最低程度上表达来自ChAd55、ChAd73、ChAd83、 ChAdl46、ChAdl47、PanAdl、PanAd2或PanAd3腺病毒的腺病毒El基因的包装细胞或细胞 系。为此可使用诱导型或组成型启动子。例如在本文描述的实施例中提供了启动子的实 例。这样的表达E1的细胞系可用于产生重组腺病毒E1缺失的载体。此外，或可选地，本发 明提供了表达一种或多种腺病毒基因产物，例如E1a、Elb、E2a和/或E4 0RF6，优选Ad5E4 〇RF6(又见以下实施例）的细胞系，其可使用与在产生重组腺病毒载体中使用的基本上相 同的程序构建。可使用这样的细胞系反式补充缺失了编码这些产物的必需基因的腺病毒载 体或提供包装辅助依赖病毒（例如腺相关病毒）所必需的辅助功能。
[0268] 通常，当通过转染递送本发明的包含例如小基因的载体时，以约0.lyg至约 100ygDNA，和优选约10至约50ygDNA的量将载体递送至约lx104个细胞至约lx10 3 个细胞，和优选约1〇5个细胞。然而，可根据这些因素如选定的载体、递送方法和选定的宿 主细胞来调节载体DNA与宿主细胞的相对量。载体至宿主细胞的引入可通过本领域已知的 或本文公开的任意方法完成，包括转染和感染，例如使用CaPOjf染或电穿孔。
[0269] 为了构建和组装期望的包含小基因的重组腺病毒，在一个实施例中如本领域熟知 的可在辅助病毒的存在下将载体体外转染至包装细胞系，从而允许辅助病毒和载体序列之 间发生同源重组，使载体中的腺病毒转基因序列能够复制和包装进病毒粒子衣壳，得到重 组腺病毒载体颗粒。本发明的重组腺病毒可用于例如将选定的转基因转移至选定的宿主细 胞。
[0270] 在本发明的腺病毒的优选实施方案中，腺病毒在人受试者中具有低于5%的血清 阳性率和优选地在人受试者中没有血清阳性率，最优选在以前没有接触黑猩猩腺病毒的人 受试者中没有血清阳性率。在此上下文中优选人受试者属于选自欧洲、非洲土著人、亚洲、 美洲土著人和大洋洲土著人的种族群。鉴定人受试者的种族起源的方法是本领域包括的 (见例如冊 2〇〇3/1〇2236)。
[0271] 在根据本发明的重组腺病毒的另一个优选实施方案中，腺病毒DNA能够进入哺乳 动物靶细胞，即其具有感染性。本发明的感染性重组腺病毒可用作疫苗和用于基因治疗，也 如下述。因此，在另一个实施方案中，优选重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。优选 地，靶细胞是哺乳动物细胞，例如黑猩猩细胞、啮齿类细胞或人细胞。例如，用于递送至靶 细胞的分子可为如本文定义的表达盒。将表达盒引入腺病毒基因组的方法是本领域熟知 的（见例如上面提供的文献引用）。在一个实施例中包含编码例如小基因或反义基因的表 达盒的本发明的重组腺病毒可通过下述方法产生：用所述表达盒替换选自E1A、E1B、E2A、 E2B、E3和E4的腺病毒基因组区域。通过与已知和有注释的腺病毒基因组例如人Ad5的基 因组的比对可容易地鉴定本发明的腺病毒的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4(见： BirgittT3uber和ThomasDobner,Oncogene(2001) 20,p. 7847 - 7854 ;和又见：Andrew J.Davison,等人，"Geneticcontentandevolutionofadenoviruses'，，Journalof GeneralVirology(2003) ,84,p.2895 - 2908)。在如下实施例1和2和图4中也提供了如 何产生包含用于递送至靶细胞的分子的修饰的腺病毒的非限制性实例。
[0272] 用于递送至靶细胞的分子优选地为多核苷酸，但也可为优选具有治疗或诊断活性 的多肽或小化学化合物。在一个特别优选的实施方案中，用于递送至靶细胞的分子是包含 腺病毒5'反向末端重复序列（ITR)，基因例如SEQIDNO: 1和3'ITR的多核苷酸。对技术 人员而言显而易见地，必须选择分子的分子大小使当重组腺病毒在例如包装细胞系中产生 时衣壳可在分子周围形成并包装分子。因此，优选地基因是小基因，其可具有例如多达7000 和最多可达8000个碱基对。
