小时发酵之后稳定增加至3.1×10⁷CFU/g。相比之下，在用具有枯草芽孢杆菌TP6的混合物接种的比较组中，鼠伤寒沙门氏菌的数量被抑制到2.2×10⁴CFU/g。在用具有根据本发明的CJ823的混合物接种的实验组中，鼠伤寒沙门氏菌的数量被进一步减小至3.5×10²CFU/g。

这些结果表明根据本发明的CJ823在实际发酵过程期间有效地抑制沙门氏菌的生长，并且因此其适合于高质量发酵大豆粉的生产。

实施例4：突变体菌株的选择

实施例1至3中选择的CJ823产生高浓度的蛋白酶并且显示针对病原体的极佳的抗微生物活性，但产生粘着的粘性物质，这是由于通过在发酵过程期间产生的酶而衍生自未加工大豆的糖和蛋白质的左聚糖形式的果聚糖和聚谷氨酸的聚合。在大规模工业方法中粘性物质的过量产生阻碍搅拌，并且存在对发酵产物中的溶解氧和温度及转移的控制的困难。

因此，本发明人如下在CJ823菌株中引起UV诱导的突变，以便开发具有降低的粘性物质产率同时保持或改善其自身酶促/生理特性的突变体菌株。突变体菌株的选择过程如图3所示。

首先，将CJ823涂布于TSB琼脂平板(酪蛋白的酶促消化物17.0g、大豆粉的酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂15.0g，最终pH：25℃下7.3±0.2)中，并且在37℃培养12小时以活化菌株。

在此培养物中，将种子微生物的悬浮液的1％接种于预先制备的TSB培养基(酪蛋白的酶促消化物17.0g、大豆粉的酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g，最终pH：25℃下7.3±0.2)中，并且在37℃和180rpm下振荡培养。在培养之后，在25℃和8000rpm下离心培养液10分钟，以分离细胞团块和上清。仅取出细胞团块，并且用0.8％NaCl无菌溶液洗涤。在洗涤之后，通过使用UV灯(VIBER LOURMAT,115V,60Hz)对所回收的细胞团块进行UV照射(254nm)来诱导人工突变。

将细胞铺涂布在作为选择培养基的2％含脱脂乳的TSA琼脂平板(酪蛋白的酶促消化物15g、大豆粉的酶促消化物5g、NaCl 5g、琼脂15g，最终pH：25℃下7.3±0.2)上，并且在37℃培养20小时。在培养之后，使用卡尺(CD-20CPX,Mitutoyo,Kanagawa,Japan)测定形成的亮区的大小(直径，mm)，并且主要选择16种具有高蛋白质水解活性的突变体菌株。

随后，将由此选择的16种突变体菌株中的每一种接种于热处理的大豆粉中，并且培养20小时，并且在25℃和8000rpm下将由其获得的培养液离心10分钟，以分离细胞团块和上清。通过测量γ-PGA的重量来确定上清中的γ-PGA含量，该γ-PGA根据文件(Goto等.Biosci.Biotechnol.Biochem,.56：1031-1035.,1992)中所公开的方法在分离和纯化及冻干之后回收。

根据实施例1中所述的方法测量蛋白酶活性，并且通过以下定性分析和定量分析两种方法测量γ-PGA含量。

首先，对于γ-PGA活性的定性分析，将40μl分离的上清与10μl的5×染色缓冲溶液混合，并且随后加载于5％至20％梯度SDS-聚酰胺凝胶上以进行浓度梯度SDS-PAGE。在电泳之后，用考马斯染料试剂染色标准蛋白质，接着脱色。随后，用亚甲蓝染色聚-γ-谷氨酸以进行定性分析。

如图4所示，在泳道4的CJ823(亲本菌株)的上清中检测到聚-γ-谷氨酸，但聚合物产生能力被大大地降低，而在泳道5的U304突变体菌株的上清中观察到高蛋白酶活性。

同时，对于γ-PGA含量的定量分析，用相等量的蒸馏水稀释固态发酵的上清，并且随后以20,000×g离心20分钟。使用6M HCl将所获得的上清的pH调整至3.0，并且在4℃下保留一天。此后，以25,000×g将上清离心30分钟，并且随后回收团块。将团块完全溶于100～200倍体积的蒸馏水中，并且以25,000×g离心30分钟以除去杂质。通过在4℃下透析一天来除去盐。将所得物冷冻干燥以回收γ-PGA，并且由其获得的结果显示在以下表4中。

表4

如表4所示，相较于CJ823，大多数突变体菌株显示低的γ-PGA含量。在这些突变体菌株中，最终选择显示最高蛋白酶活性和相对低γ-PGA含量的U304突变体菌株。具体地，U304突变体菌株显示比对照组枯草芽孢杆菌TP6更低的γ-PGA含量和高三倍或更高的蛋白酶活性。

