专利名称：防治油菜菌核病的枯草芽胞杆菌及抗菌物质分离的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株防治油菜菌核病的枯草芽胞杆菌的 分离筛选，抗菌活性物质的分离及应用。
背景技术：
油菜菌核病是由核盘菌(&^0""^"/^加'0,鹏)引起的真菌病害，居油菜三大病害之首， 轻病年减产10% 20%，重病年减产达50%左右。在油菜菌核病的抗病油菜品种筛选上 仍未找到免疫材料，目前缺乏高效的抗病品种(双桑等，油菜菌核病及抗病育种研究进展， CROP RESEARCH, 2006, 5: 552-556)。长期以来其防治大多用苯并咪唑类杀菌剂在花期喷 雾进行化学防治。由于长期单一用药，病原菌对杀菌剂己广泛产生抗药性，防治效果并不 理想，并且长期使用上述药剂，给生态环境、人类健康带来严重危害。使得人们对该病的 生物防治寄予了厚望。在目前研究的菌核病生防菌中，国外有通过真菌盾壳霉(Com'o勿h, 朋'"tom)进行防治的报道，该菌通过寄生核盘菌菌核，使其丧失产生子囊盘的能力。1999年 德国的Prophyta公司用C. m/m'tora开发出第一个用于防治核盘菌的生防真菌产品，其商品 名为CONTANS(Hedke K等，Contans - first biocon加l agent against SWero加r謂sc/era/7o/", in oilseed rape [R〗.Canberra, Australia: Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress, 1999)。目前国内还没有专门用于防治油菜菌核病的生防产品。枯草芽胞杆菌是一种在自然界广泛存在的微生物，革兰氏阳性，产生耐热、抗逆的芽 胞，在芽胞形成初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，具有显著的生 防潜力。目前已确定来自枯草芽胞杆菌的抗菌物质有低分子抗菌肽，有环状肽或环状脂肽， 也有些为线状肽等，这些物质能使病原真菌菌丝发生断裂、解体、细胞质消解等现象。脂 肽类类抗生素是由枯草芽胞杆菌(^^7/m w6ri/W产生的具有潜在的植物病害防治和医学 应用价值的抗菌物质，包括surfactin、 iturin和fengycin。脂肽类生物表面活性剂一般是以内 酯或酰胺键结合而成的环状脂肽。脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃 链形成亲油基，亲水的氨基酸能和烃链上的羧基、羟基或氨基结合形成环状。由于氨基酸 组成和脂肪酸侧链长度的差异形成多种同分异构体，这些脂肽的结构相似，性质相近，从 细菌发酵液中分离纯化得到纯的单分子类抗生素非常困难，这给进一歩的结构鉴定带来相当大的难度。酸沉淀是分离纯化脂肽类物质最常用的方法，但酸沉淀后很多杂质也一起被 沉淀下来了，分离纯化的效果并不理想(Mukherjee S等，Towards commercial production ofmicrobial surfactants. TRENDS in Biotechnology, 2006, 24(11): 509-515)。固相萃取(Solid-phase extraction, SPE)，又称固液微处理小柱技术。它是利用对某些成分的选择性吸 附与选择性洗脱的液相色谱分离原理，使液体样品通过吸附剂小柱，特异性地保留其中某 些组分，再选用适当的溶剂冲洗杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化 与浓縮的目的。特别适合从各类复杂样品中提取净化微量待测组分，具有分离速度快、操 作简单、萃取效率高、无乳化等特点，在环境分析、药物分析等方面有广泛应用。能起到 将被分离物质与杂质分开和浓縮样品的作用，尤其适用于色谱分析样品前处理。发明内容本发明的第一个目的是克服现有技术存在的缺陷，从自然环境中分离筛选出一株对油菜菌核病菌有抑制能力的枯草芽胞杆菌菌株；本发明的第二个目是从所述的枯草芽胞杆菌 株的发酵液中分离出对油菜菌核病菌有抑制能力的脂肽类抗菌物质；本发明的第三个目的 是利用所分离的脂肽类抗菌物质用于油菜菌核病的防治。