技术领域本发明涉及育种领域，具体涉及一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法。
背景技术：
我国是世界上甜、辣椒(CapsicumannuumL)种植和消费量最多的国家。自上世纪80年代，市场需求和种植面积不断扩大，播种面积由80年代末400万亩增加到如今3000万亩(王立浩等，2016)。病毒病是甜、辣椒生产中最主要的病害，可造成减产30-70％或绝收，同时严重降低产品品质。烟草花叶病毒TMV在露地和保护地(特别是保护地)均有发生，原来的抗病品种(含L1、L2基因)表现为不抗，被病害所克服。L3报道抗TMVP(0,1,2),L4基因抗TMVP(0,1,2,3)，能够对抗TMV、ToMV、PMMoV。目前保护地辣椒生产中烟草花叶病毒属的TMV、ToMV、PMMoV对于生产造成了很大威胁。保护地长季节生产面积增加较快，但我国传统的辣椒资源的抗病性不强，限制了保护地品种的选育；因此一度长季节保护地所用品种几乎全部为国外品种，培育具有国内品种成为我国蔬菜育种工作者的迫切任务。
技术实现要素：
本发明的目的建立一种高效的辣椒育种方法，将L3基因的抗烟草花叶病毒病性导入到配合力高，大果，优良自交系0516中。本发明利用200374:PI152225是属于中国辣椒(C.Chinense)，2003年法国农业科学院AlainPalloix博士提供，群体整齐，分枝性强，果实小(1.6cm×4.0cm)。在我国北方结果性差，同一年生辣椒杂交亲和性低，含有L3基因，高抗TMV，作为抗TMV抗原材料。200316:SOLARIO，2003年从法国引进的甜椒F1品种。果实大，灯笼形，中抗CMV和疫病。根据本发明的育种方法，PI152225与200316进行边分离、边回交转育，并采用分子标记辅助选择L3基因的方法。材料经过了5代回交和3代的自交，获得纯和自交系0516。经过鉴定0516抗TMV。自交系0516，生长势中，叶大、叶量大，叶色深绿。茎有细绒毛，中晚熟，始花节位9.7，平均单果重200克，果实纵径11.1厘米，横径9.9厘米，3-4心室，果实绿略浅，果面光滑、有光泽。2005年经人工接种鉴定，抗病性：TMV抗性8.9；CMV抗性29.5，疫病43.9。6个组合产量情况，其中折合亩产产量最高的组合是0516、KLS。6份材料的产量一般配合最高的是0516，分别是222.4。根据本发明的利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法包括以下步骤：(1)种间杂交：以PI152225为母本，Solanrio为父本进行杂交，经过浸种、发芽，获得了F1代植株；(2)分子标记辅助选择，提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，利用CAP分子标记进行选择，其中所用引物为：F:5’-GTGCCAGAGGAGGATTTAT；R:5’-GCGAGGTGGACACTGATACT；(3)结合生长性状选择筛选材料，根据抗病性筛选材料，抗病性筛选标准为：TMV抗性8.9；CMV抗性29.5，疫病43.9；(4)回交：利用步骤筛选的材料为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择，经过5代回交，和3代自交获得材料选择系谱见图3。图1显示了BC1代不同单株的L3分子标记的多态情况。材料经过了5代回交和3代的自交，获得纯和自交系0516。根据本发明的具体实施方式，所述利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法包括步骤：(1)种间杂交：自2003年开始，利用两份材料进行了种间杂交，以PI152225(美国农业部种子资源库编号)为母本，Solanrio(商业品种)为父本进行杂交。杂交亲和力低，产籽率低，仅获得少数几粒饱满种子。经过正常的浸种、发芽，获得了F1代植株。(2)基因组DNA的提取与检测提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，用于检测供筛选分子标记的多态性。(3)分子标记辅助选择：建立了种间杂交和分子标记辅助选择的育种技术体系：CAPS标记：引物：F:5’-GTGCCAGAGGAGGATTTAT；R:5’-GCGAGGTGGACACTGATACT；反应体系：DNA100ng，引物0.25μmmol·L-1。PCR：94℃3min,94℃变性30s，60℃30s，72℃30s，35循环，72℃5min，4℃保存。分子量568bp,共显性标记，XbaI,TaqI,或HaeIII三种酶中任意一种酶切。PCR产物的检测：取3μlPCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。(4)回交：利用0516为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择。经过5代回交，和3代自交获得材料13P65，即0516。经人工接种鉴定，抗病性：TMV抗性8.9；CMV抗性29.5，疫病43.9。本发明的优点是1)种间材料获得抗源(L3基因在一年生辣椒中没有发现)；2)利用分子标记准确在回交中辅助选择，提高了育种效率。附图说明图1BC1代群体中单株的标记分离情况，1-24：不同单株图2显示抗病性人工接种21天后的植株发病情况1：0516，2：对照品种“茄门”。图3系谱图。具体实施方式实施例1(1)种间杂交：自2003年开始，利用两份材料进行了种间杂交，以PI152225为母本，SolanrioF6(-0-14-17-1-3)为父本进行杂交。杂交亲和力低，产籽率低，仅获得少数几粒饱满种子。经过正常的浸种、发芽，获得了F1代植株。(2)基因组DNA的提取与检测提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，用于检测供筛选分子标记的多态性。(3)分子标记辅助选择：建立了种间杂交和分子标记辅助选择的育种技术体系：CAPS标记：引物：F:5’-GTGCCAGAGGAGGATTTAT；R:5’-GCGAGGTGGACACTGATACT；。分子量568bp,共显性标记，XbaI,TaqI,或HaeIII三种酶中任意一种酶切。PCR产物的检测：取3μlPCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。(4)回交：利用0516为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择(选择标准是：果实大、座果多、抗病性强)。经过5代回交，和3代自交获得材料0516。2006年自交系利用TMV病毒(重花叶株系)进行接种鉴定。TMV病毒采用普遍流行株系。鉴定方法参考Tomita等(2008)。每个材料接种30株，接种21天后进行调查。经人工接种鉴定，抗病性：TMV抗性8.9；CMV抗性29.5，疫病43.9。抗病性人工接种21天后的植株发病情况1：0516，2：对照品种“茄门”(图2)。配合力分析：选取6个自交系AF5；0516；CL1421；RQN；KLS；0601M；双列杂交配置组合。进行小区产量测定，三次重复。表1列出了所有组合产量情况，其中折合亩产产量最高的组合是0516、KLS。6份材料的产量一般配合最高的是0516，分别是222.4。表1不完全双列杂交组合的平均折合亩产情况(2010年)A＝AF5；B＝0516；C＝CL1421；D＝RQN；E＝KLS；F＝0601M；表26份材料产量一般配合力表现(GCA)表1、表2看出，甜椒自交系0516在参比的6个自交系中的产量一般配合力最高，表明这是一个优良的亲本自交系，可以在杂交配组中采用。考虑聚合其他抗病性，进一步提高该自交系的配合力。对于选育品种，特殊配合力具有更直接的作用。