本发明涉及一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用。
背景技术：
在正常生长条件下，水稻的产量通常由粒重，有效分蘖数和每穗粒数直接决定。粒重或籽粒大小受到显著遗传控制，水稻作为单子叶模式植物，籽粒大小由多基因调控，目前已克隆了较多影响水稻籽粒大小的数量性状位点基因(qtl)。同时，水稻产量也受到环境的影响，恶劣的环境如盐碱、干旱、病害等会导致严重减产。在逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。植物对病害的调控机制更为复杂，与非生物逆境既有关联，又有极大的不同，不同病原菌的致病机理也并不相同，因此，抗病基因克隆显得更具有挑战性和重要意义。
提高作物产量和抗性是育种家长期追求的目标。目前，大多数产量和抗性相对平衡的品种都是通过传统育种选育而来。利用产量高的一个亲本品种与另外一个抗性强的亲本品种通过杂交，在后代选育同时具有高产和高抗的植株，进一步进行必要的回交选育，最终将一个亲本中的抗性或产量遗传位点导入到另外一个目的品种中，达到改良的目的。随着高产高抗位点的克隆鉴定，在此过程中越来越多的通过分子标记辅助进行选育。高产高抗通常由多个遗传位点控制，通过设计各个位点的分子连锁标记，可相对快速的将目标高产或高抗位点进行分子聚合。除此之外，在了解某一个基因的功能前提下，利用转基因技术操纵某个基因或对某个基因进行编辑也可快速对目标品种进行改造。
传统育种往往是经验育种，育种家需要有足够的经验积累，因此存在一定的盲目性，并且周期长，工作量大。特别是对产量和抗性有多方面的要求时，更需要扩大育种规模，包括目标亲本和筛选群体，在此基础上进行多点多年测试以获得期望的高产多抗品种。虽然分子标记辅助选育能一定程度上提高效率，但一方面目前克隆到的基因仍然相对较少，而在已经克隆的基因中，很多位点往往已经在传统育种过程中被利用，人们只是找到了这些被利用的位点，而真正可供利用的有效的分子标记并不多，另一方面由于多基因的互作效应往往非常复杂，遗传关系并不清楚，即便经过耗时费力的聚合后，最终也很难达到预期的目标。最后，通过单一位点的基因操纵可以定向改造某一性状，但很难同时调节抗性和产量以满足多方面的改造需求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用。
本发明提供的蛋白质，获自水稻，命名为ago2蛋白，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
为了使(a)中的ago2蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
上述(b)中的ago2蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的ago2蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述ago2蛋白的基因(ago2基因)也属于本发明的保护范围。
所述ago2基因为如下(1)-(4)中任一所述的dna分子：
(1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；
(2)序列表中序列1所示的dna分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的dna序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子；
(4)与(1)或(2)或(3)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。
上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述ago2基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有ago2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用ago2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用ago2基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
所述重组表达载体可为将pcambia2300-35s-egfp载体的多克隆位点中插入了序列表的序列1的自5′端第1-3102位核苷酸所示的dna分子得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将pcambia2300-35s-egfp载体的xmai和xbai酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-3102位核苷酸所示的dna分子得到的重组质粒。
