抗人cd34抗体、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：：抗人cd34抗体、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明公开了一种抗体、其制备方法及用途。
背景技术：
：在某些恶性血液病及实体瘤的临床治疗上，造血千/祖细胞(hematopoieticst(〕m/progenitorce丄ls，HSC)禾口移植已经成为目前公认的唯一有效的治疗方法。但因移植物中含有大量T淋巴细胞致使移植后发生急性、重度移植物抗宿主病(graft-versus-hostdiseaseGVHD)是影响异基因造血干细胞移植能否获长期生存的主要原因之一。造血干/祖细胞移植面临的首要问题是如何获得大量纯化的造血千细胞，以去除杂质细胞对移植的千扰，因此，清除或富集移植物中特定的细胞是当前移植领域所关注的问题。由于HSCs没有明确的形态学特征，主要表现为淋巴细胞样的单个核母细胞，所以只能以细胞表面的一些蛋白来鉴定。CD34是一个分子量约110Kd的穿膜糖蛋白，是目前所能认识的表达在人类HSC上最早期也是最广泛的抗原，是衡量HSC质与量的较好的标志，随着基于CD34抗体的阳性选择技术的发展，CD34+造血干细胞无论是在实验性动物还是在人身上都显示出重建造血的功能[AndrewsRG，BryantEM，BartelmezSH，MuirheadDT，KnitterGH,BensingerW，StrongDM，Bernstien:1:1)(1992)CD34'marrowcells,devoidofTandBLymphocytes,reconstitutestab丄(〕lymphopoiesisandmyelopoiesis.in]ethallyirradiatedbaboons.Blood80:1693j[ShpallEJ，JonesRB，Frank].inW，Bea:rmanS，StemmerS，Harn:''L,Pet,scheI),TaffsS，MyersS,PurdyM，HeimfeldS,Ha'lliga.nJ,Berenso'nRJ(1994)Transplan"ta;tionofautologousCD34+hematopoieticprogenitorcellsintobreastcancerpatientfollowinghigh-dosechemotherapy.JClinOnco]12:28]，因此它们以其独特的生物学特性与功能正成为造血干细胞移植最理想的靶细胞.CD34单克隆抗体识别CD34抗原的不同表位，这些表位根据它们对神经氨酸酶，木瓜蛋白酶和糖蛋Q酶的敏感程度不同，可以分为三类I类(对三种酶敏感)；II类(对神经氨酸酶抵抗，对木瓜蛋白酶和糖蛋白酶敏感)；III类(对三禾中酷抵抗)[Greaves,MF，TitleyJ:，ColmanSMetal.CD34clusterworkshop■report.In:Schloss腿nSetal(eds).LeucocyteTypingV.Oxford[Jnive:rsi'LyPress:Oxford，1995，pp840.846.]。在正常的造血千细胞上，这些表位的分布是不同的，这可能与造血千细胞的分化，成熟和功能有关。因此，针对不同表位的单克隆抗体就可以检测出不同数量的CD3f造血干细胞[RitaSteen，GeirE.Tjq皿f,jord，GustavGauderriack,LoreritzBririch，TorsteinEgeland，DifferencesinthedistributionpfCD34epitopesonnormaJhaem叩oieticprogenitorcellsandleukaemicblastcells.BritishJmirna)ofHacmatology1996,94:597-605.:1.近20年来随着免疫磁珠的问世，通过CD34单克隆抗体偶联磁性纳米微球制备相应的免疫磁珠来分选骨髓造血干细胞已广泛应用于临床造血干细胞移植，由于用其分选细胞具有操作简便、分离迅速完全、细胞纯度高等优点，已成为某些恶性血液病、重症免疫缺陷和肿瘤放化疗所至的造血功能低下等疾病的首选疗法。在造血干细胞分选的过程中，这些抗体将不可避免地伴随着造血千细胞进入人体。杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应答humanantimouseantibodyresponse(HAMA)「W:i.nterG，HarrisWJ.Humanizedantibodies.ImmunolToday.1993Jun;14(6):243-6]。因此，如何通过基因工程技术来构建抗降低鼠源抗体的免疫原性的抗体，有效地减少HAMA反应的发生率是本领域的技术人员急于解决的问题。