本发明是这样实现的申请人于2007年11月从中国湖北省武汉市华中农业大学油菜基地的土壤中分离得到一株对油菜菌核病菌(Sc/erarim'a "/m^'0nw2)有抑制能力的生防菌X-01菌株；经形态观察， 生理生化和16S rDNA鉴定，该X-01菌株在分类学上属于枯草芽胞杆菌(^zc///^ ra^7的， 申请人:于2008年4月28闩将该菌株送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO: M 208067。进一步的发酵试验证明，该菌株能分泌一种脂肽类抗生素iturin A，测定其分子量为 1042.9 Da。一种制备脂肽类抗生素iturin A的方法，其特征在于1) 将保藏编号为CCTCCNO: M 208067的枯草芽胞杆菌菌株X-01液体振荡活化，接 种到装有液体培养基(每1000 ml中含有胰蛋白胨10 g，葡萄糖5 g， K2HP04 2.5 g， MgS04.7H20 0.2 g， pH7.2)的三角瓶中，培养温度30。C;摇床转数150rpm;培养时间48 h，得到含脂肽类抗生素iturinA的发酵液；2) 将步骤l)得到的含脂肽类抗生素iturin A的发酵液在相对离心力为10000xg的离心 机上离心15min除去菌体，取上清，先用截留分子量为100KDa的超滤管超滤，滤过液再 用截留分子量为30 KDa的超滤管浓縮到原体积的1/20，弃去滤过液，取截留液上固相萃取柱分离，依次用0%, 20%, 40°/。， 60%, 80%, 100%的甲醇/水溶液(V/V)梯度洗脱，收 集60%, 80%, 100%洗脱组分，用旋转蒸发仪于65。C水浴条件下浓縮得到含脂肽类抗生素 iturinA的粗提物；3)将步骤2)粗提物用1 ml甲醇溶解得到样品处理液-1，将样品处理液-1用高效液相色 谱仪分离，色谱柱的参数为填料为HypersilBDSC18， 4.6 mmx2 0mm， 5pm粒径，高效 液相色谱条件流动相35%乙腈/水溶液(V/V);流速lml/min，检测波长210 nm，进样 量20 运行时间50 min，收集保留时间为10 min的色谱峰，于65'C水浴下旋转蒸发浓 縮至lml后转移到离心管中，用氮气吹干，得到脂肽类抗生素iturinA。基于以上的发明，申请人已经从该枯草芽胞杆菌的发酵液中成功地分离得到防治油菜 菌核病的脂肽类抗生素iturinA，并将这种类抗生素成功地应用在防治油菜菌核病上。当分 离得到的脂肽类抗生素iturin A的浓度为100 pg/ml时防治油菜菌核病的效果达100%，浓 度为10 pg/ml时的防治效果达到40.7%。本发明具有以下优点本发明分离的X-Ol菌株能产生脂肽类抗生素，具有很强的抑制油菜菌核病菌的能力， 为油菜菌核病的防治提供了新的生防产品。
图1:本发明的技术流程图。图2: X-Ol菌株发酵滤液对核盘菌的抑制实验结果。图中CK:未接种的培养基(对照)；滤液X-Ol菌株的除去菌体后的发酵液。 图3: X-Ol菌株的16SrDNA序列。图4: X-Ol菌株的系统发育树。图中括号内为相应菌株在Genbank的编号。 图5:本发明的菌株的抗菌活性组分经固相萃取后各洗脱组分的抗核盘菌效果图。图中 a:超滤截留液；b， c， d， e， f， g分别为0%， 20%， 40%， 60%,， 80%' 100%的甲醇水溶液洗脱液；由于样品浓度过大以及上样量过多，仍有部分活性组分未被固相萃取柱吸附，因此，最初的纯水洗脱液(b)具有部分抗菌活性。甲醇无拮抗效果。 图6:本发明的菌株的抗菌活性组分经固相萃取后的高效液相色谱图。图中色谱峰上的数 字表示各色谱峰编号。图7:各液相色谱峰抗核盘菌的效果图。图中数字分别对应于图6中的色谱峰。图8:纯化后的脂肽类抗生素iturinA的基质辅助激光诱导解吸附电离飞行时间质谱图。图中质荷比(M/Z)为1043.9， 1065.9， 1081,9的离子峰分别为活性物质的[M+H]+， [M+Na]+， [M+K]+峰。图9: X-01菌株产生的脂肽类抗生素iturin A的电喷雾碰撞活化解离质谱图。