一种新的生物碱类化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从紫草的干燥根中分离得到的一种具有治疗 黑色素瘤作用的生物碱类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 紫草为紫草科植物新疆软紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.、紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb et Zucc·或内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥 根。紫草始载于《神农本草经》，历代诸家本草均有详细记载。其性寒，味甘、咸，归心、肝经， 具有止血凉血之功效，用于治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、热病斑疹、湿疹、尿血、血 淋、血痢、热结便秘、疮疡、丹毒、烧伤、恶疮、癣等。
[0003] 紫草在临床上被广泛有效的利用，激发了人们对紫草化学成分的研究。紫草化学 成分的发现及机制方面不断深入的研究，为人们克服癌症、病毒感染、艾滋病等疑难病症提 供了依据和药物治疗手段。紫草中含有多种化学成分，包括萘醌类、苯醌类、生物碱类、苯 酚、酚酸类、三萜酸、留醇类、黄酮类以及多糖类等物质，目前研究较多的是脂溶性很强的萘 醌类化合物和水溶性多糖。其中萘醌类是紫草抗癌的主要化学成分，两种分子量分别为 27336,1152的多糖混合物是其抗人乳头瘤病毒的主要成分。
[0004] 紫草对多种细菌、真菌、病毒(疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒)均有抑制作用。从紫 草中提取的天然萘醌类化学成分具有一定的抗肿瘤作用。紫草对白三烯和5-羟色胺的合成 有抑制作用，具抗组胺等炎症介质作用，故利用紫草这一药理作用用于防治支气管哮喘、荨 麻疹等疾病。紫草还可增强巨噬细胞的吞噬功能及自然杀伤细胞活性，增加淋巴细胞的数 量，对小鼠特异性及非特异性免疫均有增强作用。此外，紫草还具有抗生育、降血糖、抗氧 化、免疫调节、促进伤口愈合、消斑、促进角质异常恢复等作用，在临床上用于避孕，治疗糖 尿病、肝脏脂质氧化性损伤、外伤、烧伤、烫伤、银肩病等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从紫草的干燥根中分离得到的一种具有治疗黑色素瘤 作用的生物碱类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0008 σ·
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)紫草的干燥根粉碎，用70~ 80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正 丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙 酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱12个柱体积， 收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱物浸 膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80 :1、50:1、30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用75%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] -种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I)和 药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较；
[0020] 图3为BrdU免疫荧光检测细胞增殖结果。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0023] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024] 紫草经鉴定为内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。
[0025] 制备方法：（a)将紫草的干燥根(8kg)粉碎，用75%乙醇热回流提取(25LX3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的正 丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用 70%乙醇洗脱12个柱体积，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱物浸膏（129g); (c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积）、50:1 (8个柱体积）、30:1(6个柱体积）、10:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(31g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 15:1(8个柱体积）、10:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(14g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)(28mg)。