发明内容为了解决上述问题，本发明的发明人首先得到了针对不同表位的鼠源CD34单克隆抗体，对其改造得到嵌合抗体，达到了降低其免疫原性，减少HAMA反应的发生率，提高造血干/祖细胞移植的安全性的目的。更进一步，本发明公开了1，抗人CD34抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ[DN0:2、SEQ1I)NO:6、SEQIDN():IO之一，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ1:DNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:12之一。2，编码上述抗体的核苷酸序列，其中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:9之-一，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:11之一。3，嵌合抗人CD34抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10之一，其轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:4、SEQ丄DNO:8、SEQ工DNO:12之一，恒定区为人抗体恒定区。4，嵌合抗人(:D34抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:2，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:4，恒定区氨基酸序列为SEQIDNO:16、SEQIDNO:14。5，嵌合抗人CD34抗体c4C8，其重链的氨基酸序列为SEQIDNO:18，轻链氨基酸序列为SEQ]DNO:20。6，嵌合抗人(〕I〕34抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:6，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:8，恒定区氨基酸序列为SEQIDNO:16、SEQIDNO:14。7，嵌合抗人CD34抗体c5B12，其重链的氨基酸序列为SEQIDNO:22，轻链氨基酸序列为SEQIDNO:24。8，嵌合抗人CD34抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:11，恒定区氨基酸序列为Sl':QIDNO:16、SEQIDNO:14。9，嵌合抗人CD34抗体c2E10，其重链的氨基酸序列为SEQIDNO:26，轻链氨基酸序列为SEQIDNO:28。10，上述的抗体制备的免疫磁珠用于分选骨髓造血千/袓细胞。具体地，本发明公开了三种针对不同表位的抗人CD34的抗体(5B12，4C8和2E10)的序列，本发明还公开了利用上述抗体得到的嵌合抗体(c5B12，c4C8和c2E10)及制备这些嵌合抗体的的方法，具体地首先采用5'RACE技术从4C8杂交瘤细胞基因组(IgGl，k)中分离并鉴定出功能性鼠抗体可变区基因，经基因重组与人抗体恒定区基因按一定方式相拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建嵌合抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，用筛选药物进行加压筛选，用有限稀释法进行亚克隆，将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，最后用ProteinA亲和柱分离纯化嵌合抗体c4C8、c5B12和c2E10的构建和纯化方法同c4C8。本发明的发明人对上述抗体进行了表位鉴定实验，表位鉴定结果表明5B12,4C8和2E10分别识别CD34分子的I，II和III类表位。体外抗原结合活性测定结果表明不论是鼠源抗体5B12，4C8和2E10，还是嵌合抗体c5B12，c4C8和c2E10都能很好地与高表达C:D34的人髓性白血病细胞KGla特异性结合。竞争抑制实验结果表明二种嵌合抗体都保留了各自对应的鼠源抗体的亲和力和特异性，可以将它们与磁性纳米材料偶联，制备免疫磁珠，来分选骨髓造血干细胞，能有效地减少HAMA的发牛率，提高临床造血干细胞移植的成功率，用于某些恶性血液病及实体瘤的治疗。图1.抗人CD34鼠源抗体5B12,4C8和2E1.0的鉴定结果，图11抗人CD34鼠源抗体的抗原结合活性结果，图]2KGla细胞的膜蛋白与5B12,4C8和簡的westernblotting分析结果，商品化的抗人CD34的鼠源抗体581作为对照。图2.抗人CD34鼠源抗体5B12、4C8和2E10的表位鉴定结果，空心图代表经酶处理后细胞的染色，实心图代表未经酶处理的细胞的染色。图3.抗人CD34嵌合抗体c5B12、c4C8和c2E10的鉴定结果，图3-1抗人CD34嵌合抗体的抗原结合活性结果，图3-2、图3-3、图3-4为竞争抑制实验结果，其屮图3--2为FITC-5B2，图33为F]:TC4C8，图34为HTC2E10。具体实施方式以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步的说明，不应构成对本发明的限制。实施例1.抗人CD34单克隆抗体5B12、4C8和2E10的制备一细胞融合杂交瘤制备单克隆抗体用高表达CD34的KG-la细胞(KG-la细胞ATCCCCL,246.1)免疫BALB/c小鼠(购自购自上海实验动物中心)，使其脾脏中的B淋巴细胞能产生抗人CD34的抗体，取免疫后小鼠的脾细胞与NS1(BALB/c小鼠骨髓瘤细胞)融合，经HAT选择性培养，经过培养，筛选出抗人CD34阳性克隆，再经克隆化后筛选出亚克隆，以确保抗体是由单个克隆细胞产生，然后收集单个克隆细胞培养上清经ProteinG柱纯化后，就得到抗人(:D34的单克隆抗体5B12、4C8和2l':K)。实施例2.