加 DEPC水量视沉淀多少而定），轻弹管底溶 解。
[0048] (13)用1.8%左右的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA。
[0049] (14)在-20 °C的冰箱中可暂时保存备用。
[0050]二、两步法反转录PCR利用Promega试剂盒进行反转录，按照说明书配置反转录的 反应体系，如下：
[0051 ]互花米草总 RNA(lyg) 2μ1
[0052] 〇lig〇 dT ΙμL
[0053] RNase Free H20(DEPC水）7μ1
[0054] 充分混匀后，在PCR仪上72°C变性3min，取出放冰上，然后在每管中依次加入如下 试剂： lOmM dNTP 1 μ 1 5 ：K Buffer 4 μ 1
[0055] RNA 酶抑制剂（RNA inhibitor) 0. 3 μ 1 反转录酶（M-MLV) 1 μ 1 RN批o Froo Π 20 ( DRPC 水） 3, 7 μ 1
[0056] 充分混匀后，在PCR仪上42°C反应90min，结束后，将反应产物稀释4倍，-20°C保 存。
[0057] 三、克隆互花米草HKT8基因所用的引物序列
[0058] 5'-RACE 引物
[0059] SaHKT8-52:5 '-AGTTTTCCGGAGTCGCTCCAC-3 '
[0060] SaHKT8-51:5，-CTA ACT AAG CTT CCA GGC TTT GCC-3'
[0061] 3'-RACE 引物
[0062] SaHKT8-31:5，-AAGGTCGTGAACGCGGTGTTC-3，
[0063] SaHKT8-32:5 '-GAGAGCCAGGGAATCAGATTGC-3 '
[0064] 四、PCR反应体系
[0065] 按以下组成成分配制25μ1的PCR反应体系，如下： 10XPCR Buffer (含 Mg2+) 2.5 μ ? dNTP Mix ( 2mmol/L) 2 μ 1 反向引物 1 Hi
[0066] 正向引物 1 μL K0D 0. 5 μ 1 ：dH2Q 17 μ I 模板（反转录产物） 1 μL
[0067] 混合均匀后，进行PCR反应，反应条件为：94°C5min预变性；94°C30sec变性，58°C 30sec退火，68°C45sec延伸，30~35个循环;68°C 10min充分延伸；最后4°C保温。反应结束后 取出产物，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0068]五、RACE 结果
[0069] 将提取的高质量的RNA用反转录试剂盒反转录后得到cDNA模板，分别进行3'和5'-RACE，第一次RACE后的电泳结果如图1，可以看到有弥散现象，条带不清晰。然后用第一次的 产物做模板进行第二次RACE，结果如图2,可以看到清晰的单一条带。
[0070] 如图1和图2所示，把该产物送到测序公司进行测序，并将3'和5'RACE的测序结果 拼接，即可得到芦苇和互花米草HKT8基因的完整序列。
[0071] 实施例2
[0072] 互花米草种子萌发后播种，室温下（约25 °C)培养14天左右，然后选取生活力强且 长势均一的幼苗移栽到装有培养基的小方盆中，培养基成分为营养土:蛭石:珍珠岩=1:1: 1，于温室中培养，温度为25°C，光照时间10~12h/d。待到幼苗长至4~5片真叶时，选择生活 力强且大小均一的植株移栽到装有培养基的小盆中，每盆5株，继续培养，至株高约20cm时 处理使用。采用600mmol/LNaCl溶液进行处理，处理时间分别为：0h、3h、6h、12h、24h、48h、 72h。每个处理重复三次。
[0073] Real-time PCR所使用的引物 lBSrRNA: RTF CCGTTCTTAGTTGGTGGAG RTR CTCGTTGAATACATCAGTGTAG
[0074] Sa-IiKTS: RTF AGTTTTCCGGAGTCGCTCCAC RTR AAGGTCGTGAACGGGGTGTTC
[0075] 总RNA提取和反转录同上。
[0076] 按以下成分配制实时荧光定量PCR反应体系，如下：
[0077]
[0078] PCR反应条件:预变性94°C，5min;变性94°C，10s;退火58°C，10s，延伸72°C，20s，循 环次数40cycles;溶解曲线为：from 72°Cto 95°C。在Qiagene Rotor Gene Q仪上对不同胁 迫处理的互花米草材料进行HKT基因的实时荧光定量检测。
[0079] 如图3所示：随着盐胁迫处理时间的延长，互花米草HKT8基因的相对表达量基本呈 现出先升高后下降的趋势，最高表达量则出现在处理后的24h。
[0080] 需要说明的是，本发明为一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用，将对植 物耐盐分子机制的研究，植物耐盐品种的选育及植物耐旱性分子育种具有重要的理论及实 际意义，为提高植物的耐盐性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具 有广阔的应用和市场前景。
[0081] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种互花米草耐盐蛋白HKT，其特征在于:如下(a)或(b): (a) 序列如SEQ ID N0，1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将SEQ ID N0，1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列SEQ ID N0，1衍生的蛋白质。2. 权利要求1所述互花米草耐盐蛋白HKT的编码基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述的编码基因为（1)至(4)中任一所述的 DNA分子： 1) 序列如SEQ ID N0,2所示的DNA分子； 2) 如SEQ ID N0,2所示序列中自5'末端第80至1756位核苷酸所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与（1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子； 4) 与（1)或（2)或（3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码植物耐盐相关蛋白的 DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述基因重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体具体为将权利要求 2或3所述基因插入植物表达载体Superl300的多克隆位点得到的重组质粒。6. 权利要求2或5所述的基因或重组载体在培育耐盐转基因植物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:通过将所述的基因或重组载体导入目的植 物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植 物。
【专利摘要】本发明公开了一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质的氨基酸序列如SEQ？ID？NO，1所示，或将SEQ？ID？NO，1序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的氨基酸序列。本发明的培育耐盐植物的方法具有操作简单、周期短的特点，适于推广应用。该方法将对植物耐盐分子机制的研究，植物耐盐品种的选育及植物耐盐性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐盐性提供了一条经济、快速、有效的途径，本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【IPC分类】C12N15/82, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105566466
【申请号】CN201510798999
【发明人】郭善利, 尹海波, 张侠, 陈世华
【申请人】烟台大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年11月18日