[0026] 结构确证:浅黄色油状物;HR-ESMS显示[M+Na]+为m/z 456.2312，结合核磁特征 可得分子式为C26H31N3〇3，不饱和度为13。核磁共振氢谱数据δ Η(ΡΡπι，DMS〇-d6，600MHz):H-3 (1.94，m)，H-3(2.31，m)，H-7(6.41，br，s)，H-9(7.45，d，J=8)，H-10(7.01，m)，H-ll(7.09， m)，H-12(7.28，d，J = 8)，H-14(1.62，m)，H-14(1.79，m)，H-15(3.41，br，d，J = 7)，H-17 (4.17，d，J=12)，H-17(4.38，d，J=12)，H-18(0.87，s)，H-19(2.02，m，2H)，H-21(5.57，s)， H-2'（8.28，br，s)，H-4'（7.39，br，t，J=7)，H-5'（7.05，m)，H-6'（8.32，m)，H-7'（3.19，m)， !1-8'（1.18，1^，(1，了 = 8)，16<0:^(3.71，8)，順(9.82，1^，8);核磁共振碳谱数据6。(卯 111， DMSO-de ,150MHz)： 135.4(C, 2-0,45.7(CH2,3-C) ,101.3(CH,7-C) ,127.2(C, 8-0,119.8 (CH，9-C)，119.3(CH，10-C)，121.4(CH，11-C)，110.6(CH，12-C)，135.7(C，13-C)，25.8(CH2， 14-C)，38.7(CH，15-C)，57.3(C，16-C)，65.5(CH2，17-C)，12.7(CH 3，18-C)，25.7(CH2，19-C)， 115.1(C，20-C)，131.9(CH，2卜C)，148.8(CH，2'-C)，132.7(C，3'-C)，134.5(CH，4'-C)， 123.8(CH，5'-C)，148.1(CH，6'-C)，61.0(CH，7'-C)，18.9(CH 3,8'-C)，173.8(C，16-C〇2Me)， 52.2(CH3，16-C0 2Me);碳原子标记参见图1。IR光谱表明该化合物含有胺基，羟基(3380CHT1) 和酯羰基（1725〇^1);群光谱显示出吲哚的特征吸收带231，282和290腹。 1!1匪1?谱显示八个 芳族共振信号0!17.〇1，7.〇5,7.〇9,7.28,7.39,7.45,8.28,8.32)，一个吲哚順0!19.82)，一 个甲基酯基（δΗ3·71)，一个羟甲基 0H4.17,4.38;d，J=12Hz)，一fCHMe(SH1.18,3.19)& 及一个乙基侧链(δΗΟ. 87，2.02)。130 NMR谱26个碳显示了 26个共振碳信号，包括三个甲基， 四个亚甲基，十二个次甲基，四个季碳，一个酯羰基，并且有两个叔碳(C-2和C-13)与吲哚氮 相连。根据COSY谱可知，八个共振芳氢中有连续四个分配到吲哚结构中（Η-9，Η-10，Η-11和 H-12)。芳香氢质子双峰信号δΗ7.28与吲哚ΝΗ(δΗ9.88)的N0E相关性表明这一双峰信号为H-12,另一个双峰信号δΗ7.45为Η-9。此外，Η-9与另一个芳香族氢质子单峰δΗ6.41(δα〇1.3) 的NOE相关性表明这些氢近似，且这个相对屏蔽芳香质子为6,7_开环单萜吲哚的Η-7。另外 四个共振芳氢，五个芳香族碳信号（SC123.8，132.7，134.5，148.1和148.8)以及质谱数据叔 胺的存在，表明该化合物含有一个3-取代吡啶环。吡啶部分特征性的质子和碳信号δΗ8.28 (δα48.8)和δΗ8.32(δ(：148.1)验证了上述推论。从 1H NMR谱可知吡啶部分C-3'位的烷基取 代基为-CHCH3，此基团与单萜吲哚的Ν-4位相连。季碳C-l 6 (SC57.3)连有一个羟甲基和甲酯 基，一边与吲哚部分的C-2相连，一边通过C-15与C-20位含有乙基侧链的乙基吡啶基取代的 2，3-脱氢哌啶部分相连。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数 据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基 本一致(图2)。
[0027]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0028] -、材料和仪器
[0029] 人Α375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物（I)自制，制备方法见实施例1， HPLC归一化纯度大于98%<^ΜΕΜ培养基、0.25%胰酶购自美国Gibco公司。ΜΤΤ(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝）、DMS0(二甲基亚砜）、BrdU购自美国 Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗鼠二抗购自美国Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。
[0030] 恒温C02培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国Forma公司产品。超净工作台（中国 苏州净化工程公司）。倒置显微镜，倒置荧光显微镜(Olympus公司）。电热恒温培养箱（中国 上海跃进医疗器械厂）。自动酶标仪（日本Wako公司）。紫外分光光度仪(美