一种鉴定超级早稻中早39稻瘟病抗性基因的方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种鉴定超级早稻中早39稻瘟病抗性基因的方法。

背景技术：

水稻是第一大粮食作物。近年来，随着社会发展，农业种植结构的进一步调整，我国的粮食安全隐忧突出。常规早籼稻因其耐储存、用途广泛、商品性好等特点，特别是作为工业用粮的作用大大增加，是我国粮食安全的重要支撑。常规超级早籼稻品种中早39因其具有高产优质和高抗稻瘟病的特点，连续6年被农业部推荐为超级稻示范推广品种，最近几年一直被作为浙江省早稻区试的对照材料。2013年中早39连创两项浙江农业水稻高产吉尼斯纪录，成为浙江省早稻种植面积最大的品种。中早39作为骨干亲本广泛应用于早稻育种中，由中早39配制的后代材料“株两优39”也于2014年通过了国家审定。中早39作为超级早稻品种不仅表现出常年高产，生育期适中，适于多种栽培模式，而且高抗稻瘟病。在2008-2009年浙江省早稻区域试验中，中早39的稻瘟病抗性为抗或高抗。近几年中早39作为浙江省早稻区域试验对照品种其抗瘟性鉴定结果为高抗或抗。前期发明中我们采用来自全国12个省市的146个菌株对中早39进行了稻瘟病抗谱测定，结果表明中早39对籼型小种的平均抗谱为82.9％，对粳型小种的平均抗谱为71.2％。中早39对不同省市的稻瘟病菌株的抗谱是不一致的，对浙江、贵州和广西的菌株抗谱分别为92.9％、93.1％和100％，说明中早39在这3个省份可以作为稻瘟病抗性育种的抗源使用，为中早39的区域推广提供了理论参考依据。

抗病基因是抗性育种的基础。鉴定、定位和克隆广谱抗稻瘟病基因，对深入理解水稻广谱抗病的分子机制，培育广谱和持久抗病品种，持续有效控制稻瘟病具有重要意义。目前水稻品种稻瘟病抗性改良，采取的主要方法是将待改良材料与抗病材料杂交后回交，并通过系统选育和抗性鉴定筛选抗病后代。然而，对抗病材料中含有的抗性基因和这些抗性基因对生产上流行的菌株的抗病能力等认识的匮乏，造成抗病亲本的选择具有较强的盲目性，这进一步影响了抗病育种的效率和成效。尽管中早39自审定以来，在推广过程中表现出较强的稻瘟病抗性，然而，结合“基因对基因假说”和田间育种实践，新的致病性强的稻瘟病流行生理小种克服中早39稻瘟病抗性的风险依然存在，而且随着中早39推广时间的延长，这种风险越来越高。因此，鉴定中早39中的稻瘟病抗病基因有利于明确中早39的稻瘟病抗性基础，为进一步的抗性育种利用提供理论依据。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种鉴定超级早稻中早39稻瘟病抗性基因的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴定超级早稻中早39稻瘟病抗性的方法，包括下述步骤：

1)用侵染中早39的稻瘟病菌株接种地谷B、中早39及其系谱中的水稻品种；

2)提取待检测水稻样本的DNA；

3)利用pid2引物对所提取的DNA进行PCR扩增；

4)对PCR扩增产物进行测序，并将测序后的DNA序列经BioEdit软件人工校对和手工修改，并完成序列拼接，制备得到含有pid2等位基因的水稻样本DNA序列；将pid2等位基因片段转换为氨基酸序列；

5)结果判读：

将pid2等位基因片段的氨基酸序列与参考氨基酸序列(PID2：ACR15163.1)进行比较；

如果pid2等位基因的氨基酸系列具有一个非同义突变I441M，即其第441氨基酸由异亮氨酸突变为感病蛋白的甲硫氨酸，则该待检测水稻样本为具有感病pid2等位基因的超级早稻中早39品种。

进一步地，pid2引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的pid2 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pid2 R引物。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本研究利用稻瘟病抗性鉴定、稻瘟病抗性基因分子标记检测和测序的方法，分析了中早39稻瘟病持久抗性的遗传基础。结果表明：中早39、金早47和中组3号对浙江省和江西省内主导生理小种均表现出高抗水平；中早39、金早47和中组3号对研究中用到的7个稻瘟病抗性基因分子标记均呈阳性条带；中早39与金早47、中组3号的抗谱完全相同。中早39与金早47、中组3号无论是表型还是基因型都完全一致，说明中早39对生理小种14-754和16-754的稻瘟病抗病表现经中组3号，来源于金早47。

2)稻瘟病抗性基因Pid2的分子序列测定结果表明，中早39系谱中的供试材料均含有Pid2抗病等位基因。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明超级早稻中早39系谱图；

图2是本发明稻瘟病抗性基因特异性分子标记检测；其中，1-9分别代表：浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号、陆早青1号、金早47、中组3号、嘉育253和中早39；