抗人CD34单抗5B12、4C8和2E10可变区基因的克隆按"Tri.zolReagent"试剂盒(美国GibcoBRL公司产品)说明书提取2X10"分泌抗人CD34单抗的杂交瘤细胞4C8的总RNA。选择抗体(lgGl，k)重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSP1、GSP2、GSP3，其中GSP1距离可变区基因最远，用于逆转录反应，GSP2用于首轮PCR扩增，GSP3用于巢式扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下GSP1H,5'GTAGAGGTCAGACTGCAGGAC-3，;GSP2-H，5，-CTCAGGGAAATAGCCCTTGAC-3，;GSP3H，5'-AGATCCAGGGGCCAGTGGATAGAC3，.GSP卜丄，5'TTGCTGTCCTGATCAGTCCAACT-3，；GSP2L，5，-TGTCGTTCACTGCCATCAATCTT-3，；GSP3-丄'5，-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGA-3'.按照5，RACE试剂盒(美国GibcoBRL公司产品)说明书以GSPl为引物将总RNA逆转录成cDM,然后给第一链cDNA的3'末端加上poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AI]AP和GSP3为引物进行巢式PCR扩增。两次PCR反应均采用热启动，反应条件94。C5分钟；94"C45秒，60。C45秒，72°C1分10秒，30个循环；72°C7分钟。巢式PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到pGEM-Teasy载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析。然后以测序正确的pGEMT/Vu为模板，设计引物H有义AAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACTTG和H反义GCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAG,采用Onest印RTPCR反应扩增VH链rj'变区基因并使其5'端含有限制酶位点HindIII，3'端含有限制酶位点NheI，反应条件为50。C30分；95。C15分钟；94。C50秒，58。C50秒，72°C50秒，30个循环；72°CIO分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEMT载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5'RACE的序列完全一致。SEQIDN0:1和SP:QIDN0:2分别显示了4C8重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的LE确克隆记作pGEMT/YH。以测序卍确的pGEMT/T为模板，设计引物L有义AAGCTTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG和L反义GACAGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTGATTTCCAGCTTG，采用Oriest印RT-PCR反应扩增VL基因并使其5'端含有限制酶位点HindIII，3'端含有人抗体轻链恒定区5'端的互补序列，反应条件为94°C5分钟；94。C50秒，58。C50秒，72°C1分钟，30个循环；72"C10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克降到pGEM-T载体(Promega公司产品)巾，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5，RACE的序列完全一致。SEQIDN0:3和SEQIDN0:4分别显示了4C8轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEMT,/VL。5B12的亚型为(IgG2a，k)，选择抗体重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSP1H，5'AGCTGGGAAGGTGTGCACACCACT3，；GSP2-H,5'-CAGAGTTCCAGGTCAAGGTCA3';GSP3-H，5'-CTTGACCAGGCATCCTAGAGT--3，。GSP1L，5，TTGCTGTCCTGATCAGTCCAACT3，;GSP2'L，5'TGTCGTTCACTGCCATCAATCTP3，；GSP3-丄，5'TTGTTCAAGAAGCACACGACTGA3'，5B12可变区基因的克隆方法同4C8，SEQIDN0:5禾BSEQIDN0:6分别显示了5B12重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQIDNO:7和SEQ1:1)N0:8分别显示了5B12轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。