本发明一般涉及检测dna甲基化的方法和试剂盒。
背景技术：
人类基因的表观遗传修饰有望成为癌症早期诊断的有前途的生物标志物。特别地，癌症抑制基因的启动子区域的dna甲基化通常与参与癌症倾向性(predisposition)、起始和进展的异常基因调控有关。因此，dna甲基化生物标志物可为癌症早期检测和癌症进展监测的理想靶标。
例如，最近的研究表明，基于血液的septin9(sept9)基因甲基化检测可用作结肠直肠癌的非侵入性筛查方法。从肿瘤细胞释放的循环无细胞dna(cell-freedna，cfdna)片段允许异常dna改变的早期检测。据报道，sept9试验的临床灵敏性和特异性可高于70％。与基于结肠镜的监测相比，dna测定方便得多，并且能提高患者对筛查的顺从性。然而，在正常dna的大背景下测量稀有循环肿瘤cfdna的表观遗传变化是非常具有挑战性的。需要高度灵敏和特异性的检测。
现有技术中已经存在用于确定核酸甲基化的多种技术。但是，对于新技术仍然有相当大的需求，以克服现有技术的缺陷。
技术实现要素：
本发明通过提供用于测定核酸甲基化的新方法来满足本领域的上述需求。
在一方面中，本发明提供了确定样品中靶核酸分子的甲基化状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)用亚硫酸氢盐处理所述样品，从而将所述靶核酸分子中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶；
(b)在聚合酶链式反应(pcr)中，使用甲基化特异性引物对，在允许产生pcr扩增产物(扩增子)的这样的扩增条件下，扩增经转化的靶核酸分子的至少一部分，所述部分包含待分析甲基化状态的靶区域；
(c)在允许寡核苷酸类似物探针与包含所述靶区域的所述扩增子彼此杂交的条件下，使所述扩增子与甲基化特异性等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包含等离子体纳米颗粒和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与所述靶区域互补的碱基序列，其中如果与所述靶核酸分子杂交，则所述探针产生与未杂交探针的信号可区分的可检测信号；
(d)基于对所述纳米探针和所述靶核酸的杂交体的解链温度tm的测定，来确定所述靶核酸分子的甲基化状态。
在多个实施方案中，确定了靶核酸分子内的一个或更多个cpg岛的甲基化状态。
在多个实施方案中，在本文公开的方法的步骤(b)中使用不对称pcr(asymmetricpcr，apcr)。
在多个实施方案中，甲基化特异性引物的至少一个在包含一个或更多个cpg岛的区域处与转化的靶核酸分子杂交，使得在pcr期间，与经转化的未甲基化分子，引物对更倾向于与经转化的甲基化核酸分子杂交。
在多个实施方案中，在pcr期间添加阻断剂(blocker)序列以使经转化的未甲基化核酸分子的扩增最小化。
在多个实施方案中，在本文公开的方法的步骤(c)中使用的等离子体纳米颗粒是等离子体金纳米颗粒。
在多个实施方案中，在本文公开的方法的步骤(c)中使用的非离子寡核苷酸类似物探针是吗啉代寡核苷酸探针。
在多个实施方案中，在本文公开的方法的步骤(c)中的可检测信号是测定溶液的颜色，其指示探针是否与扩增子杂交。
在多个实施方案中，在本文公开的方法的步骤(d)中的解链温度由纳米探针解离和随后的聚集引起的颜色变化来指示。
在多个实施方案中，本文公开的方法还包括在步骤(a)之前，从样品分离基因组dna。
在多个实施方案中，所述方法还包括使用包含未甲基化靶核苷酸序列的核酸分子作为阴性对照，和/或使用包含甲基化靶核苷酸序列的核酸分子作为阳性对照。
在多个实施方案中，靶核酸分子是人septin9(sept9)基因启动子，甲基化特异性引物具有核酸序列5’-attagttattatgtcggatttcgc-3’(seqidno：1)和5’-caacacgtccgcgaccg-3’(seqidno：2)，阻断剂具有核酸序列5’-gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag-3’，并在3’末端用c3间隔物标记(seqidno：3)，所用的寡核苷酸类似物探针是具有核酸序列5’-caactacgcgttaaccgcgattttt-3’(seqidno：4)的吗啉代寡核苷酸。
在多个实施方案中，所述方法用于确定人septin9(sept9)基因启动子、优选在由结肠直肠癌细胞释放的在血液中循环的无细胞dna(cfdna)片段中的人septin9(sept9)基因启动子的甲基化状态。
