专利名称：一株分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌。
背景技术：
表面活性剂(Surfactant)是一种两亲性分子，含有一个亲水基团和一个亲脂基 团，疏水基团通常是碳氢化合物，而亲水基团则是带正电、负电或两性的基团。由于同一分 子中同时具有亲脂基团和亲水基团，因此表面活性剂趋向于液相与另一种极性和氢键力 不同的液相或气相的界面(如水油界面)，并在界面形成分子层，从而降低界面能量(界面张 力)或表面张力。表面活性剂具有极其广泛的应用，包括乳化、发泡、去污、浸润、分散、絮凝、 润湿、铺展、渗透以及抗静电等功能。表面活性剂的增溶作用和表面张力降低、界面张力降 低、起泡、消泡、润湿、乳化、分散悬浮、凝聚等界面作用都与上述基本性能有直接或间接的 关系。特别是在石油开采领域，表面活性剂的应用可显著提高石油开采率。
发明内容
本发明的目的提供了一株能够分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌。本发明分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M 2010056。本发明枯草芽孢杆菌Hd-322-2能够通过自身的新陈代谢分泌表面活性剂，并可 将表面活性剂分泌到细胞外。本发明枯草芽孢杆菌Hd-322-2的生化特点如表1所示。表 1
本发明枯草芽孢杆菌Hd-322-2经16S rDNA序列分析为枯草芽孢杆菌新菌株(与枯草 芽孢杆菌同源性最高，达99%)。本发明枯草芽孢杆菌Hd-322-2为革兰氏阴性菌，芽孢染色，荚膜无染色；菌落为 黄色、无核、表面光滑、透明，边缘整齐，菌落直径< 1mm。本发明枯草芽孢杆菌Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)属于芽孢杆菌属(Bacillus Cohn, 1872)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学， 保藏日期为2010年3月15日，保藏号为CCTCC NO :M 2010056。
图1是具体实施方式
一中枯草芽孢杆菌Hd-322-2与Genbank中收录的相近菌株 的16S rDNA所构建的系统发育树。图2是具体实施方式
一中枯草芽孢杆菌Hd-322-2的生 长曲线图。图3是具体实施方式
一中枯草芽孢杆菌Hd-322-2需氧性实验结果图。图4是具体实施方式
一中枯草芽孢杆菌Hd-322-2发酵液色谱分析结果图。图5是具体实施方式
一中枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂薄层色谱分析结果图。图6是具体实施方 式一中枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂提纯后的图片。图7是具体实施方式
一 中枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂红外光谱图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO :M 2010056。本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2由大庆油田采油厂污水中筛选获得，经分离 纯化、血平板初筛和排油圈复筛三个步骤得到
一、分离纯化
大庆油田采油厂污水采用稀释涂平板法涂布于普通牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养， 培养温度为37°C，普通牛肉膏蛋白胨培养基pH值为7. 0 7. 2。培养24小时后挑取单菌 落进行纯培养(培养基为普通牛肉膏蛋白胨培养基)。二、血平板初筛
血平板初筛用培养基为血琼脂培养基。将5.0g牛肉膏、lO.Og蛋白胨、5.0g NaCl、 15. 0g琼脂和蒸馏水1000mL(调节pH值为7. 0 7. 2)121°C灭菌20min后冷却至50°C再加入 培养基体积5% 10%的无菌脱脂纤维猪血(或兔血、绵羊血)制成血琼脂培养基。无菌脱脂 纤维猪血加入前在37°C水箱内预热30分钟，加入过程中要轻轻摇勻，以避免产生气泡而影 响光滑度，浇制培养基时环境温度不宜过低(控制在25 35°C)，培养基厚度应为2 3mm (以免影响观察溶血环效果)。通过平板划线或涂平板的方法将富集的纯培养的单菌落接种 于血平板上，然后37°C培养纩3天，再挑取有溶血圈的菌落进行液体培养(采用无机盐液 体培养基，本实施方式中所用的无机盐液体培养基由0. 5g的MgS04 7H20、1. 0g的NH4N03、 1. 0g 的 K2HP04.3H20、1. Og 的 KH2P04、5. Og 的葡萄糖、0. 02g 的 CaCl2、痕量的 FeCl3 禾口 lOOOmL 蒸馏水制成，无机盐液体培养基pH值为7. (T7. 2)。三、排油圈复筛
在平皿中倒入20 25mL蒸馏水，然后加入lmL液体石蜡，再加入10 u上一步骤制备 的含有有溶血圈菌落的液体培养，观察排油圈，挑选排油圈大的菌落进行纯化培养，即得到 本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2。
排油圈越大说明该微生物新陈代谢分泌出细胞外的物质中所含有的表面活性剂 成分越多。因此，试验结果说明本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2能够向细胞外分泌出更 多的表面活性剂。枯草芽孢杆菌Hd-322-2为革兰氏阴性菌，芽孢染色，荚膜无染色；菌落为黄色、无 核、表面光滑、透明，边缘整齐，菌落直径< 1mm ；其生化特点如本发明表1所示。枯草芽孢 杆菌Hd-322-2经16S rDNA序列分析为枯草芽孢杆菌新菌株(与枯草芽孢杆菌同源性最高， 达99%)，枯草芽孢杆菌Hd-322-2与Genbank中收录的相近菌株的16S rDNA所构建的系统 发育树如图1所示。枯草芽孢杆菌Hd-322-2测试实验(在没有特殊注明的情况下，被测试的枯草芽孢 杆菌Hd-322-2均接种于无机盐液体培养基，在37°C条件下进行发酵培养。无机盐液体培养 基由 0. 5g 的 MgS04 7H20、1. 0g 的 NH4N03、1. 0g 的 K2HP04 3H20、1. Og 的 KH2P04、5. Og 的葡萄 糖、0. 02g的CaCl2、痕量的FeCljniOOOmL蒸馏水制成，无机盐液体培养基pH值为7. (T7. 2。 无机盐液体培养基中枯草芽孢杆菌Hd-322-2的接种量为5%)