2E10的亚型为(IgG3，k)，选择抗体重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSPrH,5，'CTACGTTGCAGATGACAGTC3';GSP2H，5，ACAGTCACCAAGCTGCTGAG-3，；GSP3-H，5'-ATGAGACTGTGCGCACAC(〕3'.GSP1L，5，TTGCTGTCCTGATCAGTCCAACT3，；GSP2-L，5，-TGTCGTTCACTGCCATCAATCTT-3，；GSP3L,5'-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGA-3，.2E10可变区基因的克隆方法同4C8，SEQIDN0:9和SEQ]DNO:10分别显示了2E10重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQIDNO:ll和SEQ丄l)N0:12分别显示了2E10轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。实施例3.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell,1980，22:197--207)和文献(NucleicAcidsResearch,1982，10:4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到PGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQIDNO:13和SEQ工I)NO:14分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:15和SEQIDNO:16分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEMT/CH和pGEM-T/a。实施例4.嵌合抗体c4C8，c5B12和c2E10的构建将上述Onest印RTPCR测序正确的质粒pGEMT/VH用HindIII和NheI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得约430bp的酶切片断，与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接，挑选正确克隆后以HindIII和EcolU酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3.1(十)(美国Invitrogen公司产品)用T4DNA连接醸(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3.1(+)(VHCH)。SEQIDNO:17和SEQIDNO:18分别显示了嵌合抗体c4C8H链的核苷酸序列和氨基酸序列。采用OverlappingPCR将上述Onest印RTPCR测序正确的克隆pGEMT/VL直接与轻链恒定区的正确克隆pGEM-'T/CL融合，反应条件为50"C30分；95。C15分钟；94°C50秒，58。C50秒，72°C50秒，30个循环；72°C10分钟，得到PCR产物VLCL,其5'端含有限制酶位点HindIII，3'端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的VLCL基因用HindIII和EcoRI双酶消化从pGEM-T载体中切下，克隆到pc腿3.1/ZE0(+)载体(美国Invitrogen公司产品)中，构建成真核表达载体pcDNA3,VZEO(i)(VLCL)。SEQIDN0:19和SEQIDN0:20分别显示了嵌合抗体c4C8L链的核苷酸序列和氨基酸序列。于3.5cm组织培养皿中接种3X10sCHO-Kl细胞，细胞培养至90%'95%融合时进行转染取质粒10yg(质粒pcDNA3.l(+)(VHCH)4ug，质粒pcDNA3.1/ZE0(+)(VLCL)6tig)禾n20ix1Lipofectamine2000Reagent(Invit:rogen公司产品)分别溶于500"1无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA脂质体复合物加入到板中，CO,J瞎箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于C(y瞎箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600Mg/mlG418和250ug/mlZeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人TgG(Fc)包被于m丄SA板，4°C过夜，用2%BSAPBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Humanmye]omaIgGl,K)，37。C温育2h，加入服P—羊抗人工gG(K)进行结合反应，37。C温育lh，加入TMB于37。C作用5min，最后用tLS(X终止反应，测A柳值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ProteinA亲和柱(GE公司产品)分离纯化嵌合抗体c4C8。