C退火 30s、72°C延伸 90s; 72°C延伸lOmin; (1.3)将PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，然后将目标条带切胶回收，获得含干扰片 段ASPV的平末端PCR产物，切胶回收后连接至PMD19-T载体，阳性克隆测序。3. 根据权利要求1所述RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体，其特征在于:所述步骤(2)具体 采用以下步骤： (2.1) 利用TOPO-Cloning技术构建入门克隆载体：取含目的基因片段的PCR回收产物1 yL，构建6yL反应体系：回收目的基因片段ASPVlyL、平衡盐溶液lyL、pENTRTM/SD/D-TOPO ?载体lyL、灭菌超纯水3yL，25°C反应30min，热激法转化大肠杆菌T0P10感受态细胞， 将转化细胞均匀涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养16h后，挑单克隆 到含有相同浓度卡那霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养14h，分别以ASPV-F与ASPV-R 和通用引物M13-F与ASPV-R为引物进行菌液PCR扩增，PCR反应程序为:94°C预变性3min; 32 个循环的94°C变性30s、57°C退火30s、72°C延伸90s;72°C延伸lOmin;如果扩增片段的长度 明显大于插入片段的长度，即为构建好的入门克隆载体，命名为PENTR-ASPV; (2.2) 利用LR反应构建RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体:取pENTR-ASPV质粒2μL，构建20μ LLR反应体系：pENTR-ASPV2yL、pHELLSGATE12 2yL、LR酶 4yL、灭菌水 12yL，25°C反应 12 11后加入2卩1^蛋白酶1(，37°(3温浴1〇1^11终止反应;反应产物热激法转化大肠杆菌1'(^10感受 态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有100mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，37°C培养16h后 挑单克隆到含有相同浓度壮观霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养14h后，分别提取LR反 应后的单克隆和PHELLSGATE12空载质粒，先用ASPV-F和ASPV-R作引物进行菌液PCR，阳性质 粒分别用Xbal和Xhol进行单酶切鉴定，将构建好的RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体命名为 pH-ASPV； Xbal酶切体系为:XbaIlyL、10XMBuffer2yL、0.1%BSA2yL、LR反应产物6yL、灭菌 超纯水9yL;XhoI酶切体系为:XhoIlyL、10XHBuffer2yL、LR反应产物6yL、灭菌超纯水11yL〇4. 权利要求1所述RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体在苹果抗病育种中的应用，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转入根癌农杆菌： 用冻融交替法将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转化农杆菌菌株，转化后进行阳性克隆 的筛选鉴定； (2) 苹果叶盘受体材料的无菌培养： 采集田间材料，并进行消毒处理，再进行无菌营养的继代培养，以及叶盘的切割与预培 养； (3) 用农杆菌介导法转化苹果获得转基因材料： 培养RNAi工程菌，将根癌农杆菌侵染苹果叶盘，然后，进行Kan抗性芽的筛选、继代培 养； (4) 转基因植株的检测： 对所得转基因植株进行PCR初检，然后进行Southern杂交检测； (5 )对所得转基因阳性植株进行离体扩繁，移栽，即得。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述步骤(1)具体采用以下步骤： (3.1) 用冻融交替法转化农杆菌菌株:用冻融交替法将质粒pH-ASPV转化农杆菌EHA105 感受态细胞，均匀涂布在含有100mg/LSpc和50mg/L利福平的YEB平板培养基上，28°C倒置 培养2d，挑单克隆到含有相同浓度的壮观霉素和利福平的YEB液体培养基中，28°C条件下震 荡培养48h; (3.2) 转化后阳性克隆的筛选鉴定:将pH-ASPV质粒转化农杆菌菌株EHA105后，分别用 ASPV-F与ASPV-R、P35S-F与ASPV-R以及ΝΡΤΠ-F与ΝΡΤΠ-R作引物进行菌液PCR扩增，如果用 ASPV-F与ASPV-R作引物PCR扩增出现493bp大小的片段，而以P35S-F与ASPV-R作引物的扩增 片段明显大于干扰片段大小，且以ΝΡΤΠ-F与ΝΡΤΠ-R作引物扩增片段大小为714bp，说明 RNAi载体已成功转入农杆菌中，即为可用于侵染植物的RNAi工程菌，命名为EH-ASPV。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述步骤(2 )具体采用以下步骤： 于4月份采集当年生幼嫩苹果枝条，用流水冲洗2~4h，剪成约1.0~2.0cm长的茎段， 先用75%的酒精进行表面消毒，0.lwt%的HgCl2水溶液浸泡lOmin，无菌水漂洗4~5次，接种 在MS+6-BA0.5mg//L培养基上，每4~5周继代1次;取继代培养15~20d的M26无菌苗，无菌条 件下将顶部幼嫩叶片从中部划伤成部分连在一起的叶盘，在MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L 培养基上进行预培养。