在另一个方面中，本发明提供了用于测定样品中靶核酸分子、优选所述靶核酸分子内的一个或更多个cpg岛的甲基化状态的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于本文公开的方法的甲基化特异性引物对和甲基化特异性等离子体纳米探针。
在多个实施方案中，试剂盒还包含用于本文公开的方法的阻断剂序列。
在多个实施方案中，试剂盒还包含亚硫酸氢盐或其盐。
在多个实施方案中，靶核酸分子是人sept9基因启动子，并且试剂盒包含具有核酸序列5’-attagttattatgtcggatttcgc-3’(seqidno:1)和5’-caacacgtccgcgaccg-3’(seqidno:2)的甲基化特异性引物对，以及被具有核酸序列5’-caactacgcgttaaccgcgattttt-3’(seqidno:4)的吗啉代寡核苷酸官能化的等离子体金纳米颗粒。
在多个实施方案中，试剂盒还包含具有核酸序列5’-gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag-3’且在3’末端用c3间隔物标记(seqidno:3)的阻断剂。
附图说明
当结合非限制性实例和附图进行考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明。
图1示出了本文所述的甲基化测定的工作流程。
图2示出了sept9基因靶标区域，以及引物、阻断剂和探针的设计。
图3示出了解链温度作为甲基化和非甲基化合成dna样品的靶标浓度的函数。tm测量误差：±1℃。
图4示出了对未甲基化和甲基化gdna样品的测定响应。
图5示出了在未甲基化的gdna背景中检测到0.01％的甲基化gdna。
图6示出了结肠直肠细胞系样品的测定结果。阴性对照中的模板是未甲基化的gdna(约100ng)。
具体实施方式
以下详细描述说明性地涉及可以实现本发明的具体细节和实施例。足够详细地描述这些实施方案以使本领域技术人员能够实现本发明。可以利用其他实施方案，并且可以在不偏离本发明范围的情况下进行结构和逻辑改变。多个实施方案不一定是相互排斥的，因为一些实施方案可以与一个或更多个其他实施方案组合以形成新的实施方案。
本发明的目的是提供一种确定样品中靶核酸分子的甲基化状态的方法。
为此，本发明的发明人提出了一种利用甲基化特异性聚合酶链式反应(pcr)和基于等离子体纳米探针的检测的方法。
在一个方面中，本文公开了一种确定样品中靶核酸分子的甲基化状态、优选所述靶核酸分子内的一个或更多个cpg岛的甲基化状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)用亚硫酸氢盐处理所述样品，从而将所述靶核酸分子中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶；
(b)在聚合酶链式反应(pcr)、优选非对称pcr(apcr)中，使用甲基化特异性引物对，在允许产生pcr扩增产物(扩增子)的这样的扩增条件下，扩增经转化的靶核酸分子的至少一部分，所述部分包含待分析甲基化状态的靶区域；
(c)在允许寡核苷酸类似物探针与包含靶区域的扩增子彼此杂交的条件下，使扩增子与甲基化特异性等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包含等离子体纳米颗粒(优选等离子体金纳米颗粒)和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物(优选吗啉代寡核苷酸(mor))探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与靶区域互补的碱基序列，其中如果与靶核酸分子杂交，则探针产生与未杂交探针的信号可区分的可检测信号，其中所述可检测信号优选是测定溶液的颜色，其指示探针是否与扩增子杂交；
(d)基于对纳米探针和靶核酸的杂交体的解链温度tm的测定，来确定靶核酸分子的甲基化状态，其中所述解链温度优选由纳米探针解离和随后的聚集引起的颜色变化来指示。
在某些实施方案中，本文公开的方法可以进一步包括在步骤(a)之前从样品中分离基因组dna。
目前描述的方法用于确定样品中靶核酸分子的一个或更多个胞嘧啶的甲基化状态(即，甲基化的位置和/或程度)。在一些实施方案中，使用靶核酸分子的碱基组成相对于其典型的非甲基化序列的差异来确定甲基化程度。
在优选的实施方案中，确定了靶核酸分子内一个或更多个cpg岛的甲基化状态。cpg岛是含有cpg二核苷酸簇的基因组区域。这些簇经常出现在基因的5’端。已知cpg岛的甲基化在高等生物体的转录沉默中发挥作用。人基因组中大多数cpg二核苷酸的胞嘧啶碱基是甲基化的，但cpg岛中的胞嘧啶碱基通常是未甲基化的。