[0273] 在优选的实施方案中，在根据本发明的重组腺病毒中包含的用于递送至靶细胞的 分子是编码抗原蛋白质或其片段的多核苷酸。抗原蛋白质或其片段能够在哺乳动物中引起 免疫应答，在一个特别优选的实施方案中可为如实施例中所示的HIV的gag蛋白并由根据 SEQIDNO: 1的多核苷酸编码。
[0274] 在一个特别优选的实施方案中，本发明的重组腺病毒是已在ECACC(欧洲动物 细胞保藏中心（EuropeanCollectionofCellCulture)，PortonDown,Salisbury,SP4 0JG，UK)保藏的腺病毒并具有选自 08110601 (ChAd83)、08110602 (ChAd73)、08110603 (ChAd5 5)、08110604(ChAdl47)和 08110605(ChAdl46)的保藏号。在 2008 年 11 月 6 日由Okairos AG,Elisabethenstr. 3, 4051Basel,Switzerland完成了上述腺病毒毒株（腺病毒科，哺乳 动物腺病毒属（拉丁文名：Mastadenovirus，Adenoviridae))的保藏。
[0275] 将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的《布达佩斯条约》维持这些保 藏。仅为本领域技术人员的便利进行这些保藏，根据35U.S.C. 112并不承认保藏是必须的。 除了根据37C.F.R. 1. 808 (b)在授予专利权方面规定的要求以外，不能取消地去除对公众 获得保藏材料的所有限制。
[0276] 本发明的重组腺病毒的另一个优选的实施方案是由选自08110601(ChAd83)、 08110602 (ChAd73)、08110603 (ChAd55)、08110604 (ChAdl47)和 08110605 (ChAdl46)的腺病 毒衍生的腺病毒。优选地由上述保藏的腺病毒衍生的腺病毒已通过在其基因组中引入功能 性缺失、缺失或修饰被改变，例如以得到不能复制的腺病毒和/或在能够在宿主细胞中表 达转基因的腺病毒。例如，选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因的一个或多个基因可被缺 失、使其无功能和/或可被如上概述的表达盒替换。此外，可引入一个或多个另一种腺病毒 的基因，优选地用于缺失的基因。技术人员熟知如何在保藏的毒株中引入这些基因组改变。 在这方面，上面已经描述了产生包含保藏毒株的优选修饰的、用于递送至靶细胞的分子的 修饰的腺病毒的方法。
[0277] 在另一个方面提供了组合物，其包含免疫佐剂和以下（i)至（iv)中至少一种：
[0278] (i)根据本发明的分离的蛋白质；
[0279] (ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
[0280] (iii)根据本发明的载体；
[0281] (iv)根据本发明的重组腺病毒；
[0282] 和任选地药学上可接受的赋形剂。
[0283] 根据本发明的包含佐剂的组合物可用作疫苗，例如用于人受试者。本文中也被简 称为"佐剂"的免疫佐剂与单独施用抗原相比加快、延长和/或增强对抗原/免疫原的免疫 应答的质量和/或强度，因此减少在任意给定疫苗中必需的抗原/免疫原的量和/或对目 的抗原/免疫原产生足够免疫应答所必需的注射频率。
