一种抗菌肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗菌肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，随着传统抗生素的滥用，细菌耐药性问题和药物残留问题已日趋严重，甚至出现超级细菌，而这些问题也直接威胁着人类健康乃至整个生物圈的生态平衡，已引起世界极高度的关注，而寻求一种取代传统抗生素的无残留、无耐药性的新型抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽具有高效的抑菌效果和广泛而稳定的生物学活性，已经广泛引起人们的兴趣和关注。抗菌肽不仅具有广谱、高效的抗微生物活性，而因其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具广阔的开发应用前景，抗菌肽的应用必将带来一场抗生素新的革命。
[0003]我国作为世界养牛业大国，牛血来源丰富、开发不充分、价格低廉，可以满足大规模深化加工的需求，具有很强的开发应用及推广价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种抗菌肽的制备方法，其制备方法条件温和、无污染、效率高。为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案:
一种抗菌肽的制备方法，该方法包括以下步骤:
(1)取牛血，进行血细胞破碎(目的是释放血红蛋白)后加入菠萝蛋白酶进行酶解；
(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5(如6.0)，获得牛血抗菌肽粗提物；
(3)将所述牛血抗菌肽粗提物上样于S^hadexG-100凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；
(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG_25凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，获得牛血抗菌肽溶液；
(5)将步骤(4)收集的牛血抗菌溶液冷冻干燥。
[0005]在所述方法的步骤(I)中，所述菠萝蛋白酶与所述牛血的配比可为750-35000U:1OOml (如 1750-3500U:100ml，具体如 3500U:1OOmL);所述酶解的温度可为 70 ?90°C (如70°C )，时间可为4?6h(如4h)。另外，在本发明中，所述进行血细胞破碎具体通过采用组织捣碎机搅拌所述牛血实现的。
[0006]在本发明中，所述菠萝蛋白酶的酶活为3500U/mg。相应的，所述菠萝蛋白酶与所述牛血的配比可为 0.5-lOmg: 10ml (如 0.5_lmg:100ml，具体如 lmg:1OOmL)。
[0007]在所述方法的步骤(2)中，所述向酶解液中加入乙酸具体可为:向所述酶解液中加入等体积的5% (体积百分含量)的乙酸水溶液；所述浸提具体可为:4?37°C (如4°C?10°C，再如 4°C )震荡 16-20h(如 16h);所述离心为:6600g-10000g(如 10000g)4?ICTC (如 4°C )离心 20min ?30min(如 20min)。
[0008]在所述方法的步骤(3)中，所述洗脱液具体可为:pH为6.0的浓度为0.2mOl/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm2.h。
[0009]在本发明的一个实施例中，步骤(3)的洗脱过程中共产生两个洗脱峰，所述具有抗菌活性的洗脱峰实际为第二个洗脱峰。所述抗菌活性具体体现为抗如下细菌中的至少一种:大肠杆菌(如ACTT 25922)、绿脓杆菌(如ACTT 27853)、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequence ID:gb|KJ156374.11)。
[0010]在所述方法的步骤(4)中，所述洗脱液具体可为:pH为6.0的浓度为0.2mOl/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm2.h。
[0011]在本发明的一个实施例中，步骤(4)的洗脱过程中只产生一个洗脱峰，该洗脱峰即为纯化后的牛血抗菌肽样品。
[0012]在所述方法的步骤(3)中，Sephadex G-100凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的Sephadex G-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)。所述上样的上样量为1ml ;所述洗脱的洗脱体积为1_1.5L。
[0013]在所述方法的步骤(4)中，Sephadex G_25凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的Sephadex G_25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1。所述上样的上样量为1ml ;所述洗脱的洗脱体积为1_1.5L。
[0014]在上述方法中，所述牛血即可为新鲜的牛血，也可以为经冷冻后融化的牛血。
[0015]利用如上所述方法提取得到的牛血抗菌肽也属于本发明的保护范围。
[0016]具体而言，本发明具有以下优点:
1、本发明方法实现了从牛血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。
[0017]2、采用本发明方法提取的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌、抗病毒、促生长和调节免疫等广泛而稳定的功能特点。
[0018]3、与同类方法相比，本发明方法操作方便，设备简单，提取周期短，而且分离提取率高。
[0019]4、本发明所开发产品的原料来源丰富，生产成本低，可以使牛血得到高值化利用。因此本发明的应用不仅可以带来良好的经济效益，而且还具有良好的生态效益，进而还具有重要的公共卫生学意义，符合构建节约环保型社会的理念。
【具体实施方式】
[0020]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021 ] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0022]实施例1