本发明还保护ago2蛋白或ago2基因的应用，为如下(c1)和/或(c2)：
(c1)调控植物产量；
(c2)调控植物耐逆性。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将ago2基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(d1)和/或(d2)所述表型：
(d1)产量高于所述目的植物；
(d2)耐逆性高于所述目的植物。
所述方法中，所述ago2基因可以通过以上任一所述重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是提高目的植物中ago2蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(d1)和/或(d2)所述表型：
(d1)产量高于所述目的植物；
(d2)耐逆性高于所述目的植物。
以上任一所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如中花11水稻。
本发明还保护ago2蛋白或ago2基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的为选育产量高和/或耐逆性高的植物。
以上任一所述耐逆性具体可为耐盐性和/或抗病性。所述抗病性具体可为白叶枯病抗性和/或黑条矮缩病抗性。
以上任一所述所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如中花11水稻。
本发明的发明人通过实验证明，ago2基因在水稻(中花11背景)中过表达后可促进水稻籽粒大小与粒重，相对于野生型，转基因植株粒长增加，百粒重提高可达20％-30％；同时植物对高盐胁迫及白叶枯病菌及矮缩病的抗性都显著增强，在200mm氯化钠盐溶液中培养，在野生型接近100％死亡后，转基因植株存活率可达50％-80％；接种水稻黑条矮缩病毒后，转基因植株生长优于野生型，并且利用抗体检测病毒蛋白，转基因植株病毒积累显著下降。接种白叶枯病菌后，转基因植株对多达8个白叶枯生理小种都表现出一定抗性。本发明通过对单个基因的转基因即可达到同时增产高抗的目的，并对病害与盐胁迫均具有抗性，效果显著，为高产高抗作物育种提供了新的遗传位点。
附图说明
图1为野生型和转基因植株的ago2基因相对表达量、籽粒大小和粒重统计结果。
图2为野生型和转基因植株的盐胁迫抗性检测结果。
图3为野生型和转基因植株的白叶枯病抗性检测结果。
图4为野生型和转基因植株的黑条矮缩病抗性检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
中花11：参考文献：“xiaoy,liud,zhangg,tonghandchuc(2017)brassinosteroidsregulateofp1,adltinteractingprotein,tomodulateplantarchitectureandgrainmorphologyinrice.front.plantsci.8:1698.doi:10.3389/fpls.2017.01698”；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
pcambia2300-35s-egfp载体：参考文献：“xiaoy,liud,zhangg,tonghandchuc(2017)brassinosteroidsregulateofp1,adltinteractingprotein,tomodulateplantarchitectureandgrainmorphologyinrice.front.plantsci.8:1698.doi:10.3389/fpls.2017.01698”；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
农杆菌agl1：北京博迈德基因技术有限公司。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、ago2蛋白及其编码基因的获得
对水稻全长基因进行序列分析、区段截取和功能验证，得到候选克隆，测序得到目标克隆的全长序列，如序列表中序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质。
将序列表的序列2所示的蛋白质命名为ago2蛋白，由1034个氨基酸残基组成。将ago2蛋白的编码基因命名为ago2基因。ago2基因编码区如序列表中序列1所示。
实施例2、ago2基因过表达转基因植株的获得
1、提取野生型水稻中花11幼苗的总rna，并反转录为cdna。
2、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物ago2fl-f和引物ago2fl-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