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。嵌合抗体c5B12和c2E10的制备方法和纯化方法同c4C8。SEQIDNO:21和SEQIDN0:22分别显示了嵌合抗体c5B12重链的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQIDN0:23和SEQIDN0:24分别显示了嵌合抗体c5B12轻链的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:25和SEQIDNO:26分别显示了嵌合抗体c2E10重链的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQIDN0:27和SEQIDN0:28分别显示了嵌合抗体c犯l()轻链的核苷酸序列和氨基酸序列。实验例实验例l.单克隆抗体5B12、4C8和2E10的鉴定用透析标记法标记抗体用0.025MpH9.5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体(5B12，4C8和2E10)稀释成1%浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成0.lmg/ml的溶液盛于小烧杯中，使透析袋浸没于F工TC溶液中，在4°C避光搅拌24h。取出透析袋中标记液，用S印hadexG--50过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体FITC-5B12，FITC-4C8和FITO2E10备用。抗原结合活性检测将KG-la细胞用1%FCSPBS重悬成IX〗Oficells/ml，分别加入不同稀释度的单克隆抗体FIT05B12，F]T04C8和FITC-2E10和作为对照的商品化抗人CD34的单克隆抗体FITC581(购自英国Serotec公司)，置于4。C孵育60min，用1%FCSPBS洗细胞2遍后用FCM分析，计算染色阳性细胞的平均荧光强度并比较各抗体的相对亲和力。这里相对亲和力定义为染色阳性细胞的百分数达到50%时所对应的抗体浓度。实验结果见图11，与抗人(〕D34鼠源抗体581对照(Control)相比，5B12，4C8和2E10都能很好地与KGla细胞特异性结合。Westernblot分析抽提KG-la细胞膜蛋白，用SDS电泳进行分离，然后电转到PVDF膜上。PVDF膜首先用含5%脱脂奶粉的PBS封闭，然后与三种单克隆抗体5B12，4C8和2E10在37。C孵育60min，PBS洗后，再加入服P-羊抗小鼠IgG于37i:孵育1小时，洗细胞后通过DAJ3显色来显示免疫反应的条带。实验结果见图l-2，与抗人CD34鼠源抗体581.对照(Control)(英国Serotec公司产品)一样，5B12,4C'8和2E10都能与一条分子量约1K)kDa的特异性条带反应，也就是5B12，4C8和2E10能特异性识别CD34分子。实验例2.表位鉴定CD34分子的表位根据对酶(神经氨酸酶，木瓜蛋白酶和糖蛋白酶)的敏感程度不同，可分为三类I类对Neu，Chy，Gly均敏感，如MylO，B:r'3C5，ICH3，12.8等II类:对Chy,Gly敏感，对Neu抵抗，如QBEndl()III类:对Neu，Chy，G]y均抵抗，如HPCA-2，8G12,TUK3，115.2等根据这一结论，我们对5B12，4C8和2E10的分子表位进行了检测。首先将1X10，人急性髓性白血病细胞K(;la重悬于K)0ulPBS，然后分别与0.1U/ml的神经氨酸酶(VCN)(Sigma，MO，USA)，100U/ml的木瓜蛋白酶(Calbioche)m，Cambridge,U.K.)或溶血性巴斯德菌糖蛋白酶在37"C孵育3()min，用5%FCS--PBS洗细胞2遍，以中止酶的反应，三种经酶处理后的细胞分别加入5B12、4C8、2E10，置于4。C温育45min，用1%FCSPBS洗细胞2遍，再加入F:[TC-goatanti-mouseIgG(H卜L)(美国Zymed公司)于4。C孵育45min,洗细胞后用FCM分析，未经处理的细胞作为对照，以检测酶敏感性表位的丢失。实验结果见图2，5B12对三类酶都是敏感的，因此它识别的是[类表位；4C8对神经氨酸酶抵抗，对木瓜蛋白酶和糖蛋白酶敏感，因此它识别的是n类表位；2Eio对三类酶都是抵抗的，因此它识别的是in类表位。实验例3.嵌合抗体c5B12、c4C8和c2E10的鉴定抗原结合活性检测将KG.la细胞用1%FCSPBS重悬成1Xl(fcells/ml，分别加入不同稀释度的单克隆抗体(:5B12，c4C8和c2E10，置于4。C孵育60min，用1%FCSPBS洗细胞2遍，再加入F:ITC羊抗人IgG(H+L)于4"C孵育6()〖nin，洗细胞后用FCM分析。每个样品设三个复管。实验结果见图3-1，c5B12、c4C8和c2E10都能很好地与KG-la细胞特异处妙A竞争抑制实验将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体F]:T05B12、FITC4C8和FITO2E10和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞KGla(1X106/ml)中，4。C孵育60min，1%FCSPBS洗细胞2遍，流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。