1、从牛屠宰场收集新鲜牛血，组织捣碎机搅拌均匀(同样可以将采集的牛血冷冻待用时融化后再按上步骤进行)，此步骤的目的是破碎血细胞，释放血红蛋白，冻融之后效果更佳。
[0023]2、向步骤I处理过的牛血中加入菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶与牛血的配比为Img木瓜蛋白酶/10ml牛血原液，混匀，在70°C条件下酶解4h，以得到酶解液。
[0024]3、向步骤2的酶解液加入等体积的5%乙酸(体积百分含量，溶剂为水)，4°C震荡浸提16h，8000r/min(相当于1000g) 4°C离心20min，留取上清，调其pH值至6.0，即为牛血抗菌肽的粗提物。
[0025]4、4°C下将牛血抗菌肽粗提物上样于Sephadex G-100凝胶柱(柱长与内径比为 8:1, Sephadex G-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)
进行层析，上样量为1ml，洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱的速度为10.0mL/cm2.h，洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测，自动收集器收集后，记录仪记录。
[0026]牛血粗提物经S^hadex G-100凝胶柱层析后出现2个洗脱峰。将洗脱峰各收集管的组分取20 μ L进行抑菌试验。采用琼脂糖弥散方法(检测菌在琼脂平板上
的终浓度为106CFU/ml)对收集的洗脱液进行检测，检测收集液对大肠杆菌ACTT25922株的抗菌作用，以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽作为阳性对照，以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽作为阴性对照。收集具有抑菌作用的洗脱液。
[0027]5、将步骤4获得的有效的抗菌肽(合并的具有抑菌作用的洗脱液，即经SephadexG-1OO凝胶柱层析后收集的第9_16管)浓缩之后进一步用Sephadex G-25凝胶柱(柱长与内径比为8:1，本发明中所采用的Sephadex G_25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1)进行层析，上样量为10ml，洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱的速度为10.0mL/cm2.h，洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测，自动收集器收集后，记录仪记录。收集具有抑菌作用的洗脱液，将其置于_20°C条件下保存。
[0028]6、将步骤5获得的有效的抗菌肽溶液冷冻干燥。
[0029]实施例1获得的牛血抗菌肽的抗菌试验
采用琼脂糖弥散法，对实施例1从牛血中提取的牛血抗菌肽进行抗菌活性检测，测定抑菌圈直径大小，具体操作同实施例1步骤4中相关描述。供试细菌有:大肠杆菌ACTT 25922、绿脓杆菌ACTT 27853株、嗜水气单胞菌(Genebank IDSequenceID:gb IKJ156374.11)。针对每个供试细菌均同时以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽，以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽的阴性对照。
[0030]实验重复三次，结果取平均值。
[0031]结果表明，实施例1从牛血中提取的牛血抗菌肽对各供试菌株均有明显的抑制作用，而阴性对照均无抗菌活性。
【主权项】
1.一种抗菌肽的制备方法，包括如下步骤: (1)取牛血，进行血细胞破碎后加入菠萝蛋白酶进行酶解； (2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5，获得牛血抗菌肽的粗提物； (3)将所述牛血抗菌肽的粗提物上样于S^hadexG-1OO凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰； (4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG_25凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，获得所述牛血抗菌肽溶液； (5)将步骤(4)收集的牛血抗菌肽溶液冷冻干燥。2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的制备方法，其特征在于:步骤(I)中，所述菠萝蛋白酶与所述牛血的质量配比为1750-35000U =10ml ;和/或步骤(I)中，所述酶解的温度为70?90°C，时间为4?6h。3.根据根据权利要求1所述的一种抗菌肽的制备方法，其特征在于:步骤⑵中，所述向酶解液中加入乙酸为:向所述酶解液中加入等体积的体积百分含量为5%的乙酸水溶液；和/或步骤(2)中，所述浸提为4?37°C震荡16-20h ;和/或步骤(2)中，所述离心为 6600 ?10000g4°C离心 20 ?30min。4.根据根据权利要求1中所述的一种抗菌肽的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；和/或所述洗脱的速度为10.0mT Jcm2.h。5.根据权利要求1中所述的一种抗菌肽的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；和/或所述洗脱的速度为.10.0mT Jcm2.ho
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽的制备方法。该方法包括如下步骤：(1)取牛血，进行血细胞破碎后加入菠萝蛋白酶进行酶解；(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5，获得牛血抗菌肽粗提物；(3)牛血抗菌肽粗提物纯化；(4)冷冻干燥。其制备方法条件温和、无污染、效率高、成本低，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法，可应用于大规模地从新鲜牛血中分离纯化抗菌肽的生产。
【IPC分类】C12P21/06
【公开号】CN105154508
【申请号】CN201510620536
【发明人】薛云州, 宁发子, 曾爱星
【申请人】重庆都好生物科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月27日