图中表示了 iturin A肽段断裂后的部分b离子和y离子质谱峰；[M+H]+表示iturin A的质子化峰。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。 实施例l:油菜菌核病拮抗菌株X-Ol的分离、筛选与鉴定第一步菌株的分离(稀释平板法，参照赵斌等，微生物学实验(第一版).北京科学 出版社，2002年介绍的方法)。从湖北省武汉市华中农业大学油菜基地采取土样10 g，加入内装100 ml无菌水和玻璃 珠的三角瓶中，于150rpm摇床上振荡30min，得到土壤悬液。将土壤悬液在80。C加热处 理30min，使芽胞杆菌得到富集，取lml富集培养液加入9ml无菌水中，依次按照l(T2， 10—3， 10—4， 10—5稀释，取0.1ml不同梯度的稀释液在牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g，蛋 白胨10g， NaC15g，琼脂15g,用蒸馏水定容至1 L, pH 7.2 )上涂布均匀，倒转平板， 3(TC保温培养2-3天，得到长有单菌落的平板。第二步拮抗菌株X-01的筛选在土豆培养基(新鲜去皮土豆20 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，用自来水定容至1 L，pH 6.5) 平板上接种核盘菌，株号Let-27，参见姜道宏等，盾壳霉控制油菜菌核病菌再侵染及 其叶面存活的动态研究，植物病理学报，2000年2月第30巻第1期第60-65页，20'C培 养2天后，用直径为5 mm的打孔器在菌丝边缘打孔获得带该核盘菌(Let-27)菌丝的琼脂 块。挑第二步分离培养得到的单菌落，接种在土豆培养基平板上，每个平板上接4株菌。 然后在平板中央接种一块带核盘菌菌丝的琼脂块。2(TC培养2天，观察拮抗效果，测量抑 菌带直径。共获得有拮抗效果的菌株13株。选抑菌带直经最大的菌株，在牛肉膏蛋白胨 液体培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaC15g，用蒸馏水定容至1L, pH7.2 )中摇瓶 发酵。培养温度3(TC;摇床转数150rpm;培养时间24h。发酵液离心后经细菌过滤器(0.2 Hm,Millipore,USA)过滤除菌。在土豆培养基平板中央放置带核盘菌菌丝的琼脂块，用打孔 器在平板周围距中心2.5 cm处均匀地打上直经为5 mm的小孔，滴入过滤液20 pl，每处理2 次重复,对照滴加牛肉膏蛋白胨液体培养基，置2(TC培养箱黑暗条件下培养2天，测量抑菌 带直径。按上述方法，最后得到一株对油菜菌核病菌有良好抑制能力的菌株X-Ol (见图2)。第三步X-Ol菌株的常规鉴定和分子辅助鉴定将X-Ol菌株接种在如上所述的牛肉膏蛋白胨培养基上，3(TC培养24h，观察记录单菌 落形态，同时进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验等(参 照赵斌等，微生物学实验(第一版).北京科学出版社，2002年介绍的方法)。16SrRNA 鉴定，采用上游引物27F 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，和下游引物1492R5'GGTTACCTGTTACGACTT3，扩增16S rDNA片段(Suzuki K等，v4grawyce;y mec/Zo/a"w sp.nov" nom. rev., comb, nov., a species for "Co ^we6ac/en'wm meifio/aww/w" Mamoli 1939 and for some aniline-assimilating bacteria which contain 2， 4陽diaminobutyric acid in the cell wall peptidoglycan. Int J Syst Bacterio, 1996, 46: 88-93)。采用20 jxl反应体系1 pi上游引物27F， 1 pi下游引物1492R, 0.2 pi dNTP， 0.2 TaqE , 1 pi Template, 2 pi 10xBuffer， 14.6 ^ ddH20。 