本文使用的术语“核酸分子”、“核酸序列”或“寡核苷酸”涉及任何可能构型的任何核酸分子，包括单链、双链构型或其组合。
本文使用的术语“样品”是指能够通过本文所述的方法进行分析的任何物质。在一些实施方案中，样品包含或怀疑包含一种或更多种能够通过所述方法分析的核酸。在某些实施方案中，例如，样品包含核酸(例如dna、rna、cdna等)。样品可包括例如细胞、血液、精液、唾液、尿液、粪便、直肠拭子等。在一些实施方案中，样品是“混合物”样品，包含来自多于一个对象或个体的核酸。在一些实施方案中，本文提供的方法包括纯化样品或从样品纯化核酸。在一些实施方案中，样品是经纯化的核酸。
本文所用的术语“亚硫酸氢盐处理(bisulfitetreatment)”是指用亚硫酸氢盐或其盐(例如硫酸氢钠)处理样品用于随后的甲基化分析。用亚硫酸氢盐处理核酸分子(例如dna)将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但不修饰5-甲基胞嘧啶残基。因此，取决于个体胞嘧啶残基的甲基化状态，亚硫酸氢盐处理在核酸碱基组成中引入特定的变化。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理产生关于dna区段的甲基化状态的单核苷酸解析信息。
亚硫酸氢盐处理之后，通过pcr扩增经转化的靶核酸分子的至少一部分。本方法可以使用可产生用于与甲基化特异性等离子体纳米探针的寡核苷酸类似物探针杂交的单链扩增子的任何pcr。这样类型的pcr技术包括但不限于等位基因特异性pcr、装配pcr(assemblypcr)、不对称pcr、拨出pcr(dial-outpcr)、数字pcr、解旋酶依赖性扩增、热启动pcr、序列间特异性pcr(issr)、反向pcr、连接介导pcr、甲基化特异性pcr(msp)、小引物pcr、多重连接依赖式探针扩增(mlpa)、多重pcr、纳米颗粒辅助pcr(nanopcr)、巢式pcr、重叠延伸pcr或重叠扩展剪接(soeing)、pan-ac、逆转录pcr(rt-pcr)、固相pcr、热不对称交错pcr(tail-pcr)、降落pcr(touchdownpcr)(降压pcr(step-downpcr))、通用快速步行或转录介导的扩增(tma)。这些技术在本领域中是众所周知的(mcpherson，mj和moller，sg(2000)pcr(basics)，springer-verlagtelos；第一版)。
在优选的实施方案中，使用不对称pcr(apcr)。apcr是其中两种引物的量不相等的pcr。以较高量存在的引物称为过量引物，并且由过量引物延伸所产生的链被过量累积并且随后与甲基化特异性等离子体纳米探针的寡核苷酸类似物探针杂交。
设计甲基化特异性引物以特异性地扩增经转化的甲基化靶核酸分子。在某些实施方案中，至少一个甲基化特异性引物在包含一个或更多个cpg岛的区域处与经转化的靶核酸分子杂交，使得在pcr期间，于经转化的未甲基化分子相比，引物对更倾向于与经转化的甲基化核酸分子杂交。
在某些实施方案中，在pcr期间添加阻断剂序列以使经转化的未甲基化核酸分子的扩增最小化。
本文所用的“阻断剂序列”是指多核苷酸，其通常是单链的合成多核苷酸，并且包含可与靶核酸分子的区段杂交且优选互补的序列，其中所述阻断剂序列使靶核酸分子退火，从而在期望位置处阻止在第一链cdna的3’端的进一步引物延伸。本发明用于获得单链dna靶序列的链置换方法的一些实施方案包括使用阻断剂序列。阻断剂序列包含以亲和力(优选高亲和力)与靶核酸结合的核苷酸，使得所述阻断剂序列在引物延伸过程中，优选在超过约30％、更优选超过约50％、甚至更优选超过约75％、最优选超过约90％的引物延伸事件中抵抗dna聚合酶的置换。在本发明方法的条件下，阻断剂序列的长度和组成应当避免过度的随机非特异性杂交。阻断剂多核苷酸的长度优选为约3至约100个核苷酸、更优选为约5至约80个核苷酸、甚至更优选为约8至约40个核苷酸、并且最优选为约10至约15个核苷酸。应该理解的是，在本发明方法的反应条件下，该长度可以适当地更长或更短。所述阻断剂多核苷酸与位于靶核酸上的其预期结合序列的互补性优选为至少约25％、更优选至少约50％、甚至更优选至少约75％、且最优选至少约90％。在一些实施方案中，与dna靶核酸杂交的阻断剂序列与dna连接，使得基本上或至少充分地抑制影响引物延伸的聚合酶导致的阻断剂序列的置换。实现此类连接的合适方法包括但不限于本领域已知的技术，例如使用flanagan等(proc.natl.acad.sci.usa，96:3513-3518,1999)描述的含有g-clamp杂环修饰的胞嘧啶类似物；以及例如kumar等(bioorg.med.chem.lett.8:2219-2222,1998)；和wahlestedt等(proc.natl.acad.sci.usa97:5633-5638,2000)描述的锁核酸，其全部通过引用并入。其他合适的方法包括在适当的情况下使用具有高gc含量和/或交联度的序列。用于获得增强连接的任何这些方法可以单独使用或组合使用。或者，可以使用包含肽核酸(“pna”)的分子。本发明的方法中的阻断剂序列是任选的。