图3是本发明氨基酸序列比对分析。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

1材料与方法

1.1实验材料

中早39(由中组3号和嘉育253杂交选育而来(China rice data center.http://www.ricedata.cn/variety/varis)。追溯其系谱结合各品种的田间抗性表现，我们推测中早39对稻瘟病的抗性是经由中组3号来自金早47，但是缺乏理论依据)、嘉育253、中组3号、金早47(金华市农科所用中87-425/陆青早1号作亲本，选育而成，田间表现高抗稻瘟病)、丽江新团黑谷(LTH)、原丰早和C039为中国水稻发明所水稻生物学国家重点实验室保存。浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号和陆早青1号为中国水稻发明所水稻种质资源库魏兴华发明员提供。本发明中用到的稻瘟病菌株均由本实验室收集、分离、鉴定和保存。丽江新团黑谷(LTH)、原丰早和C039作为稻瘟病鉴定的高感稻瘟病感病对照品种，超级早稻中早39系谱图如图1所示。

1.2分子检测

参照Warudeet al.(Warude D,Preeti C,Joshi K,et al.DNA isolation from fresh and dry plant samples with highly acidic tissue extracts.Plant MolBiol Rep,2003,21:467a-467f.)的方法提取水稻全基因组DNA，1％琼脂糖胶电泳和Nano Drop system,2000c(Thermo,USA)检测其产量和质量。25μL PCR反应体系和反应条件参照Liang et al.(Liang Y,Yan B Y,Peng Y L,et al.Molecular screening for identification of resistant genes in a germplasm(Oryza sativa L.)collection resistant to Magnaportheoryzae.Rice Sci,accepted)，每对引物的退火温度参照表2。将PCR产物上样于含GelRed的3％琼脂糖凝胶，电泳分离后于BIORAD凝胶成像仪下拍摄并保存图片。PCR产物直接送铂尚生物技术(上海)有限公司测序，每个PCR独立进行扩增并送样至少3次。

生物信息学分析：测序公司送回的DNA序列经BioEdit软件人工校对和手工修改，并完成序列拼接。编码区预测采用在线软件GeneS can(http://genes.mit.187Edu/GENSCAN.Html)and Fegenesh(htt p://linux1.softberry.com/berry.phtml？188Topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)。序列比对采用在线软件MultAli(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin)。

1.3接种鉴定

用于接种的稻瘟菌株编号为14-754、10-105、12-157、16-754和16-161，为2010-2016年间从浙江和江西两省重发病区田间采集自然发生的稻瘟病病穗，分生孢子分离、培养和接种在中国水稻发明所实验基地进行。分生孢子接种浓度(2-5)×10⁵个/ml，添加0.2％Tween-20，在水稻分蘖盛期注射接种。一周后调查发病情况，依据国家农业行业标准(水稻稻瘟病鉴定技术规范)记载病情，以发病最重的稻株作为该品种的抗性级别，每个重复中只要有2株以上感病即记为感(S)，低于2株记为抗(R)。

2结果与分析

2.1表型鉴定

如图1所示，中早39的是由中组3号和嘉育253杂交选育而来。中组3号是金早47经无性系变异选育而成。田间表现具有和金早47一致的稻瘟病抗谱。抗病表型鉴定所用的稻瘟病菌株分别采集自浙江省(14-754、10-105、12-157、16-754)和江西省(16-161)的水稻主产区，除14-754之外，均为主导流行小种。供试材料接种于2016年8月3日，一周以后的田间接种鉴定结果(表1)显示：稻瘟病生理小种14-754侵染金早47、中组3号和中早39，而其他四个小种10-105、12-157、16-754和16-161对金早47、中组3号和中早39表现非亲和，因此，金早47、中组3号和中早39的抗谱对实验中的5个生理小种完全一致。从系谱的角度来讲，稻瘟病生理小种14-754无法侵染系谱上游的浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号和陆早青1号，而从金早47开始侵染，在中组3号和中早39发病。金早47、中组3号和中早39对本发明中的5个生理小种的抗谱完全一致。作为中早39亲本之一的嘉育253除了对14-754表现感病外，2016年的浙江省主导流行小种16-754也侵染嘉育253，说明中早39对生理小种14-754和16-754稻瘟病抗病表现来源于中组3号和金早47。

表1 田间表型鉴定

田间接种鉴定结果显示中早39的抗病表型和地谷完全一致，因地谷材料中含有Pi-d2和Pi-d3，说明中早39中的Pi-d2和Pi-d3等位基因无法赋予对14-754的抗性。

表2 稻瘟病抗性基因检测和序列分析

2.2分子标记检测

如图2所示，Pi9的特异性分子标记在浙辐802、青谷矮3号、陆早青1号、金早47、中组3号和中早39中检测到阳性条带，而在其他三个供试材料中没有检测到目的条带。Pid2、Pid3、Piz和Pib四个抗性基因的特异性分子标记在9个供试材料中都检测到阳性条带。Pi36在嘉育293和嘉育253中未检测到阳性条带。Pi64在嘉育293和陆早青1号中未检测到阳性条带。值得注意的是，金早47，中组3号和中早39的基因型完全一致，本发明中所有的抗性基因分子标记都能检测到阳性条带。

