专利名称：一种具有抗氧化功能的基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种具有抗氧化功能的基因、其编码蛋白及其应用。
背景技术：
盐藻(Z W7aWeWa)(又称杜氏盐藻)是一种生存于极端环境下的真核单细胞绿藻，对环境具有极强的适应能力，是已知最耐盐的真核生物能耐受高盐、重金属、强烈紫外线辐射等环境胁迫。因此，盐藻成为了一个重要的抗逆基因资源宝库。
世界人口日益增长，耕地面积日趋减少，提高农作物产量成为了解决这对矛盾的重要途径。然而，干旱、土壤盐渍化、极端温度和营养贫瘠等各种环境胁迫严重影响了农作物的生长和发育并降低其产量。所幸的是，开发抗逆基因、运用基因工程手段来提高作物对这些非生物胁迫的抗性、改良作物对环境的适应能力已经成为了提高农作物产量的有效途径之一。氧化胁迫正是上述各种初级环境胁迫的次级胁迫，其典型的特征是生物体内会积累高浓度的活性氧化物(R0S)。 R0S是由氧形成的几种活性物质的总称，主要是超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢单线态氧4种。高浓度的ROS能与蛋白质、核酸和脂类发生作用而引起蛋白质失活和降解、DNA链断裂和膜脂过氧化等现象，从而导致细胞结构和功能的破坏，严重影响到农作物正常的生理功能。因此，提高植物抗逆性的一个全新思路就是开发抗氧化基因，清除植物体内多余的ROS，提高植物对氧化胁迫的耐受性。
高等植物中被广泛研究的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸专一性过氧化物酶(AP)、谷胱甘肽还原酶(GR)。 Peroxiredoxin是近年来新发现的一类过氧化物酶，它在清除ROS中具有重要的作用。Peroxiredoxin是一类抗氧化蛋白超家族，广泛分布于原核生物和真核生物中。最初在酵母中发现了第一个该家族蛋白，被命名为巯基特异性抗氧化酶。该家族所有蛋白均在N端具有保守的Cys残基，有的成员在C端还具有保守的Cys。根据其保守Cys数目的不同，可以分为4个亚类2-Cys Prx、非典型2_Cys Prx(也叫PrxII)、 l-Cys Prx和PrxQ。
Preoxiredoxin家族基因广泛地参与了一些重要的生命活动最重要的生物学功能是将过氧化物或者超氧化物、垸基过氧化物、过氧亚硝酸盐分别还原成水、对应的醇和亚硝酸盐，其作用方式是分子内的活性Cys被过氧化氢氧化成次磺酸，再由硫氧还原蛋白为供氢体将还原型辅酶II的质子转移至Peroxiredoxin使其恢复原来的结构和功能；此外，Preoxiredoxin还参与了细胞的增殖和分化；保护自由敏感蛋白；通过调节细胞内过氧化氢的浓度来参与细
3胞因子信号及联放大等。EST数据表明，盐藻体内存在一套复杂的抗氧化基因，构成了庞大的抗氧化系统，这些抗氧化基因的功能可能与盐藻显著的抗逆能力有着密切的联系。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抗氧化功能的基因，该基因是从盐藻("wah'e^aw'rjVA)中分离出来的过氧化物还原蛋白五基因，称为"K^ys尸ny。本发明的目的之二在于该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。本发明的目的之四在于提供一种载体，该载体含有本发明的基因。本发明的目的之五在于提供一种含有本发明基因的宿主细胞。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种具有抗氧化功能的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一-
1) 具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；
2) 与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
一种上述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一
1) 具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
2) 通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物学功能。
一种克隆上述的基因的方法，其特征在于该方法包括如下步骤
a) 将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体Zlyapl，在0. 2mM过氧化氢叔丁醇的筛选压力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆；
b) 将步骤a)得到的候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大肠杆菌进行扩增；把扩增以后的载体回转酵母突变体力yap/，得到在0.2mM过氧化氢叔丁醇处理下仍能够稳定生长的阳性克隆；
c) 利用限制性内切酶EcoRI/XhoI消化步骤b)得到的阳性克隆释放出插入片段，构建到
测序载体中，通过测序获得""O^/5/^基因的cDNA序列；一种重组载体，该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。200910196596.6 上述的宿主细胞为酵母或者大肠杆菌。
本发明提供的一种具有抗氧化功能的基因在提高生物体抗氧化能力方面具有重要的应用价值。
图1为本发明的基因的物种间同源性分析图。
