一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌ab-1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株分离自内蒙古巴彦淖尔盟酸面团中的植物乳杆菌 (Lactobaci1lusplantarum)AB-1，还涉及所述植物乳杆菌在抑制致病菌、作为食品发酵剂 或在植物生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 当今世界，食品安全问题已经被大众认为是主要的公共卫生安全问题，然而，食品 微生物污染问题是食品安全的主要问题之一。食品微生物的污染主要是细菌污染，特别是 常见致病性的单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌等细菌均 能引起食源性疾病，这一问题已经引起了公共的注意，普通的化学药物治疗方法的有使致 病菌产生抗药性和治疗效果不佳等缺陷，最近的研宄表明乳酸菌能有效的抑制致病菌生 长，因其具有稳定性、免疫性和安全性等优势，被认为是新型食品防腐剂和保健食品的研宄 热点。
[0003] 如今，消费者对于食品的需求不仅局限在味道和眼前的营养，而是更希望他们能 提供给身体超出基本营养价值以外有更针对性的健康益处。酸奶是益生菌的良好载体，不 仅能提供给人们酸奶的营养，还能通过益生菌在肠道内定植来调整肠道菌群和产生特定的 抑菌物质来抑制有害菌的存活。乳酸菌的抑制作用可能是由于产生酸性物质使不耐酸致 病菌生长繁殖受到抑制；产生类似细菌素的小分子肽类使致病菌受到抑制作用；产生溶菌 酶、过氧化氢等物质杀死潜在的病原菌。使用植物乳杆菌（L.plantarum)来抑制致病菌的 的生长和调节肠道菌群，已经在体内和体外得到证明。本发明中的植物乳杆菌主要来至于 传统发酵乳制品，其安全性是有保证的。
【发明内容】
[0004] 本发明的另一目的在于提供一种新型乳杆菌菌株，其具有优异的作为益生菌基本 性质的耐酸性、耐胆汁酸性、过氧化氢酶的稳定性、蛋白酶稳定性和温度稳定性。
[0005] 本发明的另一目的是提供用于预防和治疗肠道疾病的含有新型植物乳杆菌的组 合物。
[0006] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌广谱抑菌活性的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在农业生物农药和果蔬保鲜剂方面的应用。
[0008] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在整肠中的应用，具有良好的益生特性。
[0009] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌以作为发酵剂或添加剂在在酸奶或保健食 品中的应用。
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供一株植物乳杆菌的新菌株（L.plantarum)AB-1及 其制备方法。该菌株（L.plantarum)AB-1已于2014年09月15日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 9653。
[0011] 本发明的植物乳杆菌AB-1是经过筛选的、从内蒙古巴彦淖尔盟发酵酸面团中分 离得到、具有广谱抑菌活性的益生乳酸菌。
[0012] 本发明的植物乳杆菌AB-1通过如下方法分离得到。
[0013]a.菌株培养及分尚方法
[0014] 将采集的酸面团先进行前处理，再将样品做梯度稀释后（1(T4,1(T5,KT6)涂布于含 有放线菌酮（〇?lwt%，OXID公司）和硫酸粘菌素（0?lwt%，OXID公司）的MRS琼脂平板 培养基或者M17琼脂平板培养基（OXID公司）上，30°C厌氧培养48h~72h，挑取单菌落， 转接于TPY增菌培养液中，30°C培养24h~48h，划线接种于MRS琼脂培养基（OXID)，30°C 培养24h~48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试 验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体 培养基中，37°C培养24h~48h后，做进一步鉴定和保存。
[0015] 其中MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、 Tweeen80lml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0.02g、硫酸镁0.lg， 蒸馏水1L，调节pH至6. 2左右，琼脂15g，121°C、15min灭菌。
[0016]M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2. 5g、抗 坏血酸0. 5g、硫酸镁0. 25g、二钠甘油19g、琼脂llg、蒸馏水1L。
[0017] b?分子生物学鉴定
[0018] 将冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，30°C恒温培养24h，经TPY 传代培养2~3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000Xg 离心3min(4°C)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
[0019] 其中，TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大 豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2. 5g、磷酸二氢钾2. 5g、硫酸镁0.lg、吐温80 0. 25g、L-半胱氨酸 盐酸盐〇? 5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121°C、15min灭菌。