PCR反应条件94。C, 1 min; 55°C， 1 min ; 72°C, 2 min， 30次循环，72。C延伸5min， PCR产 物经电泳纯化后克隆到pMD 18-T载体(购自大连宝生物公司)上，送上海生物工程技术有 限公司测序。将得到的 16S rDNA 序列提交 GenBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez db二nucleotide)禾口 RDP (Ribosomal Database Project) 数据库(http:〃rdp.cme.msu.edu/)，采用Blastn程序进行序列的同源性分析，用Clustal X进 行多序列比对(Thompson JD等，The CLUSTAL—X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res, 1997, 25: 4876-4882)，用MEGA3.0软件按Neighbor-Joining法构建系统发育树(Kumar S等，MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics， 2004， 5: 150-163 )。第四步X-01菌株的菌学特征及分类命名参照第三步中赵斌等，微生物学实验(第一版).北京科学出版社，2002年介绍的方法，对分离的X-01菌株的菌学特征进行了研究，特征如下X-01菌株菌体大小为0.7-1.0x1.6-2.5，菌体杆状，中生芽胞，革兰氏反应阳性；在牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌 落乳白色、边缘整齐、表面在开始2天有光泽，随培养时间延长变皱折；具有运动性，不 产色素，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中产菌膜；淀粉水解，柠檬酸盐试验，硝酸盐还原， V.P.试验，接触酶试验，酪素水解，石蕊牛奶还原试验为阳性；明胶水解，过氧化氢酶， 甲基红试验，产吲哚试验和卵磷脂酶试验为阴性；X-01菌株能利用葡萄糖产酸，不能利用 葡萄糖产气；X-01菌株的最适宜生长温度为3(TC。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版， 中译本，科学出版社，1984年)的检索表检索，X-01菌株的形态和生理生化特征与枯草 芽胞杆菌的性状相吻合。经过PCR扩增得到X-01菌株的16S rDNA片段(片段长度为15Ubp，见图3)，测序后与GenBank数据库中已知的13个枯草芽胞杆菌的16SrDNA同 源性为99% 。因此选取X-01菌株和RDP中相似性大的其它代表性菌株的16S rDNA序 列进行遗传距离计算，并根据遗传距离计算结果绘制系统发育树(见图4)，根据系统发育 分析可以确认本发明筛选得到的X-01菌株是枯草芽胞杆菌(^a"7/^^6ft7^)。X-01菌株的保藏培养基为常规牛肉膏蛋白胨培养基(如上所述)，培养温度30'C。 实施例2: X-Ol菌株脂肽类抗菌活性物质的纯化和结构鉴定挑X-Ol菌株单菌落在牛肉膏液体培养基(成分见上所述)中以3(TC， 150rpm振荡培 养16h，得种子液，然后将1 ml的种子液接种到装有100 ml发酵培养基(见后)的500ml 三角瓶中。所用发酵培养基组分为胰蛋白胨10 g、酵母抽提物2.5 g、葡萄糖5 g、 K2HP04 2.5 g、 MgS04'7H20 0.2 g，用蒸馏水定容至1000 ml, pH 7.2。培养温度3(TC;摇床转数 150 rpm;培养时间48 h。将X-01发酵液在相对离心力为lOOOOxg的离心机上离心15 min 除去菌体，取上清经截留分子量(MWCO)为100 KDa的超滤管(Amicon ultra-15 devices, Millipore， USA)超滤，滤过液再经截留分子量为30 KDa的超滤管浓縮至原体积的1/20， 弃去滤过液，取截留液上固相萃取柱(DIKMAProelUtC18，北京迪科玛公司生产)在固相 萃取装置(Supelco，USA)上分离(操作方法按照仪器厂家的操作说明进行)，依次用0%， 20%, 40%， 60%, 80%， 100。