最终选择的U304突变体菌株的特征在于其具有通过明显减少聚合物诸如聚-γ-谷氨酸的产量而降低的粘性物质产率，同时保持亲本菌株的特性——包括高浓度蛋白酶的产生和针对病原体的极佳的抗微生物活性。

实施例5：U304突变体菌株(K2G)的16S rRNA序列的测定和系统发生分析

为鉴定具有降低的粘性物质产率的U304突变体菌株，将菌株接种于新的NA琼脂平板中，并且在37℃培养16小时。用0.8％NaCl无菌溶液稀释所形成的菌落，并且随后注入至由63种干燥培养基及生物化学反应物组成的BCL ID卡(bioMNitek Inc.,Hazewood,USA)中，并且每15分钟将结果完整地储存于VITEK 2Compact软件(bioMVitek)中，并在14小时之后完成鉴定。

作为用于通过16S rRNA序列分析的细菌鉴定的通用引物，使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的518F(5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’)和800R(5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)，并且在通过PCR进行16S rRNA扩增之后，使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems Inc.,USA)来翻译含有在鉴定中重要的50～900bp的碱基序列的1,333bp。16S rRNA序列分析的结果显示U304突变体菌株具有SEQ ID NO.1的16S rRNA序列。

通过Blast相似性搜索程序(国家生物信息研究所，National Institute of Biotechnology Information)确定序列相似性，并且在多重序列比对之后，在系统树中确定位置(图5)。

表5

通过Vitec 2Compact软件分析63种生物化学试验的结果。结果，将菌株分类成枯草芽孢杆菌/解淀粉芽孢杆菌，概率为98％。如图5所示，系统发生分析的结果显示U304突变体菌株与标准菌株，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)FZB42T(CP000560)具有最接近的关系，并且16S rDNA序列同源性为99.92％(1332bp/1333bp)。

因此，当将生物化学特性和系统发生分析的结果结合在一起(taken together)时，将根据本发明的U304突变体菌株定名为解淀粉芽孢杆菌K2G，并且根据布达佩斯条约以登录号KCCM11471P于2013年11月7日保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)。

实施例6：在使用解淀粉芽孢杆菌K2G进行大豆粉发酵时粗蛋白质含量根据发酵时间的变化

为检查在使用根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G进行大豆粉发酵时粗蛋白质含量根据发酵时间的变化，进行以下实验。

首先，400g的大豆粉被制备以具有45％的水含量，并且在100℃蒸汽处理30分钟，随后冷却至40℃或更低。随后，将解淀粉芽孢杆菌K2G涂布于TSB琼脂平板(酪蛋白的酶促消化物17.0g、大豆粉的酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂15.0g，最终pH：25℃下7.3±0.2)上，并且在37℃培养12小时以活化菌株。将大约2个环(loop)的活化菌株悬浮于9ml的0.8％NaCl无菌溶液(在A_660nm稀释至0.2)中，并且此悬浮液用作种子微生物。在此培养物中，将种子微生物的悬浮液的1％接种于40ml预先制备的TSB培养基(酪蛋白的酶促消化物17.0g、大豆粉的酶促消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g，最终pH：25℃下7.3±0.2)中，并且在37℃和180rpm下振荡培养。

40ml解淀粉芽孢杆菌K2G的培养液被制备以具有45％的水含量，被添加至蒸汽处理过的大豆粉，并且充分混合，接着在37℃和恒定湿度下静置培养20小时。在60℃干燥器中干燥培养物样本直至水含量达到10％或更小，并且随后使用Kjeldahl系统(Kjltec 2100)测量每一样本中的粗蛋白质含量。此时，在发酵之前和发酵12、16和20小时之后测量粗蛋白质含量，并且枯草芽孢杆菌TP6用作对照组。由其测量的粗蛋白质含量(％，校正为10％水分)显示在以下表6中。此时，枯草芽孢杆菌TP6用作对照组。

表6

如表6所示，基于24小时发酵，通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G发酵的大豆粉显示粗蛋白质含量相当于或高于通过枯草芽孢杆菌TP6发酵的大豆粉，该枯草芽孢杆菌TP6已知为常规大豆粉发酵菌株。

这些结果表明根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G可有效地用于作为高质量蛋白质饲料的发酵大豆粉的生产。

实施例7：在使用解淀粉芽孢杆菌K2G进行大豆粉发酵时TI含量根据发酵时间的变化

为检查在使用根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G进行大豆粉发酵时胰蛋白酶抑制剂(TI)含量根据发酵时间的变化，进行以下实验。