在允许寡核苷酸类似物探针与包含靶区域的扩增子彼此杂交的条件下，使pcr扩增子进一步与甲基化特异性等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包含等离子纳米颗粒和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与靶区域互补的碱基序列。
不希望受任何特定理论束缚，如果根据本发明的探针与靶核酸分子杂交，则产生与未杂交探针的信号可区分的可检测信号。所述信号可以是通过任何手段可检测的任何信号。
在优选的实施方案中，这些探针通过显示其杂交状态的颜色(例如红色)和其未杂交的聚集状态下的另一种颜色(例如浅灰色)来指示靶标的存在或不存在。通常，可以通过控制测定溶液的离子强度来实现未杂交的纳米探针的聚集，例如通过控制盐浓度。纳米探针的这种特定行为(即只要其与其靶标杂交就保持非聚集形式，而若不与其靶标杂交则保持聚集)可以归因于纳米探针的非离子特征。
所述方法的步骤c)中的甲基化特异性等离子体纳米探针和扩增子的杂交可以在这样的温度下进行：低于纳米探针与具有期望甲基化状态的靶核酸分子(即，典型的是经转化的甲基化核酸分子)的扩增子的双链体的解链温度，且高于纳米探针与具有不期望的甲基化状态的靶核酸(即，典型地是经转化的非甲基化核酸分子)的双链体的解链温度；从而允许最大化地区分这两个组。在这些实施方案中，也可以在上述温度下，通过简单地确定测定溶液的颜色以指示杂交体是否已经形成来进行步骤d)。因此，在这些实施方案中，杂交体的解链温度仅被确定，则确定了：所形成的杂交体的解链温度高于测定温度，表明存在具有目的甲基化状态的靶核酸，或解链温度低于测定温度，表明缺少具有目的甲基化状态的靶核酸。
本文所用术语“纳米颗粒”是指具有约1至约250nm的尺寸并且具有与本文所述的至少一种寡核苷酸类似物共价偶联的能力的任何颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒是金属纳米颗粒。在另一些实施方案中，纳米颗粒是胶体金属。
在一些实施方案中，所述金属是贵金属。可用贵金属的非限制性实例可包括银、金、铂、钯、钌、锇、铱或其混合物，省略其他。可用于形成纳米颗粒的另一些金属可包括但不限于铝、铜、钴、铟、镍或任何其他适合形成纳米颗粒的金属)。本文所述的纳米颗粒还可包括半导体(例如，包括但不限于cdse、cds和cds或涂覆有zns的cdse)或磁性(例如铁磁体)胶体材料。可用于实现本发明的另一些纳米颗粒包括但不限于zns、zno、ti、tio2、sn、sno2、si、sio2、fe、ag、cu、ni、al、钢、钴铬合金、cd、钛合金、agi、agbr、hgi2、pbs、pbse、znte、cdte、in2se3、cd3p2、cd3as2、inas和gaas。
只要纳米颗粒能够提供光学性质，例如，产生对杂交反应敏感的光学信号，用于本发明缀合物中的纳米颗粒的尺寸可根据需要变化为任何尺寸。本文所述的纳米颗粒的直径范围可以为约1nm至约250nm；约1nm至约200nm；约1nm至约160nm；约1nm至约140nm；约1nm至约120nm；约1nm至约80nm；约1nm至约60nm；约1nm至约50nm；约5nm至约250nm；约8nm至约250nm；约10nm至约250nm；约20nm至约250nm；约30nm至约250nm；约40nm至约250nm；约85nm至约250nm；约100nm至约250nm；或约150nm至约250nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径在约1nm至约100nm的范围内。