[0284] 在根据本发明的组合物的上下文中可使用的佐剂实例是氢氧化铝（矾）的凝胶样 沉淀物；A1P04;铝胶；来自革兰氏阴性细菌外膜的细菌产品，特别是单磷酰脂质A(MPLA)、 脂多糖（LPS)、胞壁酰二肽和其衍生物；弗氏不完全佐剂；脂质体，特别是中性脂质体，包含 组合物和任选地包含细胞因子的脂质体；非离子嵌段共聚物；ISC0MATRIX佐剂（Drane等 人，2007);包含CpG二核苷酸（CpG基序）的未甲基化DNA，特别是具有硫代磷酸（PT0)骨架 (CpGPTO0DN)或磷酸二酯（P0)骨架（CpGP0 0DN)的CpG0DN;合成的脂肽衍生物，特别是 Pam3Cys;脂阿拉伯甘露聚糖；肽葡聚糖；酵母聚糖；热休克蛋白（HSP)，热别是HSP70;dsRNA 和其合成衍生物，特别是PolyI:P〇lyC;聚阳离子肽，特别是聚-L-精氨酸；紫杉酚；纤连 蛋白；鞭毛蛋白；咪唑并喹啉；具有佐剂活性的细胞因子，特别是GM-CSF，白介素-(IL-)2、 IL-6、IL-7、IL-18,I和II型干扰素，特别是干扰素-y，TNF-a;25_二羟维生素D3 (骨化 三醇）；和合成的寡肽，特别是MHCII呈递肽。可使用包含聚氧化乙烯（P0E)和聚氧化丙烯 (POP)的非离子嵌段共聚物例如P0E-P0P-P0E嵌段共聚物作为佐剂（Newman等人，1998)。 此类型的佐剂对包含核酸作为活性成分的组合物特别有用。
[0285] 任选地，可使用各种药学上可接受的赋形剂。优选的药学上可接受的赋形剂在下 面讨论根据本发明的用途时描述。
[0286] 特定受体的活化可刺激免疫应答。这些受体是熟练技术人员已知的并包括例如细 胞因子受体，特别是I型细胞因子受体，II型细胞因子受体，TNF受体；和担当转录因子的 维生素D受体；和Toll样受体 1 (TLR1)、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7 和TLR9。 这些受体的激动剂具有佐剂活性，即为免疫刺激性的。在优选的实施方案中，本发明的组合 物的佐剂可为一种或多种Toll样受体激动剂。在更优选的实施方案中，佐剂是Toll样受 体4激动剂。在特别优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体9激动剂，其优选地由核苷酸 tccatgacgttcctgacgtt(SEQIDN0:2)编码。
[0287] 在另一个方面，本发明提供了细胞，优选非猿细胞，其包含以下至少一种：
[0288] (i)根据本发明的分离的蛋白质；
[0289] (ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
[0290] (iii)根据本发明的载体；
[0291] (iv)根据本发明的重组腺病毒。
[0292] 细胞可选自细菌细胞例如大肠杆菌细胞，酵母细胞例如酿酒酵母或毕赤酵母，植 物细胞，昆虫细胞例如SF9或Hi5细胞，或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的优选实例是中国 仓鼠卵巢（CH0)细胞，人胚胎肾（HEK293)细胞，HELA细胞，人肝癌细胞（例如Huh7. 5)， IfepG2人肝癌细胞，H印3B人肝癌细胞等等。
[0293] 如果细胞包含根据（ii)的分离的多核苷酸，细胞中存在的此多核苷酸可⑴本身 自由地分散，或（ii)整合至宿主细胞基因组或线粒体DNA。
[0294] 在另一个优选的实施方案中，细胞是表达至少一种选自Ela、Elb、E2a、E2b、E4、Ll、 L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞，优选293细胞或PER.C6?细胞。
[0295] 也提供了根据本发明的分离的多核苷酸、根据本发明的分离的蛋白质、根据本发 明的载体、根据本发明的重组腺病毒和/或根据本发明的药物组合物用于疾病的治疗或预 防的用途。
[0296]已证明了腺病毒载体作为疫苗载体的巨大潜力。临床前和临床研究已证明使用此 系统在载体设计、稳健的抗原表达和保护性免疫方面的可行性。因此，优选的实施方案是根 据本发明的用途，其中治疗或预防是例如对人受试者的接种。本领域包含的大量文献提供 了如何使用腺病毒和将其制备用于接种的详细说明，这是技术人员已知的。