/。的甲醇/水溶液(V/V)梯度洗脱，收集活性组分(60%, 80%, 100% 甲醇/水洗脱组分，见图5)，经旋转蒸发仪(上海红叶生化仪器厂)于65'C水浴条件下浓 縮(按照仪器厂家的操作说明进行)得到含脂肽类抗生素iturinA的粗提物，粗提物用1 ml 甲醇溶解得到样品处理液-1，将样品处理液-1经高效液相色谱(HPLC)分离(色谱柱为大 连依利特分析仪器有限公司产品Hypersil BDS C18， 4.6mmx20mm， 5pm粒径；高效液 相色谱系统为美国Waters公司生产的515泵和2487双波长检测器)，流动相35%乙腈/ 水溶液(V/V);流速lml/min，检测波长210nm，进样量20pl;运行时间50 min。色谱 图见附图6，收集保留时间为IO分钟的色谱峰(见图6、图7)，于65'C水浴下旋转蒸发 浓縮至lml后转移到离心管中，用氮气吹干，得到脂肽类抗生素iturinA。将得到的脂肽类抗生素iturin A进行基质辅助激光诱导解吸附电离飞行时间质谱分析 (仪器为美国应用生物公司生产的Voyager-DESTR MALDI-TOF)，方法是&激光源、 波长337nm、正离子方式检测、反射方式(加速电压20KV，反射电压23KV)、基质为a-腈-4-羟肉桂酸(a-Cyno-4-hydroxycinnamicacid， CHCA)。质荷比(M/Z)为1043.9， 1065.9， 1081.9的离子峰分别为活性物质的[M+H]+， [M+Na]+， [M+K]+峰。结果表明本发明分离的 脂肽类抗生素iturinA的分子量分别为1042.9 Da(见图8)。将分离得到的脂肽类抗生素iturinA用电喷雾碰撞活化解离质谱技术分析(仪器为美国应用生物公司生产的Qtmp 3200 ESI-MS)，电喷雾条件为喷雾电压2.6kV、去簇电压60V、正离子方式检测、碰撞气体为 氮气。本发明分离得到的脂肽类抗生素iturinA产生的离子片断见图9，图9中各峰是实验 测定的质子化离子片断([M+H]+)质荷比。根据b型碎片(b2=212.3， b3=299.2, b4=524.4， b5=638.5， b6=8014.1 ， b7=915.4)和y型离子碎片(yl=129.1 ， y2=243.4， y3=406.2， y4=520.4， y5=745.7 ， y6=832.4 )的质荷比得到该脂肽类抗生素iturin A的肽段结构为 Pro陽Asn-Tyr-(3AA-Asn-Tyr-Asn-Gln (Yu GY 等，Production of iturin A by 5ac/〃iw fl附y/o/z々wey^c/era suppressing i /7/z0c/0m'a so/cm/. Soil Biol Biochem， 2002, 34: 955-963);根据 卩AA (f3氨基脂肪酸)的质荷比M/Z44-b3二225.2，可以推断脂肪酸链的长度应为14个碳 原子，其质子化结构为-H2N^CH-Q2H25-CO-，根据以上分析，本发明分离的枯草芽胞杆 菌X-01产生的分子量为1042.9 Da的抗生素属于iturin A。
实施例3:纯化的脂肽物质对油菜菌核病的离体防治实验
用无菌水将从X-Ol菌株发酵液中纯化得到的脂肽类抗生素iturinA分别配成lOO叱/ml， 10吗/ml和l吗/ml的溶液后喷雾于油菜叶片(油菜品种为Westar，五叶期)上。方法是将 油菜叶片置于垫有滤纸(用无菌水浸湿)的大玻璃平皿(直径20 cm)中，每平皿3张叶片，每处 理3次重复，每张叶片中央接种一个核盘菌菌丝块(Let-27)，置28'C、光/暗为14h/10h条 件下培养96h后测量各处理的发病斑直径，分别以清水和多菌灵(市场上购买)为阴性和 阳性对照。按计算公式抑制率(％)=(清水对照病斑直径_处理病斑直径)/清水对照病 斑直径xl00。/。计算抑制率。实验重复3次，取平均值。X-01菌株产生的脂肽类抗生素iturinA 浓度为100 ng/ml时对油菜菌核病的防治效果达100。/。，浓度为10 pg/ml时的防治效果达到 40.7%,明显优于多菌灵，说明本发明分离的X-01菌株产生的脂肽类抗生素iturinA对核盘