在某些实施方案中，纳米颗粒包含表面活性剂。本文所使用的“表面活性剂”是指分子中具有亲水部分和疏水部分二者的表面活性试剂。例如，表面活性剂可用来稳定纳米颗粒。表面活性剂也可用于防止寡核苷酸类似物在纳米颗粒表面上的非特异性吸附。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。可以使用的其他类型的表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂。特定的表面活性剂可以单独使用或与另一些表面活性剂组合使用。一类表面活性剂包括亲水头部基团和疏水尾部。与阴离子表面活性剂相关的亲水头部基团包括羧酸盐、磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐和膦酸盐。与阳离子表面活性剂相关的亲水头部基团包括季胺类、锍和鏻。季胺类包括季铵、吡啶、联吡啶和咪唑鎓盐。与非离子表面活性剂相关的亲水头部基团包括醇和酰胺。与两性离子表面活性剂相关的亲水头部基团包括甜菜碱。疏水尾部通常包括烃链。烃链通常包括约6至约24个碳原子，更通常约8至约16个碳原子。
用于本发明方法的等离子体纳米颗粒被非离子寡核苷酸类似物探针官能化，与经转化的未甲基化核酸分子的扩增子相比，其优选地识别经转化的甲基化核酸分子的扩增子。在某些实施方案中，寡核苷酸类似物探针在包含一个或更多个cpg岛的区域处与扩增子互补，因此与经转化的未甲基化分子的扩增子相比，其特异性地识别经转化的甲基化核酸分子的扩增子。
在一些实施方案中，本公开的方法中使用的非离子寡核苷酸类似物探针是吗啉代寡核苷酸探针或其衍生物。术语“寡核苷酸类似物”是指具有如下结构的寡核苷酸：(i)修饰的主链结构，例如除天然寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键以外的主链，和(ii)任选地修饰的糖部分，例如吗啉代部分而非核糖或脱氧核糖部分。类似物固载能够通过沃森—克里克碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键的碱基，其中所述类似物主链提供碱基，允许此类氢键以寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸(例如，单链rna或单链dna)中的碱基之间的序列特异性的方式键合。例如，所述类似物可以包含具有基本上不带电荷的含磷主链的那些。
举例来说，寡核苷酸类似物中基本上不带电荷的含磷主链可以是其中大部分，例如60％至100％的亚单位连键在生理ph下不带电且含有单个磷原子的主链。寡核苷酸类似物可以包含与如下定义的靶核酸序列互补的核苷酸序列。在优选实施方案中，本发明的寡核苷酸类似物是二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸，其中糖和磷酸酯主链被通过氨基磷酸酯连接的吗啉基团取代，并且核碱基如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶与吗啉环或其衍生物连接。
如本文所用，术语“互补”或“互补性”涉及dna或rna的两条不同链上的核苷酸/碱基的关系，或寡核苷酸类似物探针的核苷酸序列的核苷酸/碱基与dna/rna链的关系，其中碱基是配对的(例如通过沃森—克里克碱基配对：鸟嘌呤与胞嘧啶，腺嘌呤与胸腺嘧啶(dna)或尿嘧啶(rna))。因此，本文所述的寡核苷酸类似物探针可包含通过常规沃森—克里克碱基配对或其他非传统类型的配对(如互补核苷或核苷酸之间hoogsteen或反向hoogsteen氢键键合)而可与另一核苷酸序列(例如dna或rna序列)形成氢键的核苷酸序列。在本文中，术语“杂交”是指按照沃森—克里克dna互补性、hoogsteen结合或本领域已知的其他序列特异性结合的规则，dna或rna的两个不同链之间或寡核苷酸类似物探针的核苷酸序列的核苷酸/碱基与dna/rna序列之间通过氢键的相互作用。在此背景下，本领域理解本文所述的寡核苷酸类似物的核苷酸序列不需要与靶核酸序列100％互补来达到特异性或选择性杂交。互补性由可与第二核酸分子形成氢键的核酸分子中的连续残基的百分比表示。例如，如果第一核酸分子具有10个核苷酸并且第二核酸分子具有10个核苷酸，则第一和第二核酸分子之间的5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对分别代表50％、60％、70％、80％、90％或100％的互补性，且举几种。因此，在一些实施方案中，本文使用的寡核苷酸类似物可以与靶核酸分子100％互补(即完美匹配)。在其他实施方案中，所述寡核苷酸类似物探针与靶核酸分子可以是至少约95％互补、至少约85％互补、至少约70％互补、至少约65％互补、至少约55％互补、至少约45％互补的或至少约30％互补，条件是与经转化的非甲基化分子的扩增子相比，其可特异性识别经转化的甲基化核酸分子的扩增子。