[0297]如果用途是接种，可以免疫学和/或预防有效剂量即优选lx10s至lx10 11个病 毒颗粒（即lx10s、5x10s、lx109、5x109、lx101Q、2.5x101Q或 5x1〇10个颗粒）施用本发 明的重组腺病毒。此外，对需要加强的接种，优选应用如上定义的"异源引发-加强"方法。 此外，当在疫苗中使用根据本发明的分离的多核苷酸、根据本发明的分离的蛋白质、根据本 发明的载体、根据本发明的重组腺病毒和/或根据本发明的药物组合物时，优选所述疫苗 包含佐剂。优选的免疫佐剂已在本文中描述并可在这样的疫苗中使用。
[0298]使用根据本发明的多核苷酸或重组腺病毒蛋白质或其片段制备的重组腺病毒可 用于转导多核苷酸例如DNA至宿主细胞。因此，优选地可制备虽然有感染性即能够进入宿 主细胞但复制缺陷的腺病毒以在宿主细胞中表达任意定制的（custom)蛋白质或多肽。因 此，在优选的实施方案中，在根据本发明的用途中列举的治疗是基因治疗。如果在基因治 疗中使用根据本发明的分离的多核苷酸、分离的蛋白质、载体、重组腺病毒和/或药物组合 物并对待治疗的受试者施用，优选其以足够大的剂量施用从而使治疗的结果是患者的一个 或多个细胞被转染，即转导。如果通过本文公开的任意优选施用方法施用根据本发明的重 组腺病毒和/或药物组合物，优选地施用优选lx10s至5x1011个病毒颗粒（即lx10s、5x 10s、lx109、5x109、lx1010、2.5x1010、5x1010、lx1011，或最优选 5x1011 个颗粒）的有效 剂量。在优选的实施方案中，在本发明的重组腺病毒中包含的优选异源多核苷酸能够在受 试者的宿主细胞中表达蛋白质或多肽，其中所述蛋白质或多肽包含影响蛋白质或多肽从所 述宿主细胞中分泌的信号肽。例如，可使用本发明的腺病毒治疗需要特定蛋白质的患者，所 述腺病毒包含编码该蛋白质的可分泌形式的cDNA。
[0299]在本发明的用途的另一个实施方案中，将根据本发明的分离的多核苷酸、分离的 蛋白质、载体、腺病毒和/或药物组合物（以下称为根据本发明的药物）配制为进一步包含 一种或多种药学上可接受的稀释剂；载体；赋形剂，包括填充料、粘结剂、润滑剂、助流剂、 崩解剂和吸附剂；和/或防腐剂。
[0300]可通过各种熟知的途径施用本发明的药物，包括口服、直肠、胃肠内和胃肠外施 用，例如静脉内、肌肉内、鼻内、皮内、皮下和类似的施用途径。优选胃肠外、肌肉内和静 脉内施用。优选地将根据本发明的药物配制为糖浆、输注或注射溶液、药片、胶囊、囊片 (capslet)、锭剂、脂质体、栓剂、膏药、创可贴、延迟胶囊、粉末或缓释制剂。优选地稀释剂为 水、缓冲液、缓冲的盐溶液或盐溶液和载体优选地选自可可油和vitebeso1e。
[0301]用于在本发明的用途中施用根据本发明的药物的特别优选的药物形式是适于可 注射的用途的形式并包含用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌水溶液或分散剂 和无菌粉末。通常，这样的溶液或分散剂将包含溶剂或分散介质，其包括例如水缓冲的水 溶液，例如生物可相容的缓冲液，乙醇，多元醇，例如甘油，丙二醇，聚乙二醇，其合适的混合 物，表面活性剂或植物油。
[0302]可通过本领域已知的许多技术制备输注或注射溶液，包括但不限于加入防腐 剂例如抗细菌或抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯（parabene)、氯丁醇、酚、山梨酸或硫柳汞 (thimersal)。此外，可在输注或注射溶液中加入等渗剂，例如糖或盐，特别是氯化钠。
[0303] 本发明的优选稀释剂是水、生理上可接受的缓冲液、生理上可接受的缓冲盐溶液 或盐溶液。优选的载体是可可油和vitebesole。与根据本发明的药物的多种药物形式可一 起使用的赋形剂可选自以下非限制性列表：
[0304]a)粘结剂例如乳糖、甘露醇、结晶山梨醇、二元磷酸盐、磷酸钙、糖、微晶纤维素、羧 甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等；