图2为本发明的基因在酵母中的应用。B卩"WO^/^义在突变体力yap/中的互补结果。具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, AdamsA et al编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一"W6ys/^;f全长编码区的克隆与分析
将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体力ya;^，该突变体对氧化剂敏感，导致它不能在含有高浓度氧化剂的环境中生长。在0. 2mM强氧化剂过氧化氢叔丁醇(tB00H)的筛选压力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆。为了排除由于酵母基因组上自发突变造成的假阳性，将候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大肠杆菌进行扩增，将扩增以后的载体回转酵母突变体^K即厶在0.2mM tB00H处理下仍能够稳定生长得克隆即为真正的阳性克隆。对阳性克隆所携带的表达载体中的插入片段进行测序和同源比对，确认其属于2Cys-Preoxiredoxin的同源基因，将其命名为ZV26ys尸rY。测序得到了该基因的cDNA序列(SEQIDNOl)。对获得的基因进行分析"CCys/^x的cDNA全长914bp。其中0RF为606bp， 92nt处是ATG， 697nt处是终止子TAA。 Vector NTI9. 1. 0软件的分析结果显示最长读码框编码了一个含201个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为22.25kDa，等电点为5.75。
实施例二 "v^O^尸r;r编码的蛋白结构及同源分析
利用NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/structure/cdd/cdd. shtml)保守结构域分析系统对""6ys尸rx所编码的蛋白进行分析，结果显示该基因编码的蛋白具有2Cys-Prx结构域。利用Vector NTI9. 1. 0程序对ZVi，0^尸n的氨基酸序列进行同源比对分析，参见图1。分析结果显示，它与绿藻和哺乳动物的同源基因具有较高的同源性，如与衣藻CrPrx2和人HsPrxl的同源性分别是72. 1%和61.3%。与高等植物中的同源性则比较低，如与拟南芥At2CysPrxA的同源性仅为37.5%。图中，黑色阴影部分表示完全相同的氨基酸，灰色阴影表示保守的氨基酸。三角指明了2CysPrx家族中保守的2个Cys: r和C175。比对的物种分别是拟南芥At，衣藻Cr，盐藻Dv (*突出表示)，人Hs，酵母Sc。
实施例三Z^^ys尸rr在酵母中应用
(一) 酵母转化子的获得在0.2mM tBOOH压力下筛选盐藻的酵母表达文库，得到了插入片段为ZVitys,r;f全长cDNA的阳性克隆力/ap7[pAJ401-ZVi^/s尸n]。
(二) 酵母转化子的表型鉴定所用基本培养基为YNB，并加入所需氨基酸。筛选标记为尿嘧啶营养缺陷。所用表型展示培养基以不含tB00H的YNB培养基为对照生长条件，含0. 2mM和0.3mM tBOOH的YNB培养基为抗氧化表型分析生长条件。将筛选出来的酵母克隆》y邻/[pAJ401-Z "O^/^]在YNB培养基中培养至0D6。。=0. 6，以5 y L为一个滴度，并以五倍稀释度为系列稀释滴度，在表型展示培养基上展示酵母转化子抗氧化表型，参见图2。结果表明转化了 ""6ys尸r;f的酵母突变体可以在0. 2mM tB00H的培养基里生长，并且在0. 3mM tB00H下仍然有微弱表型，说明了该基因能够部分恢复酵母突变体的功能丧失，证明了 A^O^尸r义能够有效地提高生物体的抗氧化能力。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
6序列表
〈110〉 上海大学
〈120〉 一种具有抗氧化功能的基因、其编码蛋白及应用
〈歸 2
〈210〉 1
<211〉 914
〈212〉 讓
〈213〉 盐藻(Awah'e^a Writ's)
〈400〉 1
ggcacgaggctaagttacacg3ggalt3ttacacacttatctctacagcei60
gcacagagccgC3C￡LC8C3Ccatgcccatccccgtgcctggccgccccgc120
tccccagttcaaggctcccgccgtggtgaatggcgagctcgcctggacca180
gttg朋gggcaggtacaccgtgctgttcttctacccgctggacttcaccttcgtgtgccc240
caccgagatcgtggccttctccgaccgccagaaggagttcgELggCCatcaactgcaacct300
ggtcggctgcgcgagttcacccacctggcgttcgtgaacacgccccgcaa360
ca鄉gtggcctgggctgctgcaactaccccctgatgtctgaC38g犯C3ggaagatcgc420
aaacgactacggcgtgctgattgataacgcggcttacggcg3gg3tggCgccaccttccg480
tgccctgttcatcatcgaccccaagggcaccctgcgccaagtgaccattaatgacctgcc540
agtgggtcgcagcgttgatgaagcgctgcgcctggtc已aggccttccagttcacggatga600
gcacggtg邓gtgtgccctgccaactggacccccggcgccaagaccatg￡iaggg卿ccc660