ago2fl-f:5’-cccgggatggagcacgagcgcggtg-3’；
ago2fl-r:5’-tctagagatgaagaacatgttgtccaccagag-3’。
引物ago2fl-f和引物ago2fl-r中，下划线分别为xmai和xbai酶切位点。
3、采用限制性内切酶xmai和xbai双酶切步骤2得到的pcr扩增产物，回收酶切产物。
4、采用限制性内切酶xmai和xbai双酶切pcambia2300-35s-egfp载体，回收约10kb的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pcambia2300-35s-egfp-ago2。根据测序结果，对重组载体pcambia2300-35s-egfp-ago2进行结构描述如下：将pcambia2300-35s-egfp载体的xmai和xbai酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-3102位核苷酸所示的dna分子。
6、采用步骤5得到的重组载体pcambia2300-35s-egfp-ago2转化农杆菌agl1，得到重组菌。参照文献“hieiy,ohtas,komarit,kumashirot.efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj1994；6:271–82”中的方法将重组菌转化中花11愈伤组织，具体如步骤7-14所示。
7、将步骤6得到的重组菌接种于含有50mg/ml卡那霉素和50mg/ml利福平的yeb液体培养基中，200rpm，暗培养3天，得到重组菌悬液，4,000rpm离心3min收集沉淀。
8、采用含有0.1mm乙酰丁香酮的aam液体培养基重悬步骤7得到的沉淀，28℃，150rpm摇床避光培养至od600nm＝0.4，得到侵染液。
9、挑选生长状态良好、颗粒状中花11愈伤组织，浸入步骤8得到的侵染液中，28℃、150-200rpm培养20min，然后将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到nb固体培养基上，26℃暗培养2-3天。
10、完成步骤9后，将愈伤组织接种于含150mg/lg418和400mg/l头孢霉素的nb固体培养基上，26℃暗培养3.5周。
11、完成步骤10后，将成活的愈伤组织转入含有200mg/lg418和200mg/l头孢霉素的nb固体培养基上，26℃暗培养3周。
12、完成步骤11后，将成活的愈伤组织转入含有200mg/lg418的分化培养基(nb基本培养基、2mg/l6-ba、1mg/lnaa)上，26℃、弱光(光强约150umol/m2.s)培养得到再生植株。
13、完成步骤13后，将再生植株在含200mg/lg418的壮苗培养基(1/2ms、0.5mg/lnaa、0.25mg/lmet)上26℃、弱光(光强约150umol/m2.s)培养至生根后转移至温室中培养，得到t0代转基因植株。
14、提取步骤13得到的t0代转基因植株叶片总dna为模板，采用引物npt-f和引物npt-r组成的引物对进行pcr扩增，筛选得到t0阳性转基因植株(阳性植株pcr扩增产物大小为582bp)。
npt-f:5’-tccggtgccctgaatgaact-3’；
npt-r:5’-ggcgataccgtaaagcacga-3’。
t0代植株自交，得到t1代植株。t1代植株自交，得到t2代植株。
将t1代植株和t2代植株也采用引物npt-f和引物npt-r进行鉴定，如果对于某一t0代植株，其抽样检测的t1代植株和t2代植株的pcr鉴定结果均为阳性，该t0代植株及其自交后代为一个纯合的过表达转基因株系。
15、提取水稻中花11(zh11)和步骤14得到的若干过表达转基因株系的t2代植株叶片总rna，并反转录为cdna；以cdna为模板，采用qrt-pcr的方法检测ago2基因的表达情况(以actin基因为内参基因)，采用引物act-f和引物act-r组成的引物对检测actin基因的表达，采用引物ago2-f和引物ago2-r组成的引物对检测ago2基因的表达。
ago2-f:5’-agccaaggtcaaattgttgg-3’；
ago2-r:5’-ctccttgtctgaagccttgg-3’；
act-f:5’-tgctatgtacgtcgccatccag-3’；
act-r:5’-aatgagtaaccacgctccgtca-3’。
结果如图1b所示。图1b中，纵坐标为ago2基因相对表达量。结果表明，与野生型相比，ago2基因在5个转基因株系(a2ox-4、a2ox-7、a2ox-8、a2ox-14、a2ox-18)中表达量均升高。
16、采用pcambia2300-35s-egfp载体替代重组载体pcambia2300-35s-egfp-ago2，按照步骤6-步骤14进行操作过程中，得到空载体植株。
实施例2、ago2基因过表达转基因植株的表型分析
一、籽粒大小与粒重统计