[0305] b)润滑剂例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸妈、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、 甘油酯和硬脂酰延胡索酸钠，
[0306]c)崩解剂例如淀粉、croscaramellose、甲基纤维素钠、琼脂、膨润土、藻酸、羧甲基 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
[0307]其他合适的赋形剂可见AmericanPharmaceuticalAssociation出版的Handbook ofPharmaceuticalExcipients，其在本文引入作为参考。
[0308] 优选特定量的根据本发明的药物用于疾病的治疗或预防。但是应当理解取决于疾 病的严重程度、疾病的类型以及待治疗的各个患者，例如患者的一般健康状态等等，需要不 同剂量的根据本发明的药物引起治疗或预防作用。合适剂量的确定是主治医生的判断范围 内的。
[0309] 如果使用根据本发明的药物用于预防，可将其配制为疫苗。在这种情况下以上面 概述的优选和特别优选剂量优选地施用根据本发明的药物。优选地，在确定的时间段中重 复施用疫苗至少2、3、4、5、6、7、8、9或至少10次，直至接种的受试者已产生足够的针对本发 明的药物的抗体从而降低发生各个疾病的风险。在这种情况下，取决于疫苗的抗原性，所述 时间段通常是可变的。优选地所述时间段不超过4周、3个月、6个月或3年。在一个实施方 案中，如果使用根据本发明的腺病毒用于接种的目的，可将六邻体蛋白的至少一个高变结 构域替换为接种针对的各自疾病试剂的免疫原性表位。疫苗通常包含一种或多种如上概述 的佐剂。在BangariDS和MittalSK(2006)Vaccine, 24(7)，p. 849-862;又见：ZhouD,等 人，ExpertOpinBiolTher. 2006Jan;6(1): 63-72;和：FolgoriA,等人，NatMed. 2006 Feb; 12 (2): 190-7.;又见：DraperSJ,等人，NatMed. 2008Aug; 14 (8): 819-21.Epub2008 Jul27中提供了用于接种的腺病毒的用途的详细总结和与其有关的方法。
[0310] 在不背离本发明的范围下本发明的多种修改和变化对本领域技术人员而言将是 显而易见的。尽管已结合特定优选的实施方案描述了本发明，应当理解要求保护的本发明 不应当不适当地受限于这些特定实施方案。实际上，本发明旨在覆盖对相关领域技术人员 而言显而易见的实施本发明的描述方式的多种修改。
[0311] 下图仅为了说明本发明而不应被解释为限制本发明的范围，在任何方面，本发明 的范围由附加的权利要求指出。
[0312] 附图简述
[0313]图1:本发明的多个腺病毒分离株的六邻体蛋白之间的多重序列比对，使用具有 默认设置的Clustal-W。显示了所述新黑猩猩腺病毒分离株的六邻体蛋白（名为PanAdl、 PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46 和ChAdl47)。将高变结构域 1 至 7 分别 称为"HVR1-6" 和"HVR7"。
[0314]图2:腺病毒ChAd55和其他新黑猩猩腺病毒分离株（名为PanAdl、PanAd2、 PanAd3、ChAd73、ChAd83、ChAdl46和ChAdl47)的纤维蛋白之间的多重序列比对，使用具有 默认设置的Clustal-W。
[0315] 图3:腺病毒ChAd55和其他新黑猩猩腺病毒分离株（名为PanAdl、PanAd2、 PanAd3、ChAd73、ChAd83、ChAdl46和ChAdl47)的五邻体蛋白之间的多重序列比对，使用具 有默认设置的Clustal-W。