cgtga卿eig3tgg3gt3CttctccaccctgtC3t犯gCgcctgcttggtgtgcgtgttc720
gtgtagggcttaggcgtgg￡Ltggtgtgtgagtgtgagtggcacccttgacgggccagcag780
ctgaaatgctcctggctgtc￡Lgcagggcctctgactgagggatgctgtga犯cgagtg犯840
agtcttgggactggcca^犯aaaaaaaaaa■
aaaa914
〈210〉 2〈211〉 201〈212〉 PRT〈213〉 盐藻(""/ a7ieWa〈400〉 2
Met Pro lie Pro Val Pro Gly Arg Pro Ala Pro Gin Phe Lys Ala15 10 15
Pro Ala Val Val Asn Gly Glu Leu Lys Asp lie Ser Leu Asp Gin
20 25 30
Leu Lys Gly Arg Tyr Thr Val Uu Phe Phe Tyr Pro Uu Asp Phe
35 40 45
Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu lie Val Ala Phe Ser Asp Arg Gin
50 55 60
Lys Glu Phe Glu Ala lie Asn Cys Asn Leu Val Gly Cys Ser lie
65 70 75
Asp Ser Glu Phe Thr His Leu Ala Phe Val Asn Thr Pro Arg Asn
80 85 90
Lys Gly Gly Leu Gly Cys Cys Asn Tyr Pro Leu Met Ser Asp Lys
95 100 105
Asn Arg Lys lie Ala Asn Asp Tyr Gly Val Leu lie Asp Asn Ala
110 115 120
Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Ala Thr Phe Arg Ala Leu Phe lie lie
125 130 135
Asp Pro Lys Gly Thr Uu Arg Gin Val Thr lie Asn Asp Leu Pro
140 145 150
Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe
155 160 165
Gin Phe Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Thr
170 175 180
Pro Gly Ala Lys Thr Met Lys Gly Asp Pro Val Lys Lys Met Glu
185 190 195
Tyr Phe Ser Thr Leu Ser
200
权利要求
1.一种具有抗氧化功能的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
2. —种根据权利要求1所述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之1) 具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2) 通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同 的生物学功能。
3. —种克隆根据权利要求1所述的基因的方法，其特征在于该方法包括如下步骤-a) 将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体J yapl ，在0. 2mM过氧化氢叔丁醇 的筛选压力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆；b) 将步骤a)得到的候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大肠杆菌 进行扩增；把扩增以后的载体回转酵母突变体^/ap7，得到在0. 2mM过氧化氢叔丁醇 处理下仍能够稳定生长的阳性克隆；c) 利用限制性内切酶EcoRI/Xho1消化步骤b)得到的阳性克隆释放出插入片段，构建到 测序载体中，通过测序获得"WO^尸r义基因的cDNA序列；
4. 一种重组载体，该重组载体含有上述的基因。
5. —种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。
6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为酵母或者大肠杆菌。
7. —种根据权利要求1所述的基因在提高生物体抗氧化能力中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗氧化功能的基因、其编码蛋白及其应用，该基因是来源于盐藻的过氧化物还原蛋白基因，称为Dv2CysPrx。本发明采用了酵母遗传功能互补系统筛选得到了Dv2CysPrx基因，并且证明了该基因能够提高模式生物酵母的抗氧化能力。所公开的全长基因及氨基酸序列为盐藻中的首次报道，丰富了抗氧化酶基因家族的成员；该基因能够有效增强细胞的氧化抗性能力，证明了其在使用基因工程手段提高生物体抗氧化方面的应用价值。
文档编号C12N15/53GK101671682SQ20091019659
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月27日 优先权日2009年9月27日
发明者唐远平, 孟祥宗, 宋任涛, 段艳芳, 袁慧娟, 许政暟 申请人:上海大学