专利名称：借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法
技术领域：
本发明属于油菜分子育种领域，具体涉及一种借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法。
背景技术：
雄性不育是甘蓝型油菜杂种优势利用重要途径。本发明所涉及的雄性不育系统是一种由隐性不育基因和隐性上位抑制基因互作控制的核不育系统(陈凤祥等，作物学报， 1998,24(4) :431-438)，该不育系统具有不育度高、不育性稳定；花瓣全开放、制种产量高且普通油菜品种均为其天然恢复系的特点。陈凤祥等提出通过纯合“两型系”和“临保系” 杂交获得全不育系再和“恢复系”(任一普通品种)杂交产生Fl杂种的“三系”利用模式 (专利号97125803. 1)，克服了传统隐性核不育“两系法”制种时需要人工拔除50%可育株的弊端。该不育系统自提出后倍受国内外育种家和多家育种单位关注，至今已成功培育出多个杂交组合应用于生产实践。然而在育种应用中发现有二个难点限制了该不育系统的应用和推广速度。一是多基因控制系统带来的杂交后代遗传分离复杂，两型系和临保系的改良费时费力效率低下；二是大面积用于制种的不育系实际为Fl杂种，而真正的杂交种为三交种，这在一定程度上会引起优势衰减和纯度下降，可能成为该不育系统得以大范围和大面积应用的瓶颈问题。根据我们对该系统杂种分离后代多年田间育性调查、育性基因的分子鉴定以及标记辅助选育的反复实践，认为普通油菜品种在隐性不育基因位点均含显性可育等位基因；隐性上位抑制基因位点存在隐性和显性二种等位基因分布；第二对隐性不育重叠基因在绝大多数品种为ms4ms4基因型或不存在第2个不育基因位点。
发明内容
为了解决上述存在的技术缺陷，本发明目的是提出一种借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，根据隐性上位核不育“三系”利用模式选育出具有相同优良品种(系)遗传背景的“纯合二型系”和临保系，从而获得遗传稳定的全不育系，实现大量生产F1 (单交种)油菜杂交种的目的，减少和避免三交种应用于生产可能出现的长相不一致和优势下降的问题。为了实现上述的技术目的，本发明采用了以下的技术方案借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，该方法包括以下的步骤1)首先用待转育的品种或品系分别与已知稳定两型系中的纯合不育株及稳定临保系植株分别进行杂交，F1代自交获得F2分离群体；2)根据待转育品种或品系与稳定临保系杂交F2世代育性分离情况，确定下一步转育途径，若有育性分离则利用待转育品种或品系和临保系杂交F2代作为下一轮转育群体； 若无育性分离，则以两型系中纯合不育株与待转育品种或品系杂交F2群体作为下一轮转育群体；3. 1)待转育品种或品系与临保系杂交F2代作为转育群体时，利用MS3/mSjnRf/rf 基因紧密连锁分子标记选出临保系基因型单株，并作为父本与待转育的品种或品系回交， 自交一代后 获得BC1F2代，然后重复上述同样的方法进行标记鉴定、回交和自交，直至BC3F2 或更高回交、自交世代；3. 2)待转育品种或品系与两型系中纯合不育株杂交F2代作为转育群体时，开花后分子标记鉴定不育株，选取纯合不育株基因型与待转育的品种或品系回交，自交一代后获得BC1F2世代，然后重复同样的方法进行标记鉴定、回交和自交，直至BC3F2或更高回交、自交世代；4)对转育BC3F2或更高回交自交世代，先用MS3AiS3紧密连锁分子标记鉴定所有单株，筛选出MS3His3和ms3ms3标记基因型后继续用Rf/rf连锁分子标记进一步检测，最后选出转育两型系MS3His3RfRf、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf标记基因型单株；5)对选出的纯合两型系MS3HiS3RfRf、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf基因型植株进行田间表型鉴定，以待转育品种或品系为对照，进行长势长相的一致性比较试验，收获种子进行品质检测，最终选取长相和待转育品种或品系一致，品质达双低标准的纯合两型系 MS3His3RfRf、ms3ms3RfRf及临保系ms3ms3rfrf基因型株系，在隔离环境中以一定比例相间种植纯合两型系及临保系，现蕾初花后拔除两型系中可育株，成熟时收获不育株上种子，即获得遗传稳定的全不育系提供大田制种。