本文所述的寡核苷酸类似物探针的长度可以包括约5个单体单元(monomelicunits)至约40个单体单元；约10个单体单元至约35个单体单元；或约15个单体单元至约35个单体单元。本文所用的寡核苷酸类似物探针的术语“单体单元”是指寡核苷酸类似物的一个核苷酸单位。
在某些实施方案中，寡核苷酸类似物探针经官能团共价偶联至纳米颗粒。所述官能团通常包含在所述寡核苷酸类似物探针的间隔物部分中从而共价结合至所述纳米颗粒。在一些实施方案中，所述官能团可以包括硫醇(sh)基团，该基团可以例如用于共价连接到纳米颗粒的表面。但是，也可以使用其他官能团。用硫醇在3’末端或5’末端官能化寡核苷酸使其容易附接于金纳米颗粒。参见例如mucic等，chem.commun.555-557(1996)，其描述了将3’硫醇dna附接到平的金表面的方法。硫醇部分也可以用于将寡核苷酸附接至其他金属、半导体和磁性胶体，以及本文所述的其他类型的纳米颗粒。用于将寡核苷酸附接至固体表面的其他官能团包括硫代磷酸酯基团(参见例如美国专利no.5,472,881，寡核苷酸—硫代磷酸酯与金表面的结合)，被取代的烷基硅氧烷(参见例如grabar等，anal.ghent.，67，735-743)。具有5’硫代核苷或3’硫代核苷的寡核苷酸也可用于将寡核苷酸附接至固体表面。本领域技术人员已知的可以用于将寡核苷酸类似物探针连接至纳米颗粒的其他官能团可包括但不限于二硫化物，例如二硫化物酰胺；羧酸；芳香环化合物；环丁砜；亚砜；硅烷，不列举更多。
用于实现本发明方法的等离子体纳米颗粒和纳米探针的更详细描述可以在pct国际专利公开no.wo2011/087456a1中找到，其通过引用整体并入本文，其中探针序列适用于目的靶标。
如上所述，本方法使用甲基化特异性pcr来对包含待分析甲基化状态的靶区域的至少部分经转化的甲基化核酸分子进行特异性扩增，并且基于等离子体纳米探针的比色检测得到的扩增子，因此该方法可用于确定靶核酸分子的甲基化状态。
由本发明人开发的等离子体纳米探针在识别核酸序列方面具有高度特异性。在优选的实施方案中，等离子体金纳米颗粒被非离子吗啉代寡核苷酸官能化。与稳定分散在盐溶液中的dna修饰的金纳米颗粒不同，所述吗啉代寡核苷酸的非离子性质使得吗啉代寡核苷酸修饰的纳米颗粒更不稳定，并且仅可分散在具有低离子强度的溶液中(例如[nacl]<10mmol/l)。由于纳米颗粒聚集，溶液离子强度提高将导致溶液颜色从红色变为浅灰色/无色。然而，当与带负电的dna分子杂交时，由于表面电荷增加，纳米探针变得稳定得多，并且溶液在高离子强度(例如[nacl]为约100mmol/l)下保持红色。当温度升高时，在解链温度(tm)处发生急剧的解链转变，由此dna分子从纳米探针释放，导致溶液中的颜色快速变化。所述纳米探针在识别dna靶标方面具有高度特异性，而且单碱基错配可导致tm降低5至12℃。这项技术允许使用标准设备和简单的工作流程进行准确的端点检测。色度信号可以很容易地显示和记录。
在某些实施方案中，本文公开的方法包括使用包含未甲基化的靶核苷酸序列的核酸分子作为阴性对照，和/或使用包含甲基化的靶核苷酸序列的核酸分子作为阳性对照。
本方法可用于确定人septin9(sept9)基因启动子、优选在由结肠直肠癌细胞释放的在血液中循环的无细胞dna(cfdna)片段中的人septin9(sept9)基因启动子的甲基化状态。在优选的实施方案中，所述方法中使用的甲基化特异性引物具有核酸序列5’-attagttattatgtcggatttcgc-3’(seqidno：1)和5’-caacacgtccgcgaccg-3’(seqidno：2)，阻断剂具有核酸序列5’-gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag-3’并且在3’末端用c3间隔物标记(seqidno：3)；并且使用的寡核苷酸类似物探针是具有核酸序列5’-caactacgcgttaaccgcgattttt-3’(seqidno:4)的吗啉代寡核苷酸。
在另一方面，本文进一步公开了用于确定样品中靶核酸分子、优选所述靶核酸分子内的一个或更多个cpg岛的甲基化状态的试剂盒，其中所述试剂盒包含如上所述的甲基化特异性引物对和甲基化特异性等离子体纳米探针。
在某些实施方案中，试剂盒还包含如上所述的阻断剂序列。
在某些实施方案中，试剂盒还包含亚硫酸氢盐或其盐。