2.3抗性基因序列分析

如图3所示，我们首先将中早39中Pi-d2等位基因的DNA序列跟其(Pi-d2：FJ915121)参考序列(Chen XW,Shang JJ,Chen DX,et al.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance.Plant J,2006,46:794-804.)比较，结果显示：与参考序列相比，供试材料中共检测到5个多态性位点，氨基酸多态性频率为0.00062；检测到3个单倍型，单倍型多态性频率为0.556。利用在线软件“GeneScan(http://genes.mit.187Edu/GENSCAN.Html)and Fegenesh(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？188 Topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)”进行编码区预测，利用BioEdit软件将CDS序列转换为氨基酸系列，与参考氨基酸序列(PID2：ACR15163.1)相比，供试材料中共检测到两个非同义突变：D95N和H686R。其中D95N由地谷B中的天冬氨酸突变为天冬酰胺，且仅仅在金早47中检测到；而H686R出现在所有的供试材料中，由地谷B中的组氨酸突变为精氨酸。

3讨论

在水稻抗病育种实践中，明确抗病亲本中抗性基因型有助于更有目的的对其加以利用。对中早39的抗稻瘟病的遗传背景发明，有助于从分子水平了解抗性基因在中早39中的来源与分布情况，为水稻稻瘟病抗性育种提供理论支持。

本发明中，分子标记检测结果表明中早39中含有本发明中用到的所有抗性基因Pi9、Pid2、Pid3、Piz、Pi64和Pib，从一个方面解释了中早39具有持久和广谱的稻瘟病抗性的原因。金早47和中组3具有跟中早39完全一致的基因型，说明这三个材料的稻瘟病抗性在分子标记的角度来源一致。田间接种鉴定的结果表明金早47、中组3和中早39具有相同的抗谱，说明这三个材料在稻瘟病抗性表型是相同的。田间接种鉴定结果含有Pi-d2和Pi-d3的地谷B具有与中组3号，金早47和中早39完全一致的抗谱，对稻瘟病生理小种14-754表现感病，对其他四个生理小种表现抗病，说明14-754可以侵染Pi-d2和Pi-d3两个抗性基因。

中早39和春江糯遗传群体定位结果表明中早39在Pi-d2所在的分子标记区间含有一个主效抗稻瘟病基因(夏令治。超级早稻中早39的抗稻瘟病遗传机理发明。2015，中国农业科学院学位论文，硕士)。Pi-d2定位于水稻第6染色体上近着丝粒区域，与RM527和RM3连锁，遗传距离分别为3.2cM和3.4cM(Corpet F.Multiple sequence alignment with hierarchical clustering.Nucl Acids Res,1988,16(22),10881-10890)。Pi-d2是单拷贝基因，编码一长度为825个氨基酸的跨膜受体蛋白激酶(RLK)，该激酶氨基端含有疏水性信号肽、B-lectin结构域、PAN域和TM域，羧基端是个典型的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(STK)。Pi-d2属于新的抗病基因类型，其抗感差异是因一个单碱基突变造成的，即抗病蛋白的第441氨基酸由异亮氨酸(I)突变为感病蛋白的甲硫氨酸(M)。Pi-d2是组成型表达，我们采用序列测定的方法拿到了供试材料中Pi-d2等位基因。序列分析表明，中早39中的Pi-d2等位基因与参考序列相比具有一个非同义突变H686R，且这个突变普遍存在于所有的供试材料中。在35个亚洲栽培稻和6个野生稻中检测到三个非同义突变S321L、I441M和H686R，其中H686R在所有的供试材料中均被检测到，说明非同义突变H686R是普遍存在的(Li JB,Sun YD,Liu H,et al.Natural variation of rice blast resistance gene Pi-d2.Genetics and Molecular Research,2015,14(1):1235-1249)。本发明中，所有的供试材料在第441个氨基酸均为异亮氨酸(I)，所以均为抗病Pid2等位基因。稻瘟病菌14-754使供试材料包括中早39、中组3号、金早47和地谷B的抗病Pid2等位基因失去抗性，而浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号、陆早青1号中可能存在其他的抗性基因，对14-754表现抗病。后续实验可采用分子标记辅助选择和稻瘟病生理小种14-754接种鉴定相结合的方法，将这5个材料中的抗性基因导入到中早39中，以提高其抗谱。抗病Pid2等位基因是否单独或者跟其他的抗性基因一起赋予中早39持久稻瘟病抗性需要进一步的功能验证实验加以佐证。

本发明从田间稻瘟病接种鉴定、稻瘟病抗性基因分子标记检测和抗性基因测序分析3个方面证明，中早39对生理小种14-754和16-754的稻瘟病抗病表现经中组3号，来源于金早47。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种鉴定超级早稻中早39稻瘟病抗性基因的方法

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