[0316] 图4:通过野生型病毒基因组和对应的穿梭质粒的同源重组构建复制缺陷的腺病 毒载体的图解。又见实施例2。
[0317] 图5:在接种了包含用于表达HIVgag蛋白（SEQIDNO: 1)的表达盒的重组腺病 毒的小鼠中的细胞介导的免疫应答。比较了重组人Ad5和黑猩猩ChAd55 (图5A)，重组人 Ad5 和倭黑猩猩PanAdl、PanAd2 和PanAd3 腺病毒（图 5B)，和重组ChAd55、ChAd73、ChAd83、 ChAdl46和ChAdl47 (图5C)的接种效力。通过用定位于Balb/C小鼠的⑶8HIVgag表位孵 育细胞，通过干扰素-yELIspot测定测量免疫应答。将结果报告为斑点形成细胞/106个 脾细胞。
[0318] 图6 :在一组欧洲来源的人血清中评估了新腺病毒载体的血清阳性率。在相同 组中平行评估了人腺病毒5型（Ad5)和黑猩猩腺病毒ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、 ChAdl47、PanAdl、PanAd2、PanAd3和CV-68的血清阳性率。将数据表示为显示免疫阳性率 的受试者的％。仅检测到针对Ad5和CV-68腺病毒的中和抗体，但没有检测到针对本发明 的新腺病毒中的任一种的中和抗体。
[0319] 图7:在图7A中显示了BALB/c小鼠的PanAdHSV免疫和在图7B中显示了BALB/ c小鼠的PanAd癌症Ag免疫。
[0320] 图8 :在引发/加强接种实验中显示了食蟹猴（Macacafascicularis)的PanAd HIVgag免疫。 实施例
[0321] 实施例1 :腺病毒的分尚和表征
[0322]ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47是从在不同的欧洲和美国机构中饲养 的健康动物中获得一组黑猩猩腺病毒。ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAdl46、ChAdl47具有与 人血清没有可检测的反应性的性质。PanAd1、PanAd2和PanAd3是从在不同的欧洲和美国机 构中饲养的健康倭黑猩猩（PanPaniscus)中分离的新腺病毒。PanAdl、PanAd2和PanAd3 具有与人血清没有可检测的反应性的性质。
[0323] 通过感染接种在96孔板中的293细胞，在第一代扩增后克隆普通黑猩猩和倭黑猩 猩腺病毒原种。通过有限稀释在第一代病毒扩增时得到的细胞裂解物进行病毒克隆。挑选 出5个分离的克隆并连续增殖。在3-4代连续扩增后，在置于5个双层细胞工厂（NUNC) (2 亿细胞/细胞工厂）的细胞上进行腺病毒的大规模制备。通过在氯化铯密度梯度上的2个 超速离心步骤从细胞裂解物中得到纯化的病毒颗粒。
[0324] 通过在1%SDS-TEN中的蛋白酶K(0. 5mg/ml)消化（55°C2小时）从3X1012pp的 纯化病毒制品中分离基因组DNA。在酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，在水中重悬基因组DNA并 用于基因组测序。
[0325] 通过对六邻体基因的高变区7 (HVR7)的序列分析获得新分离株的最初分类。为 此在HVR7两侧的高度保守区设计了 2个引物：TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA(SEQIDN0. 3)和 GTGGAARGGCACGTAGCG(SEQIDNO. 4)。使用纯化的病毒DNA或粗293裂解物作为模板通过 PCR扩增HVR7并且然后测序。通过测序高变区1至6得到有关分离株的更详细的信息。通过 TGTCYTGCAAGTC(SEQIDN0. 6)扩增包含HVR1-6的DNA区域。基于HVR序列分析将新分离的 病毒归类为人Ad病毒分类（Horowitz,MS(1990)，Adenoviridaeandtheirreplication. InVirologyB.N.