在某些实施方案中，靶核酸分子是人sept9基因，并且试剂盒包含具有核酸序列5’-attagttattatgtcggatttcgc-3’(seqidno:1)和5’-caacacgtccgcgaccg-3’(seqidno:2)的甲基化特异性引物对，以及被具有核酸序列5’-caactacgcgttaaccgcgattttt-3’(seqidno：4)的吗啉代寡核苷酸官能化的等离子体金纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包含具有核酸序列5’-gttatatgttggattttgtggttaatgtgtag-3’且在3’末端用c3间隔物标记(seqidno：3)的阻断剂。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本文件为准，包括定义在内。
以下实施例进一步说明本发明。然而，应该理解，本发明不限于示例性实施例。
实施例
材料和方法
a.制备纳米探针
本文使用的纳米探针的制备与先前报道的类似(zuy等，analchem.，2011年6月1日；83(11)：4090-4；zuy等,small.,2011年2月7日；7(3)：306-10)。简而言之，用二硫苏糖醇处理在3’末端(genetools，llc)用二硫化物酰胺修饰的mor，然后使用nap-5柱(gehealthcare)进行纯化。将金np(40nm直径，约0.1nm)与约2μm硫醇化mor和10mm磷酸盐缓冲液(ph7.5)混合，并且在室温下孵育2小时。接下来，通过离心用磷酸盐缓冲液(5mm，ph7.5)将mor-np缀合物洗涤五次以除去未反应的mor。该缀合物可以立即用作纳米探针或储存在4℃冰箱中待用。在4℃下储存的纳米探针可稳定至少6个月。在使用之前，所述纳米探针溶液需要通过涡旋均匀分散。
b.tm测量
将合成靶标或pcr扩增子与特异性纳米探针简单混合。接下来，用热循环仪测量靶标-探针杂合体的tm值。以1.0℃的间隔从30℃提高温度。在每个温度下，将溶液孵育1分钟，然后进行颜色显像或用相机记录。当观察到从红色到浅灰色的清晰颜色变化时，温度记录为tm。
c.标准gdna样品
将购自promega的甲基化和非甲基化gdna样品用作标准gdna模板以评估测定性能。
d.细胞系gdna提取
根据制造商的说明，使用
e.亚硫酸氢盐转化
在pcr扩增之前，将gdna样品用亚硫酸氢盐处理以将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。根据制造商的说明使用methyledge亚硫酸氢盐转化系统(promega)进行转化。
f.apcr
使用apcr产生单链dna靶标。最终体积为25μl的pcr溶液含有gdna、12.5μl的主混合物(fermentas或promega，2×)、1000nm的正向引物、100nm的反向引物和1000nm的阻断剂。pcr循环(表3)在ptc-200dnaengine(bio-rad)上进行。通过在用safeviewtm染料染色的1.5％琼脂糖凝胶上运行5μl等分试样的pcr产物来验证pcr成功产生特定大小的扩增子。
g.测定dna甲基化
将pcr产物与甲基化特异性纳米探针混合。将溶液在45℃孵育10分钟。然后通过数码相机记录溶液的颜色。阳性样品通过粉红色溶液鉴定，而阴性样品通过浅灰色/无色溶液鉴定。
表1.本研究中使用的引物、阻断剂和吗啉代探针的序列。
表2.本研究中使用的合成dna的序列(表示亚硫酸氢盐转化后的甲基化和非甲基化sept9基因的靶标区域)
表3.用于pcr扩增的热循环仪方案
h.方法
图1示出了测试的流程。使用商业试剂盒获得dna并进行亚硫酸氢盐转化，然后使用标准热循环仪进行甲基化特异性不对称pcr(apcr)。接下来，将pcr产物与纳米探针测定溶液混合，并使其在45℃孵育10分钟。最后，通过数码相机记录测定溶液的颜色。阳性样品会显示粉红色，而阴性样品会变成无色。
由于血液中循环cfdna的浓度非常低，并且在亚硫酸氢盐转化过程中可能发生dna损伤，所以检测方法必须高度灵敏。为了提高扩增产率，将pcr循环数设定为70个循环。
在检测甲基化的cfdna时，血液中正常非甲基化dna的干扰通常是显著的。此外，亚硫酸氢盐处理可大大降低dna序列的复杂性水平，使得特异性检测更加困难。在方案中使用了涉及至少三个cpg位点的甲基化特异性pcr引物。为了抑制未甲基化序列的扩增，还使用了阻断剂序列。通过涉及四个cpg位点的甲基化特异性纳米探针测量pcr产物。图2和表1显示了pcr引物、阻断剂和探针的序列。
实施例1：纳米探针评估