6)临保系基因型材料自交繁种，纯合不育系由纯合两型系可育株和不育株间兄妹交繁衍。作为优选，对分离世代的标记辅助选择，提取油菜单株叶片的基因组DNA，用与 MS3Ais3和Rf/rf连锁的Ml和M2共显性分子标记引物进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出纯合两型系MS3His3RfRf、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf基因型单株。作为优选，上述与MS3Ais3连锁分子标记Ml引物的上下游序列分别是5' -GTCTGTTTCTCTTCCCGTTGTC-3'禾P 5' -GTGCTGCTCCGGTGTTATC-3‘；与 Rf/ rf连锁分子标记M2引物的上下游序列分别是5’ -AGGAAGCCCAACAGGACTTT-3，和 5，-AATTCGATTCTCCATCGTGC-3，。当然本发明中需要的与MS3Ais3连锁分子标记也可以采用文献“Theor Appl Genet (2007) 115 :113_118，Theor Appl Genet (2008) 117 :11_18，，； 与Rf/rf连锁分子标记引物也可以参考“Plant Breeding (2008)，127，145-149”和 Euphytica(2008)，164(2) :377_384 上公开的引物。作为优选，步骤3. 1)所述的临保系基因型单株与已知纯合不育株mS#S3RfRf测交，夏繁加代鉴定临保系基因型。作为优选，步骤3. 2)所述的纯合不育株与已知稳定临保系ms#s3rfrf测交，夏繁加代验证选出的纯合不育株基因型。本发明由于采用了上述的技术方案，本发明的优点在于1、本发明提出利用与隐性核不育基因和隐性上位抑制基因紧密连锁的共显性分子标记的辅助筛选策略，可轻松地从分离世代中目标准确地挑选出临保系基因型(1/13) 和纯合不育系基因型(1/3)继续回交；再经过一次杂交，接着连续回交加自交3-4轮直至分离群体遗传背景和待转育品种基本相同。最后从BC3_4F2分离世代中，利用分子标记同时筛选出纯合两型系和临保系基因型。该发明将显著减少选育工作量，大大提高选育准确率和成功率。该方法的提出将使得甘蓝型油菜隐性上位核不育系统的应用潜力和应用价值成倍增长。 2、根据本发明提出的选育策略，有望用4-5年时间在相同优良遗传背景群体内同时获得纯合两型系和临保系基因型，进一步在隔离环境下，生产出遗传稳定的全不育系种子应用于大面积制种。收获的杂种是普通的单交种，改变了该系统目前大面积生产用种实际为三交种的现状，避免可能带来的整齐度差优势下降的风险。3、本发明针对油菜品种在二个育性相关基因上实际存在的二种基因型模式，提出了针对MS3MS3RfRf基因型的品种转育时宜选择临保系基因型ms3ms3rfrf为供体亲本；而针对MS3MS3rfrf基因型的转育亲本时则要选择纯合不育系H^ms3RfRf为供体，方能保证转育后代中出现各种可能的基因型；另转育程序中提出“夏繁”非分离世代，正常生长季种植分离世代，交替进行的模式。这是考虑到异地“夏繁”宜简化程序，避免选择失误(不可能标记检测的情况下)，而正季生长环境下，利用标记辅助筛选，从膨大的分离群体中筛选出少数目标基因型个体继续回交转育，从各个方位体现了时空上的巧妙结合，达到最佳和最快的选择效果。
图1为本发明的技术流程图。
具体实施例方式如图1所示的借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，该方法所采取的技术方案包括以下步骤1、待转品种隐性上位抑制基因位点等位基因确认为确保无误，首先待转品种同时与稳定两型系中的纯合不育株以及临保系(为父本)杂交，Fl自交，从F2世代有无育性分离判定待转品种为MS3MS3RfRf(与临保系杂交F2代有不育株分离，不育/可育3/13)或 MS3MS3rfrf(与临保系杂交F2代无不育株分离)基因型。2、如果待转育品种为MS3MS3RfRf基因型，按以下步骤继续1)待转育品种为母本MS3MS3RfRf与已知临保系ms3ms3rfrf植株进行常规有性杂交，F1代夏繁套袋自交产生F2代。正常生长季种植F2分离群体，苗期按单株提取DNA，先用 MS3Ais3紧密连锁分子标记检测所有单株，选出ms3ms3标记基因型后继续用Rf/rf紧密连锁分子标记进行筛选，获得临保系标记基因型单株。