枯草芽孢杆菌Hd-322-2 (.Bacillus subtil is Hd-322-2)生长曲线测定 枯草芽孢杆菌Hd-322-2在无机盐液体培养基、37°C培养条件下，培养不同时间的0D_ 值如表2所示，生长曲线如图2所示。表2
枯草芽孢杆菌 Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)需氧性检测 穿刺培养全长约2. 5cm，枯草芽孢杆菌Hd-322-2生长约0. 6cm，需氧量较大，枯草芽孢 杆菌Hd-322-2需氧性实验结果如图3所示。盐度对枯草芽孢杆菌Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)的生长影响 枯草芽孢杆菌Hd-322-2在不同盐度条件下进行培养，OD600值如表3所示。实验结果说
明本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2具有较强的耐盐性，对油田地层环境具有一定的耐 受性，可用于石油开采。表3
温度对枯草芽孢杆菌Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)的生长影响 枯草芽孢杆菌Hd-322-2在不同温度条件下进行培养，OD600值如表4所示。实验结果说
酸度对枯草芽孢杆菌Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)的生长影响 枯草芽孢杆菌Hd-322-2在不同酸度条件下进行培养，OD600值如表5所示。实验结果 说明本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2可适应pH值为2. 07 10. 99的环境，特别是在pH 值为6. 82 8. 99的环境生长最为旺盛。
表 5
枯草芽孢杆菌 Hd-322-2 {Bacillus subtil is Hd-322-2)产酸实验 枯草芽孢杆菌Hd-322-2在pH值为7. 5的环境进行培养，不同培养时间下培养基的pH 值如表6所示，实验结果说明本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2产酸量较低。在高效液相 色谱条件下分析枯草芽孢杆菌Hd-322-2发酵液中的有机酸，结果如图4所示；枯草芽孢杆 菌Hd-322-2发酵液色谱分析得到得到琥珀酸(8. 419min) 0. 147g/L，乳酸(9. 718) 0. 098g/ L，乙酸(10. 899) 0. 788g/L，丙酸(12. 366) 0. 137g/L，丁酸(14. 791) 0. 187g/L。其中琥珀 酸、丙酸含量很少，不在线性范围之内，说明该菌主要产乙酸、丁酸、乳酸。
表 6
本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂进行提纯
(1)接种枯草芽孢杆菌Hd-322-2的无机盐液体培养基37°C发酵12h，然后4°C条件下10000r/min离心lOmin去除菌体；
(2)将上一步骤得到的上清液用浓度为6mol/L的HC1调解pH至2.0，然后4°C静置过
夜；
(3)4°CU0000r/min离心20min得到沉淀，将沉淀与去离子水混合(去离子水体积为 沉淀体积的3 5倍)，搅拌均勻，得到悬浮液；
(4)再用20%Na0H调解悬浮液pH值至7.0后进行冷冻干燥，得到浅褐色疏松状固体；
(5)取上述浅褐色疏松状固体置于甲醇中充分抽提，真空旋转去除甲醇后用稀NaOH 溶液溶解，再加入浓HC1调pH至2. 0，将得到的沉淀离心，并真空干燥去除残留的水分，即为 枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂冻干纯品(如图6所示)。本实施方式枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂产量为325mg/L无机盐液 体培养基。枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂定性分析
经薄层色谱分析层析板上最终显色为粉红色，初步定性为脂肽类表面活性剂，薄层层 析结果如图5所示。枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂红外光谱测定
枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂用红外光谱法(KBr压片法)测定其官能团 和分子结构(枯草芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂红外光谱图如图7所示)，说明枯草 芽孢杆菌Hd-322-2分泌的表面活性剂是脂肽类表面活性剂。枯草芽孢杆菌Hd-322-2降黏性实验
经DJ-8S型数显黏度计测得枯草芽孢杆菌Hd-322-2对原油降黏的实验结果如表8示。表8
实验说明枯草芽孢杆菌Hd-322-2能够产生细胞外表面活性剂，并能够有效降低原油 的黏性。
权利要求
一株分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌Hd 322 2(Bacillus subtilis Hd 322 2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM 2010056。
全文摘要
一株分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌，它涉及一株枯草芽孢杆菌。它提供了一株能够分泌表面活性剂的枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌Hd-322-2(BacillussubtilisHd-322-2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM2010056。本发明枯草芽孢杆菌Hd-322-2能够通过自身的新陈代谢分泌表面活性剂，并可将表面活性剂分泌到细胞外。
文档编号C12N1/20GK101928686SQ201010177478
公开日2010年12月29日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者康宏, 李盛贤, 贾树彪, 颜培强 申请人:黑龙江大学