1] 供试菌株:生防菌B916为已经商业化的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)生防 菌，对水稻纹枯病菌、蚕豆枯萎病菌等8种病原菌均具有较强的抑菌活性;菌株Bsl68为枯草 芽抱杆菌(Bacillus subtilis)模式菌株，常作为表达宿主菌被广泛使用；萎缩芽抱杆菌 (Bacillus at;rophaeus)Bal0316(ATCC 9372)为萎缩芽抱杆菌globigii亚种（B. atrophaeus subsp. globigii )，因其产生的芽抱能对热、紫外线、电离福射和某些化学物 质产生很强的抗性，因此该菌株被广泛地应用于芽抱形成、芽抱萌发机制、芽抱耐热机理的 研究中。湖水及渺泥样品随机采集自茶卡盐湖(东经99° 18/，北缔36°41〇,样品置于4°C冰 箱保存，待分离。
[0032] 培养基:样品中菌株分离及培养使用LB液体培养基(膜蛋白腺10.0 g/L，酵母提取 物5.0g/L，化C110.0g/L，121°C灭菌20min)，LB固体培养基化B液体培养基加琼脂15g/ L)。括抗菌耐盐实验使用化Cl含量为10%和15%的液体及固体LB培养基。病原菌对時实验使 用PDA固体培养基，购自抓公司。
[0033] 引物由Sangon Biotech北京合成部合成，测序由中国农业科学院农作物基因资源 与基因改良国家重大科学工程开放实验室完成，生化及分子生物学试剂均为市售分析纯。
[0034] 1.2盐湖中芽抱杆菌的分离 将盐湖渺泥及湖水样品，用灭菌超纯水分别稀释至l(Ti和1(T2,取200化稀释液均匀涂 布于LB固体培养基表面，每个浓度=个重复，30° C培养24 h后挑取所有菌落，在LB固体培养 基上画线纯培养。
[0035] 1.3抑菌谱的测定 使用平板对時培养法进行盐湖细菌抑菌谱的测定，将纯化好的细菌接种在LB液体培养 基中，30°C，220 r/min震荡活化12 h。供试病原真菌在固体PDA平板上活化生长10 d后，打 直径为7 mm的圆形菌饼放置于90 mm PDA固体培养平板中央，在平板对称位置距离菌饼20 mm处放置四个直径为6 mm的无菌滤纸片，加5化待测菌液，PDA平板置于28°C培养箱培养， 观察有无抑菌圈产生。有抑菌能力菌株进行复筛，每个处理=个重复，测量抑菌半径。
[0036] 1.4盐湖中芽抱杆菌的鉴定 分别提取筛选到的细菌的基因组，方法参照《分子克隆指南》。使用16S rDNA通用引物 27F(5' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' ) ( SEQ ID NO. 1)和 1 492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')(SEQ ID NO. 2)，gyrB 基因扩增引物11口1尸（5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'KSEQ ID NO. 3)和UP2R(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')(沈Q ID NO. 4)对所有细菌进行 分子生物学鉴定。PCR扩增反应体系（30化）：2 X化q Mix 15化，引物各1化，模板DNA 1 y L，超纯水12化。PCR扩增反应条件：95°C预变性5 min;94°C变性1 min，54°C(16S rDNA)或 58。(：(邑7巧基因）退火1111111，72°(：延伸2 111111，30个循环；72°(：延伸10 111111。口〇?产物用0.7%琼 脂糖凝胶140V电泳检测，产物送交测序。将测序获得的序列，上传NCBI进行BlastN比对分 析，使用MEGA 5.10软件构建系统发育进化树(见图1)。
[0037] 1.5括抗菌耐盐性测定 初测：将盐湖分离得到的所有菌株分别于含10%和15%化Cl的LB固体培养基上划线， 30° C培养，观察菌株能否生长。
[003引生长曲线测定:将菌株8916、83168、8曰10316、8曰10和8曰27接种于5 111心液体1^8培养 基试管中，220 r/min，30° C培养12 h，取500化相同吸光值(0化OOnm=O.6)菌液分别接种于 化Cl含量为10%和15%的50mL液体LB培养基中，30°C，220r/min培养，每隔4 h取1 mL菌液W 液体LB培养基为对照，测定ODsoonm的吸光值，W时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制生长曲 线。每个样品=个重复。
[0039] 2.结果与分析 2.1菌株分离及16S rDNA-gyrB基因序列分析鉴定 对从涂布盐湖水和渺泥样品的LB平板上获得菌株分别提取基因组DNA。利用上述1.4中 的引物分别进行16S rDNA及gyrB基因的扩增。即，扩增16S rDNA序列（扩增产物的长度约 1.化b)的引物对为：27F如SEQ ID NO. 1，1492R如SEQ ID NO. 2;扩增gy巧序列（扩增产物 的长度约1.化b)的引物对为:UPlF如沈Q ID NO. 3，UP2R如沈Q ID NO. 4。扩增得到的PCR 产物送交测序。测序后序列比对结果显示，BalO的16S rDNA(SEQ ID NO. 5)与萎缩芽抱杆 菌（B. atro曲aeusWl9的 16S rDNA(Genebank No. KF641809.1)的序列相似性为99%，BalO 的gyriKSEQ ID NO. 6)与萎缩芽抱杆菌（B. atro地aeus)UCMB-5137的gy;rlKGenebank No. CP011802.1)的序列相似性为99%;Ba27的16S rDNA(SEQ ID NO. 7)与萎缩芽抱杆菌（B. atro地aeus)BKSl-45的 16S rDNA(Genebank No. HM585062.1)序列相似性为 100%，Ba27的 gyrB(SEQ ID NO. 8)与萎缩芽抱杆菌（B. atrophaeus化SSC3的gyrB(Genebank No. GU994861.1)的序列相似性为99%。