[0020] 采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichiacoil8-27位碱基）： 5 ' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是 1495r(对应于Escherichiacoil 1495-1515位碱基）：5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增 16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16SrRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和 系统发育关系研宄进行种属鉴定。如上从酸面团采集到的菌株显示出了与植物乳杆菌最高 的分子系统学上的亲缘关系。将上述微生物鉴定为植物乳杆菌Lplantarum。植物乳杆菌 L.plantarum的系统发育树状图见图3〇
[0021] c.形态学特性
[0022] 本发明的植物乳杆菌L.plantarumAB-1具有如下形态学特征：细胞呈直杆状，有 圆形末端，长3. 0-8. 0ym，宽0? 9-1. 2ym，呈单个、成对，或短链状出现（见图1)，有些菌能 减少硝酸盐，偶尔有些菌株表现出拟过氧化氢酶活性。
[0023] d.菌落形态特性
[0024] 本发明的植物乳杆菌L.plantarumAB-1在MRS培养基上生长形成乳白色菌落，不 透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2-1. 5mm(见图2)。
[0025] 植物乳杆菌（L. plantarum) AB-1抑菌性能测定
[0026]e.植物乳杆菌上清液的制备方法
[0027]以347株广泛采集的植物乳杆菌作为筛选本发明的具有抑制致病菌活性植物乳 杆菌的来源并进行对比，该347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学"乳品生物技术与工程"教 育部重点实验室提供，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古 国地区的传统发酵食品中，该347株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数 据库。
[0028] 把冻存管中的保藏液接种到5ml的MRS培养基中，震荡混匀，37°C恒温培养24h，连 续活化两代，用活化第二代的植物乳杆菌MRS培养液以（lX109cfU/ml)以2%的比例（V/ V)接种到全脂乳（llwt%全脂乳粉添加到89wt%无菌水中混匀后经巴氏杀菌）中，37°C恒 温培养24h，取发酵液以4000Xg离心lOmin，取上清，上清液经0. 22ym微膜过滤，-20°C冰 箱保存备用。
[0029]f.琼脂打孔扩散法测定抑菌活性
[0030] 将活化好的5株指示菌（单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7、 鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌，均由内蒙古农业大学"乳品生物技术与工程"教育部重点 实验室提供，面向公众开放）按2% (V/V)接入各自培养基中，37°C培养24h，使菌体充分富 集，以MRS为培养基用平板计数法计数。得到计数结果后，将肠道致病菌菌液制成104、105、 1〇 6、1〇7的指示菌细胞悬液，以乳酸调节pH为4. 0的MRS无细胞悬液为标准，利用琼脂打孔 扩散法，确定抑菌圈最易观测的肠道致病菌的生长量作为指示菌悬液的最佳浓度，抑菌效 果见表1。
[0031] 表1不同浓度指示菌的抑菌效果
[0032]
[0033]
【主权项】
1. 一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)AB_l，该菌株于 2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏， 保藏号为 CGMCC No. 9653。
2. 含有如权利要求1所述的植物乳杆菌的组合物。
3. 权利要求1所述的植物乳杆菌抑制致病菌的应用，其特征在于所述制致病菌为： (1) 大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单细胞李斯特氏菌； 和 (2) 甜瓜枯萎菌和甜瓜疫霉菌。
4. 权利要求1所述的植物乳杆菌作为发酵剂或食品添加剂在食品中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述食品是发酵食品。
6. 权利要求1所述的植物乳杆菌在植物生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌，该菌被命名为Lactobacillus plantarum AB-1，已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9653。本发明中的植物乳杆菌在全脂乳培养基中和该菌参与的复配发酵酸奶中均表现出较强广谱抑菌特性，且该菌株参与酸奶发酵时，能有效增强发酵酸奶的风味特征，复配发酵酸奶上清经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后依然能表现出较好的广谱抑菌特性。该菌在胃肠液中较高的存活率还证明其有优良的益生特性，在人体内具有较强的存活能力。另外，该菌对甜瓜枯萎和甜瓜疫霉菌具有较好的抑菌活性。CGMCC No.965320140915
【IPC分类】C12R1-25, A01P3-00, A61P1-00, A23L1-30, A23C9-123, A01N63-00, A61K35-747, C12N1-20
【公开号】CN104830731
【申请号】CN201510232204
【发明人】陈永福, 张和平, 李常坤
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月8日