具体地，如实施例6，400g大豆粉被制备以具有45％的水含量，并且在100℃蒸汽处理30分钟，随后解淀粉芽孢杆菌K2G以4.5×10⁷CFU/ml的密度被接种于蒸汽处理过的大豆粉中，接着在37℃和恒定湿度下培养24小时。根据AACC-71-10(美国谷物化学家协会，American association of cereal chemists,1995)，在发酵之前和发酵16、20和24小时之后测量TI含量，并且由其测量的TI含量(mg/g)显示在以下表7中。此时，枯草芽孢杆菌TP6用作对照组。

表7

如表7所示，通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G发酵的大豆粉显示在16小时发酵之后0.39mg/g的TI含量，其对应于在通过枯草芽孢杆菌TP6——已知为常规大豆粉发酵菌株——发酵24小时的大豆粉中的TI含量，暗示抗营养因子的减少可通过仅16小时发酵而以相当水平实现。

本发明在以下方面是极佳的：发酵时间的减少增加了发酵罐的转变率以增加每年可生产的批料的数量，并且因此以较低成本可向消费者提供高质量发酵大豆粉。

实施例8：在使用解淀粉芽孢杆菌K2G进行大豆粉发酵时大豆蛋白质的水解度和其在KOH中溶解度的测量

大豆粉是具有高含量蛋白质的植物饲料原材料，但具有的缺点是：其由于抗营养因子和具有低消化率和低吸收率的蛋白质而尤其不足以用于幼年牲畜。用于改善此缺点的方法之一是制备水解肽形式的蛋白质、或通过使用微生物发酵使其降解成可易于消化的低分子量蛋白质。根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G是具有高蛋白酶产率的菌株，并且因此预期通过使用该解淀粉芽孢杆菌K2G制备的发酵大豆粉中的大豆蛋白质可通过由该菌株分泌的蛋白酶降解。

为证实此点，首先测量根据本发明的发酵大豆粉的水解度。如实施例6，400g大豆粉被制备以具有45％的水含量，并且在100℃蒸汽处理30分钟，随后将解淀粉芽孢杆菌K2G以4.5×10⁷CFU/ml的密度接种于蒸汽处理过的大豆粉中，接着在37℃和恒定湿度下培养24小时。在25℃和8000rpm下离心由其获得的培养液10分钟，以分离细胞团块和上清。将40μl分离的上清与10μl的5×染色缓冲溶液混合，并且随后进行SDS-PAGE(10％)以根据其分子量检测蛋白质的迁移。在电泳之后，用考马斯亮蓝R250染色聚酰胺凝胶以检测蛋白质的组成和分子量，结果显示在图6中。此时，未加工大豆粉和通过枯草芽孢杆菌TP6制备的发酵大豆粉用作对照组。

如图6所示，发现相较于未加工大豆粉和通过另一菌株制备的发酵大豆粉，通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G制备的发酵大豆粉显示低分子量区域中的高蛋白质密度。在SDS-聚酰胺凝胶上，上方带指示高分子量蛋白质，而下方带指示低分子量蛋白质。这些结果表明在具有相同分子量的大豆粉的情况下，通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G发酵的大豆粉中的高分子量蛋白质被水解成低分子量蛋白质。

根据之前的报告，使用显示80％的KOH(氢氧化钾)溶解度的大豆粉和显示较低溶解度(55％至68％)的大豆粉进行四次肉仔鸡的膳食性补充。结果，相较于用显示80％的KOH溶解度的大豆粉喂食的肉仔鸡，用显示低KOH溶解度的大豆粉喂食的肉仔鸡的重量、采食量和饲料功效明显地低或减少(Abulto等.J.Appl.Poult.Res.7:189-195,1998b)。

因此，根据文件(Parsons等.J Anim Sci.,69:2918-24,1991)中公开的方法测量根据本发明的发酵大豆粉的KOH溶解度。简言之，将由此制备的1.0g发酵大豆粉添加至0.2％KOH溶液，并且混合20分钟，接着过滤。使用Kjeldahl系统测量滤液中的氮含量，并且将其转换成溶解度。结果显示在表8中。

表8

如表8所示，蒸汽处理过的大豆粉的KOH溶解度从80％减少至70％，但在通过根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G固态发酵期间，KOH溶解度增加至85％。这些结果暗示由于大豆蛋白质被根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G分泌的蛋白酶降解KOH增加。

工业实用性

根据本发明的解淀粉芽孢杆菌K2G菌株(KCCM11471P)在抗营养因子的去除活性、蛋白酶活性和针对病原体的抗微生物活性方面是极佳的，并且在发酵期间具有降低的粘性物质产率。因此，当菌株用作种子微生物进行大豆粉的固态发酵时，具有提高的消化率和吸收率以及饲料效率的高质量发酵大豆粉可由于以下原因得以生产：通过大豆蛋白质的水解的低分子化和粗蛋白质含量的增加、胰蛋白酶抑制剂的钝化、或抗营养因子诸如非消化性多糖的含量的减少。

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大韩民国

证明上述翻译与原文内容没有相互违背

2014年1月28日

专利代理人Son Min印

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