[0040] 2.2芽抱杆菌抑菌谱测定 使用危害程度较强的14种病原真菌利用平板对時法对菌株BalO和Ba27进行抑菌能力 测定，结果显示运两株菌对14种供试病原真菌均有抑菌活性。菌株BalO和Ba27对苹果轮纹、 水稻稻攝、棉花黄萎和相橘疮挪病原菌的抑菌能力与生防菌B916相当；除菌株BalO对白菜 黑斑病原菌的抑菌能力与标准菌株Bal0316相比无明显差异外，菌株BalO和Ba27对病原菌 的抑菌半径极显著高于菌株Bal0316(P<0.01)(表1)。
[0041 ] 表1生防菌BalO和Ba27抑菌能力对比结果 注:数据为平均值±标准误，同行数据后不
同大写字母表示达到P<〇.Ol的极显著水平。
[0042] 2.3广谱括抗菌株16s rDNA序列及gy巧序列系统进化树的构建 使用广谱括抗菌株BalO和Ba27的gy巧基因序列及一些代表性菌株序列构建系统进化 树（图1)，结果显示，菌株BalO和Ba27与萎缩芽抱杆菌B. atrophaeus聚集成簇。结合上述 2.1的鉴定结果，判断菌株BalO和Ba27均属于萎缩芽抱杆菌B. atrophaeus。
[0043] 2.4菌株BalO和Ba27耐盐及生防能力检测 将菌株BalO和Ba27分别在NaCl含量为10%和15%的LB固体培养基上进行培养，结果显示 菌株BalO和Ba27能够在含有15% NaCl的固体LB培养基上生长。并绘制了耐高盐的括抗菌株 BalO和Ba27、商业化生防菌B916、枯草芽抱杆菌标准菌株Bsl68和萎缩芽抱杆菌Bal0316在 高盐环境中的生长曲线，结果表明除Bs 168，各菌株在LB液体培养基中的生长速率基本保持 一致（图2);在含10%NaCl的LB液体培养基中菌株BalO和Ba27的生长速率明显比菌株B916、 Bsl68和Bal0316高，进入稳定期早于其他菌株，并且稳定期菌株浓度也相对较高（图3);而 上述现象在含有15%NaCl的LB液体培养基中更为明显（图4);尽管两株菌在高盐溶液中稳定 期ODsoo?值都有明显下降，但仍然表现出了较强的适应性。
[0044] 高盐PDA培养基(NaCl浓度为5%)中的对時试验结果显示（图5)，菌株BalO和Ba27在 高盐PDA培养基上依然能够抑制油菜菌核菌生长。
【主权项】
1. 一种芽孢杆菌（Bacillus)，所述芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus);所述萎缩芽孢杆菌选自被定名为BalO的菌株，且所述BalO保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12053;和/或所述萎缩芽孢 杆菌选自被定名为Ba27的菌株，且所述Ba27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12054。2. -种对权利要求1所述的芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。3. -种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的芽孢杆菌和/或如权利要求2所述 的工程菌。4. 一种农药制剂，所述农药制剂包含如权利要求1所述的芽孢杆菌和/或如权利要求2 所述的工程菌。5. 如权利要求1所述的芽孢杆菌、如权利要求2所述的工程菌、如权利要求3所述的组合 物以及如权利要求4所述的农药制剂中的至少一种的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌用于防治白菜黑斑病、水稻 纹枯病、苹果轮纹病、西瓜枯萎病、水稻稻瘟病、草莓炭疽病、苹果腐烂病、油菜菌核病、小麦 赤霉病、黄瓜黑星病、棉花黄萎病、辣椒疫霉病、苹果根腐病和柑橘疮痂病中的至少一种。7. 根据权利要求5或6的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌用于保护0.5-15%的高盐环境 下生长的生物。8. 根据权利要求7的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌用于保护1-15%的高盐环境下生 长的植物。9. 根据权利要求8的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌用于保护1-5%的高盐环境下生长 的农作物。10. 根据权利要求9的应用，其特征在于，所述农作物包括白菜、水稻、西瓜、油菜、小麦、 黄瓜、棉花、辣椒、苹果和草莓中的至少一种。
【专利摘要】本发明涉及芽孢杆菌技术领域，特别涉及一种耐盐芽孢杆菌。所述芽孢杆菌为萎缩芽孢杆菌（<i>Bacillus atrophaeus</i>）；所述萎缩芽孢杆菌选自被定名为Ba10的菌株，且所述Ba10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12053；和/或所述萎缩芽孢杆菌选自被定名为Ba27的菌株，且所述Ba27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12054。其不但能够抑制多种病原菌的生长，而且具有较高浓度的耐盐性。CGMCC No. 1205320160115
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, A01N63/00, A01P3/00
【公开号】CN105695366
【申请号】CN201610199654
【发明人】耿丽丽, 束长龙, 邵高祥, 张 杰, 彭琦, 宋福平
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月5日