嵌合的抗CD3的单克隆抗体cl2F6(制备参见LiB!l，WangH，Dai,]X，JiJJ，QianWZ，Zhang'DP，HouS，GuoYJ.Constructionaridcharacterizationofahum肌i—ze(iant:i:.'humanCD3monoclonalantibody12F6witheffective丄ramun()regulationfunctions.Immunology.2005，116(4):48798)作为对照。竞争抗体的每个浓度设3个复管，计算半数抑制浓度IC50值。实验结果见图32，3-3和3-4，嵌合抗体c5B12、c4C8和c2E10都能与各自对应的鼠源抗体竞争，说明三种嵌合抗体都保留了各自对应的鼠源抗体的亲和力和特异性，而且它们的工〔〕5。值相似(见表l)。表l抗体类型IG(Pg/ml)"SDnm5B121.3060.0443c5B121.2380.0563m4C81.7890.0483c4C81.8480.0373m2E102.0600.0823c2E101.9310.0853SEQUENCELISTING〈110〉上海中信国健药业有限公司<120>抗人CD34抗体、其制备方法及用途<130>AndrewsRG，BryantEM，BartelmezSH，MuirheadDT，KnitterGH，BensingerW，StrongDM,Ber.nstienID(1992)CD34+rna—rrowcells,devoidofTandBLymphocytes,reconstitutestablelymphopoiesisandmyelopoiesisinbaboons.Blood80:169328Patentlnversion3.4irradiated423人工序列1<160〉〈170〉〈210〉<211〉〈212〉<213>〈400〉atggattggcatccagttggtgcaaggcgtgg咖gggttg33g3gttC3aa.ttacgcacgca〈210〉2〈211〉141〈212〉PRT<213>人工序列<400>2tgtggagLCttgctattcctgatggcagctgcccaaaatatccaagcacag60tgceigtctggacctgagctga.a.gaagcctggag;柳cagtcaatatctcc120ctgga"ta,t:a,cgictgggtgaagcaggctcca180gggctggatactgg卿gccaaaatatgct240缚卿cggtttgccttgtctctgccagcnctgcctatttg300tgaggacacggctacfit丄tttctgtgcaaggggttatggt360gtggagcctggttggcttactggggcc犯gggactctggtcactgt.ctct420423MetAsp1lieGinProGlyThrAsn50LysTrp65GluGluTrpLeuAlaGlu35TyrMetGin20ThrTrp5lieAsnLeuLeuPheGinLeuValValAsnlieGlyMetAsnGlyPhelysThrAlaTyrTyrPheAlaTyr130Cys115TrpLeu100AlaTrpGly85GinArglie70Trp55AsnSer40ValGin25CysLeu10SerMetAla.Ala.AlaGlyProGluLysAlaSerLysGinAlaThrAsnThrPheAlaLeulieAsnAsnGlyGlyGinGlyTyrThr135Gly120LeuLeu105AsnSer90LysGly75LeuPro60GluGly45GlyProLeu30TyrLysLysGin15LysAsnLysThrPheGluThrSerAsnGluAspTyrAlaArgValThrValSer140Gly125AlaThr110AlaGlyTyrAla95AlaleuAla80SerThrTrpLeu〈210〉3<211>396<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉3atgaagttgcctgttaggctgttggtgctggttttgttgacccaaactccactctccctgtcttgcagatctagtcagaccattgtacatctgca.ga朋cca.ggactigtctccEiaagctcggggtcccagacaggt.tcagtggcagtggaagagtggaggctgtigga.tctgggagttt.atacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcatgttctggattcctgcttcC3gc3gtg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技术领域：
。具体地，本发明公开了鼠抗人CD34抗体5B12、4C8、2E10及嵌合抗体c5B12、c4C8、c2E10，这些抗体的制备方法及其在分选骨髓干/祖细胞中的用途。文档编号G01N33/543GK101245108SQ20071009445公开日2008年8月20日申请日期2007年12月13日优先权日2007年12月13日发明者盛侯,李博华,皓王,郭亚军,钱卫珠申请人:上海中信国健药业有限公司