2)选出的临保系标记基因型ms3ms3rfrf单株，一边继续用待转育品种MS3MS3RfRf 为母本回交，产生BClFl世代，一边与已知纯合不育株mS3ms3RfRf测交，夏繁加代鉴定临保系基因型。同时BClFl套袋自交产生BC1F2世代。下一世代重复第一步骤，正常生长季节种植分离群体，标记辅助中选出纯合不育株继续回交；夏繁种植非分离群体，只需自交加代， 直至BC3F2世代。3)扩大BC3F2种植群体(1000株以上)，苗期提取单株DNA，先用MS3Ais3紧密连锁分子标记鉴定所有单株，筛选出MS#s3和ms3ms3标记基因型后继续用Rf/rf连锁分子标记分析检测，最后选出转育两型系MS3His3RfRff、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf标记基因型单株。同时可重复第一步骤继续选择临保系mS#S3rfrf标记基因型回交，产生更高世代的转育两型系和临保系。4)标记辅助转育两型系不育mS3mS3RfRf和可育株MS3His3RfRf间兄妹交；转育临保系ms3ms3rfrf与已知纯合不育株ms3ms3RfRf测交；转育纯合不育株ms3ms3RfRf与已知临保系ms#s3rfrf测交；转育两型系可育株MS^s3RfRf与已知纯合不育株测交并套袋自交。下个世代调查所有测交和自交后代的育性表现，若转育临保系与已知纯合不育株测交，后代全不育，则临保系转育成功。若转育的纯合不育株与已知的临保系测交，后代全不育，而转育两型系可育株MS3His3RfRf与已知纯合不育株测交，后代1 1(可育不育)分离，自交后代3 1(可育不育)分离，则转育两型系获成功。5)对所有转育成功的两型系和临保系株系进行田间表型鉴定和品质检测，选育出产量水平、植株形态、抗性要求和品质标准与待转育品种一致的两型系和临保系。然而根据陈凤祥等(作物学报，1998，24 (4) 431-438)提出的方法，在隔离环境下相间种植选育的两型系和临保系，初花期拔除两型系中的不育株，临保系与不育株之间自然授粉，成熟时收获不育株上种子，即得到遗传稳定且与待转育品种基因型基本一致的全不育系种子用于大面积制种。3、如果待转育品种鉴定为MS3MS3rfrf基因型，则按下列步骤继续1)待转育品种为父本MS3MS3rfrf与已知纯合不育系mS3ms3RfRf植株进行常规有性杂交，Fl代夏繁时套袋自交产生F2代。正常生长季种植F2分离群体，现蕾或初花后按单株提取不育株叶片DNA，用Rf/rf紧密连锁分子标记进行筛选，选出标记位点为纯合RfRf 的不育株ms3ms3RfRf。2)筛选出的纯合不育标记基因型mS#S3RfRrf单株，一边继续用待转育品种 MS3MS3rfrf回交，产生BClFl世代，一边用已知稳定临保系测交ms#s3rfrf，夏繁加代验证选出的纯合不育株基因型。同时BClFl套袋自交产生BC1F2世代。下一世代重复第一步骤， 正常生长季节用Rf/rf紧密连锁分子标记鉴定不育株，筛选出标记基因型为纯合不育的植株mS#S3RfRrf继续用待转育品种MS3MS3rfrf回交，测交、夏繁种植非分离世代，自交加代直至BC3F2世代。3)获得BC3F2代种子后，一边按上述第2节中转育基因型为MS3MS3RfRf的品种时的第三至第五步骤进行。一边可继续用待转育品种MS3MS3rfrf回交，进入更高一轮的回交、 测交和自交。
权利要求
1.借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)首先用待转育的品种或品系分别与已知稳定两型系中的纯合不育株及稳定临保系植株分别进行杂交，F1代自交获得F2分离群体；2)根据待转育品种或品系与稳定临保系杂交F2世代育性分离情况，确定下一步转育途径，若有育性分离则利用待转育品种或品系和临保系杂交F2代作为下一轮转育群体；若无育性分离，则以两型系中纯合不育株与待转育品种或品系杂交F2群体作为下一轮转育群体； 3. 1)待转育品种或品系与临保系杂交F2代作为转育群体时，利用MS3Ais3和Rf/rf基因紧密连锁分子标记选出临保系基因型单株，并作为父本与待转育的品种或品系回交，自交一代后获得BC1F2代，然后重复上述同样的方法进行标记鉴定、回交和自交，直至BC3F2或更高回交、自交世代；3. 