菌有很强的抑制作用，参见表l。
表l X-01菌株产生的脂肽类抗生素iturinA对油菜菌核病的离体防治效果
使用浓度病斑直径抑制率
(昭/ml)(mm)(%)
1000100
1023.740.7
13512.5
多菌灵(100吗/ml)25.536.3
清水对照40
权利要求
1. 一株防治油菜菌核病的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)菌株X-01，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号是CCTCC NOM 208067。
2、 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，该菌株分泌一种脂肽类抗生素 iturinA，其分子量为1042.9 Da。
3、 一种制备脂肽类抗生素iturinA的方法，其特征在于-1) 将保藏编号为CCTCCNO: M 208067的枯草芽胞杆菌菌株X-01进行液体 振荡活化，并接种于液体培养基中，培养温度3(TC;摇床转数150rpm;培养时 间48 h，得到含脂肽类抗生素iturin A的发酵液；2) 将步骤l)得到的发酵液在相对离心力为10000xg的离心机上离心15min 除去菌体，取上清，用截留分子量为100 KDa的超滤管超滤，滤过液再用截留 分子量为30KDa的超滤管浓縮至原体积的1/20，弃去滤过液，取截留液上固相 萃取柱分离，依次用0%，20%,40%,60%，80%, 100%的甲醇/水溶液(V/V)梯度 洗脱，收集60%, 80%, 100%洗脱组分，用旋转蒸发仪于65'C水浴条件下浓縮得 到含脂肽类抗生素iturin A的粗提物；3) 将步骤2)得到的粗提物用lml甲醇溶解得到样品处理液-1，将样品处理 液-1用高效液相色谱仪分离，色谱柱的参数为填料Hypersil BDS Cl8， 4.6 mmx2 Omm， 5pm粒径，高效液相色谱条件流动相35%乙腈/水溶液(V/V);流速1 ml/min，检测波长210nm，进样量20 运行时间50min，收集保留时间为10 分钟的色谱峰，于65。C水浴下旋转蒸发浓縮至1 ml后转移到离心管中，用氮气 吹干，得到脂肽类抗生素iturinA;其中步骤l)所述的液体培养基的组分为每1000 ml培养基中含有胰蛋白 胨10g，葡萄糖5g， K2HP042.5 g， MgSO4'7H2O0.2g， pH7.2。
4、 权利要求1所述的菌株在制备防治油菜菌核病的抗菌产物中的应用。
5、 权利要求2所述的脂肽类抗生素iturinA在防治油菜菌核病中的应用。
全文摘要
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株对油菜菌核病有抑制作用的拮抗菌X-01菌株的分离筛选，抗菌活性物质的分离与应用。本发明的X-01菌株已经保藏在中国典型培养物保藏中心(保减号为CCTCC NOM 208067)。通过形态学观察、生理生化分析和16S rDNA同源性分析，鉴定X-01菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株能够分泌一种脂肽类抗生素iturin A，其分子量为1042.9Da。本发明还公开了利用X-01菌株制备脂肽类抗生素iturin A的方法。离体生防试验表明，本发明制备的脂肽类抗生素iturin A对油菜菌核病菌具有明显的抑制效果，脂肽类抗生素iturin A浓度为100μg/ml时防治油菜菌核病的效果达100％，浓度为10μg/ml时的防治效果达到40.7％。
文档编号A01N37/18GK101270344SQ20081004765
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月12日 优先权日2008年5月12日
发明者进 何, 刘子铎, 喻子牛, 明 孙, 张吉斌, 徐爱章, 李明顺, 郑世学 申请人:华中农业大学