7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述步骤(3 )具体采用以下步骤： 将上一步骤中的苹果叶盘在MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg//L培养基上预培养2天后，将EH-ASPV菌液28°C震荡培养至0D=0.5，6000rpm离心lOmin后收集沉淀的菌体，用等体积的MS 液体培养基重悬菌液，浸泡侵染叶盘10min后，用无菌滤纸吸干多余的菌液，接种在1^+6_ BA4 · 0mg/L+NAA0 · 2mg/L培养基上暗培养 3d，转至MS+6-BA4 · 0mg/L+NAA0 · 2mg/L+Cef250mg/L 培养基上进行脱菌培养，7d后转至MS+6-BA4 · 0mg/L+NAA0 · 2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L 培养基上进行筛选培养，切取获得的抗性芽接种在MS+6-BA0 · 5mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/ L培养基上，每2周继代一次，连续继代3次后，将发育良好的抗性芽转至1/2MS+NAA0.2+Kan50mg/L+Cef250mg/L培养基中进行生根培养。8. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述步骤(4)具体采用以下步骤： (6.1) PCR检测:选取生根良好的Kan抗性植株，用CTAB法提取植物基因组DNA，用ASPV-F与ASPV-R作引物进行PCR扩增，在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析； (6.2)Southern杂交检测:选取PCR检测为阳性的植株进行Southern杂交，具体步骤为： (6.2.1) 探针制备 采用PCR制备探针，PCR反应体系为：10Xbuffer5yL，dUTP标记混合物5yL，ΝΡΤΠ-F1μ L，NPTΠ-RlyL，Taq酶lyL，阳性质粒lyL，双蒸水36yL; PCR反应参数为:94°C预变性5min; 94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸40s，共35个循 环；72°C延伸lOmin; (6.2.2 )对基因组DNA和阳性质粒进行酶切 基因组DNA酶切体系如下：10XMbuffer60yL，内切酶HindIII，30yL，基因组DNA10μ L，灭菌水加至总体积为600yL;酶切后的DNA用等体积酚：氯仿抽提，产物溶于50yL去离子 水;质粒酶切体系为：10XMbuffer5yL，内切酶HindIII2.5yL，阳性质粒2.5yg，灭菌水 加至总体积为50yL;酶切产物采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收待用； (6.2.3) 电泳、转膜 将制备好的样品进行0.7%的琼脂糖凝胶电泳，25V恒压、低温、过夜;将胶置于平皿、用 蒸馏水冲洗一次后，加入5倍体积变性液室温振荡45分钟，用蒸馏水冲洗2次;加入中和液室 温振荡2X15min;用蒸馏水冲洗2次;加入2XSSC以平衡凝胶和带正电荷的尼龙膜5min; 向上毛细管法进行转膜20h;取下膜作好标记，在2XSSC中漂洗一次，80°C烘烤固定2h; (6.2.4) 杂交 取10mLHyb-100加入杂交管中，37°C预杂交2h;探针在PCR仪中100°C变性lOmin，立即 放冰水浴冷却5min，排尽预杂交液，在10.OmLHyb-100中加入20UL新变性好的探针，混匀； 37°C杂交过夜； (6.2.5) 洗膜 室温下，20mL2XSSC/0.1%SDS洗膜2X5min;65°C，20mL1XSSC/0.1%SDS洗涤2X15min;再将膜置于20mL洗涤缓冲液中平衡2~5min;将膜在10mL封闭液中封闭30min; 将Anti-Dig-AP用封闭液稀释5000倍，将2.0yLAnti-Dig-AP加入10mL封闭液混匀；倒出封 闭液，加入稀释好的10mL抗体溶液，浸膜至少30min;用20mL洗涤缓冲液缓慢洗膜2次，每次 15min，去除抗体溶液;在膜的正面滴加lmL的CSPD，隔绝空气15~25°C反应5min，去除多 余的液体，37°C孵育10min;在暗房用X-rayfilm曝光，显影、定影、洗片，曝光记录结果。9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述步骤(5 )具体采用以下步骤： (7.1) 转基因阳性植株的离体扩繁 选择Southern杂交检测为阳性的5个苹果转基因株系，在超净工作台上剪成单芽茎段， 在1/2MS+NAA0 · 2+Kan50mg/L+Cef250mg/L培养基上进行扩繁和生根培养； (7.2) 转基因植株的移栽 30天后生根良好的植株在温室内炼苗，3天后打开瓶口，每个培养瓶内加入15mL灭菌 水，开口锻炼2~3天后，用清水洗净根上附着的琼脂，移栽入装有商品基质的营养钵中，并 用塑料薄膜盖好保湿，7~10天后逐渐揭开薄膜，每天喷水一次保持湿度，每周浇灌一次营 养液，驯化15天后移栽成活的幼苗即可进行常规管理。
【专利摘要】本发明属于生物育种领域，具体涉及一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用，该表达载体由以下步骤制成：（1）RT-PCR扩增获得目的基因片段；（2）表达载体的构建。该表达载体在苹果抗病育种中的应用方法包括以下步骤：（1）将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转入根癌农杆菌；（2）苹果叶盘受体材料的无菌培养；（3）用农杆菌介导法转化苹果获得转基因材料；（4）转基因植株的检测；（5）对所得转基因阳性植株进行离体扩繁，移栽，即得。本发明将含有苹果茎痘病毒外壳蛋白（CP）基因保守片段的RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体遗传转化苹果，获得的转基因植株可以获得抗病毒的特性，在果树生产中具有良好的应用前景。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN105463014
【申请号】CN201511010429
【发明人】田莉莉, 牛良
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月30日