2)待转育品种或品系与两型系中纯合不育株杂交F2代作为转育群体时，开花后分子标记鉴定不育株，选取纯合不育株基因型与待转育的品种或品系回交，自交一代后获得 BC1F2世代，然后重复同样的方法进行标记鉴定、回交和自交，直至BC3F2或更高回交、自交世代；4)对转育BC3F2或更高回交自交世代，先用MS3Ais3紧密连锁分子标记鉴定所有单株， 筛选出MS3His3和ms3ms3标记基因型后继续用Rf/rf连锁分子标记进一步检测，最后选出转育两型系MS3His3RfRf、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf标记基因型单株；5)对选出的纯合两型系MS3ms3RfRf、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf基因型植株进行田间表型鉴定，以待转育品种或品系为对照，进行长势长相的一致性比较试验，收获种子进行品质检测，最终选取长相和待转育品种或品系一致，品质达双低标准的纯合两型系 MS3His3RfRf、ms3ms3RfRf及临保系ms3ms3rkf基因型株系，在隔离环境中以一定比例相间种植纯合两型系及临保系，现蕾初花后拔除两型系中可育株，成熟时收获不育株上种子，即获得遗传稳定的全不育系提供大田制种。6)临保系基因型材料自交繁种，纯合不育系由纯合两型系可育株和不育株间兄妹交繁衍。
2.根据权利要求1所述的借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，其特征在于对分离世代的标记辅助选择，提取油菜单株的基因组DNA，用与 MS3Ais3和Rf/rf连锁的Ml和M2共显性分子标记引物进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出纯合两型系MS3His3RfRf、ms3ms3RfRf和临保系ms3ms3rfrf基因型单株。
3.根据权利要求1或2所述的借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，其特征在于与MS3Ais3连锁分子标记Ml引物的上下游序列分别是5’ -GTCTGTTTCTCTTCCCGTTGTC-3’ 和 5’ -GTGCTGCTCCGGTGTTATC-3，；与 Rf/ rf连锁分子标记M2引物的上下游序列分别是5’ -AGGAAGCCCAACAGGACTTT-3，和 5’ -AATTCGATTCTCCATCGTGC-3’。
4.根据权利要求1所述的借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，其特征在于步骤3. 1)所述的临保系基因型单株与已知纯合不育株mS3mS3RfRf测交，夏繁加代鉴定临保系基因型。
5.根据权利要求1所述的借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法，其特征在于步骤3. 2)所述的纯合不育株与已知稳定临保系n^ms^frf测交， 夏繁加代验证选出的纯合不育株基因型。
6.用于选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的分子标记，其特征在于 与MS3Ais3连锁分子标记Ml引物的上下游序列分别是5，-GTCTGTTTCTCTTCCCGTTGTC-3， 和5，-GTGCTGCTCCGGTGTTATC-3，；与Rf/rf连锁分子标记M2引物的上下游序列分别是 5' -AGGAAGCCCAACAGGACTTT-3‘和 5’ -AATTCGATTCTCCATCGTGC-3，。
全文摘要
本发明属于油菜分子育种领域，具体涉及一种借助分子标记选育油菜隐性上位核不育系统遗传稳定全不育系的方法。该方法提出通过分子标记与育性基因的紧密连锁，跟踪选择分子标记基因型来筛选出两型系和临保系基因型的程序，从而对这一由多基因控制的不育系统的育种策略由完全的表现型鉴定到基因型确认的地毯式搜索改进为目标明确的先标记基因型筛选后实际表现型确认的高效选育过程，通过多代回交、自交，田间表型鉴定，获得遗传背景相同，田间长势一致的纯合两型系和临保系，进而生产出遗传稳定的全不育系种子供大面积制种。改变了该不育系统目前大面积生产用种实际为三交种的现状，避免了由此可能带来的整齐度差和优势下降的问题。
文档编号C12N15/11GK102246690SQ201010177110
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者倪西源, 徐小栋, 赵坚义, 陈飞, 黄吉祥 申请人:浙江省农业科学院