待测植株：野生型中花11(zh11)、转基因株系(a2ox-4、a2ox-7、a2ox-8、a2ox-14、a2ox-18)的t2代植株、转空载体植株。
对待测植株成熟期收获的籽粒大小和粒重进行统计，结果如图1a、图1c和图1d所示。图1a位表型观察结果。图1c为粒长统计结果，纵坐标为粒长(mm)。图1d位百粒重统计结果，纵坐标为百粒重(g)。
结果表明，相对于野生型，转基因株系粒长粒重均显著增加，特别是a2ox-4和a2ox-8两个株系粒重增加最为明显，百粒重分别增加30.8％和22.7％。转空载体植株表型与野生型无显著差异。
二、抗盐胁迫检测
将野生型中花11(zh11)和转基因株系(a2ox-4、a2ox-7、a2ox-8、a2ox-14、a2ox-18)的t2代植株的种子在37℃黑暗浸种萌发后，每个转基因株系与野生型各对半铺于去掉底部的96孔塑料板中，每个株系设4个重复，在光照培养箱中使用1/2ms液体培养基培养10天(温度30℃，光照12h/黑暗12h，每2天换新鲜1/2ms液体培养基)，第10天换成含有200mm氯化钠的1/2ms液体培养基，继续培养10天，观察表型。
结果如图2所示。结果表明，盐胁迫下野生型接近完全死亡，而转基因株系大部分仍然存活，存活率达到50％-80％，采用转空载体植株替代转基因株系植株进行试验，存活率与野生型无显著差异，说明ago2基因可以提高植物的盐胁迫抗性。
三、白叶枯病抗性检测
待测植株：野生型中花11(zh11)、转基因株系(a2ox-4、a2ox-8)的t2代植株、转空载体植株。
检测待测植株白叶枯病抗性，检测方法和所用生物材料在“chenh,wangs,zhangq.2002.newgeneforbacterialblightresistanceinricelocatedonchromosome12identifiedfromminghui63,aneliterestorerline.phytopathology92:750–754.doi:10.1094/phyto.2002.92.7.”中记载。在水稻生长正季，将田间生长2个月的待测植株分别接种不同白叶枯生理小种共4种，用剪刀分别沾取培养好的病原菌液，减去同一发育阶段的叶片的尖部同样位置，两周后，测量叶片受侵染后的病斑长度，除以叶片长度，计算病斑相对长度。
结果如图3所示。结果表明，转基因株系感病相对长度明显低于野生型，转空载体植株与野生型无显著差异，转基因植株对各个白叶枯生理小种均具有明显抗性。
四、黑条矮缩病抗性检测
检测植株的黑条矮缩病抗性，检测方法和所用生物材料在“yuqinghe,hehongzhang,zongtaosun,junminli,gaojiehong,qisongzhu,xuebiaozhou,stuartmacfarlane,feiyanandjianpingchen.2016.jasmonicacid-mediateddefensesuppressesbrassinosteroidmediatedsusceptibilitytoriceblackstreakeddwarfvirusinfectioninrice.newphytologist.doi:10.1111/nph.14376”中记载。
1、成年无毒雌性灰飞虱接种于野生型中花11上产卵，生长10天成蛹虫后转移到已感染黑条矮缩病病毒的水稻苗上喂食4天，使其带毒，再转移到健康中花11水稻幼苗上生长12天到成年期，使用酶联免疫吸附测定法确定带毒。
2、将野生型中花11(zh11)、转基因株系(a2ox-4、a2ox-8)的t2代植株种子萌发后置于同一玻璃烧杯中在光照培养箱中水培一周，用塑料网封闭后按每棵幼苗3只昆虫放入步骤1得到的带毒灰飞虱，培养3天，之后彻底除去昆虫，将幼苗移栽到田间培养一个月，观察表型，植物表现为显著矮化，叶片发黑，即为发病症状。从侵染当天开始计算，于30天和60天分别取叶片，利用免疫杂交检测病毒蛋白含量，比较野生型与转基因株系病毒存活水平。
结果如图4所示。结果表明，转基因株系带毒量明显减少，特别是在a2ox-8株系中，采用转空载体植株替代转基因株系植株进行试验，表型和病毒蛋白含量与野生型无显著差异，说明转基因株系对病毒有抗性。
<110>中国农业科学院作物科学研究所
中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用
<160>2
<210>1
<211>3105
<212>dna
<213>水稻（oryzasativa）
<400>1
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<210>2
<211>1034
<212>prt
<213>水稻（oryzasativa）
<400>2
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151015
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