为了表征纳米探针，在20nm至500nm的较宽浓度范围内、在合成dna样品存在下测量tm数据(图3)。合成的dna序列代表亚硫酸氢盐转化后甲基化和未甲基化的sept9基因的靶区域(表2)。在室温(约25℃)下，该纳米探针被大于或等于20nm的dna样品稳定化。随着dna靶标浓度增加，tm提高。未甲基化靶标与探针之间的4个g/t错配引起的tm降低为约15℃；这允许甲基化靶标的高度特异性检测。
实施例2：测定性能评估
通过使用浓度为5pm至100nm的甲基化和未甲基化的人基因组dna(gdna)样品(相应的拷贝数分别为1.5和3×104)来测试该测定的灵敏度和特异性。图4显示对于低至3拷贝的甲基化的gdna，apcr一致地产生扩增子。相应地，纳米探针测定产生阳性结果。对于浓度甚至更低的样品，获得随机阳性结果。
未甲基化的gdna是该测定的干扰背景。对于浓度高达50nm的未甲基化gdna，apcr不产生特异性扩增子。然而，对于100nm的未甲基化的gdna，扩增子带出现在凝胶电泳分析中，这表明未甲基化序列的非特异性扩增。在这种情况下，甲基化特异性引物的特异性和阻断剂的作用不能阻止apcr产生可检测量的未甲基化扩增子。有趣的是，尽管存在非特异性产物，基于纳米探针的测定给样品带来了阴性结果。高度特异性的纳米探针成功地将未甲基化序列与甲基化序列区分开。
在另一个测试中，检验了在100nm的非甲基化gdna存在下的测定灵敏度(图5)。类似于不存在未甲基化gdna的情况，该测定可以检测3拷贝的甲基化gdna。因此，该测定能够在非甲基化序列的背景下一致地检测0.01％的甲基化gdna。
实施例3：细胞系样品的分析
对从几种结肠直肠癌细胞系样品中提取的gdna(如sw480、rko和ls174t)也进行了检测。如文献所报道，这些细胞系在setp9基因的启动子区域中都是超甲基化(hypermethylated)的。该测定在所有样品的甲基化分析中显示阳性结果(图6)。
已经开发了一种高灵敏度和高特异性的sept9基因启动子甲基化测定。该测定能够在未甲基化序列的背景下检测0.01％的甲基化dna(即，在100nm的未甲基化序列中约3拷贝的甲基化dna)。该测定将适用于血液样品中cfdna的甲基化分析。
本文已经对本发明进行了广泛且一般性的描述。落入一般公开内容内的每种有限物种和亚属群组也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述具有从该属移除任何主题的附带条件或负面限制，无论本文是否特别陈述了所排除的物质。另一些实施方案在以下权利要求的范围内。另外，当根据马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将意识到本发明也可根据马库什组的任何单独成员或成员的亚组进行描述。
本领域技术人员将容易理解本发明非常适合于实现所述目的并获得所提及的目标和优点以及其中固有的目标和优点。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行多种替换和修改。本文所述的组合物、方法、程序、处理、分子和具体化合物目前代表优选实施例是示例性的，并非意图限制本发明的范围。本领域技术人员将会想到其中的改变和其他用途，其涵盖在本发明的精神之内并且由权利要求的范围限定。本说明书中先前公开的文件的列表或讨论不必然被视为承认所述文件是现有技术状态的一部分或者是公知常识。
本文说明性地描述的发明可适当地在缺少本文具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下实现。因此，例如术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广义地理解并且没有限制。词语“包括comprise”或其变体，例如“comprises”或“comprising”将被相应地理解为暗示包括所陈述的一个整体或多个整体的组，但不排除任何其它整体或整体的组。另外，本文使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性术语，并且不希望使用这种术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但是要认识到在要求保护的本发明的范围内可以进行多种修改。因此，应该理解，虽然通过示例性实施方案和可选特征已具体公开了本发明，但本领域技术人员可以采用本文公开的发明所体现的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
本文引用的所有文献和专利文献的内容通过引用以其全部并入。
序列表
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