专利名称：具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程或生物农药基因工程技术领域。具体的说，涉及一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用。
背景技术：
近几十年来，对昆虫病原微生物为主题的微生物杀虫剂展开了广泛的研究，微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同，其杀虫原理和机制也有所不同。现已证实细菌杀虫剂的杀虫机制通常与细菌毒素蛋白有很大的关系(喻子牛，苏云金芽孢杆菌的生产与应用[M].北京农业出版社1993)。自从第一个毒素蛋白白喉毒素被发现以来，相继在各种细菌中又发现了几百种毒素蛋白，并对其中部分毒素蛋白开展了详细的研究工作。至今发现的细菌毒素蛋白大多对人畜有致毒作用，而专一性作用于昆虫的细菌毒
素蛋白还所知甚少，而且主要集中于芽孢杆菌属的细菌，如苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌。目前应用最广泛的细菌杀虫剂为苏云金芽孢杆菌制剂。苏云金芽孢杆菌的杀虫作用主要由于它在芽孢形成期间产生杀虫蛋白晶体对多种昆虫具有毒力。由于其杀虫晶体蛋白作用专一，对环境无害，人畜安全，苏云金芽孢杆菌已在许多国家广泛推广。细菌杀虫毒素蛋白的发现和研究，为研制新型高效生物杀虫剂奠定了基础。随着分子生物学的发展和基因工程技术的日益成熟，已有许多的细菌杀虫毒素蛋白基因被克隆，例如已从苏云金芽孢的各种菌株中克隆了 100多个杀虫晶体蛋白基因(FeitelsonJ. S,Payne J, Kim L. Bacillus thuringiensis Insects and beyond[J]. BioTechnology,1992,10 :271-275)。这些毒素蛋白在植物转基因抗虫方面得到了广泛的应用缺少，然而，这些基因一般均为国外专利所保护，我国缺少具有自主知识产权的抗虫基因。另一方面，由于有限的几种高效活性杀虫蛋白基因的广泛使用，使得害虫对杀虫蛋白的抗性问题已经出现。因此寻找新的杀虫微生物、杀虫物质及新的毒素蛋白基因已成为国际研究热点。最近研究表明，某些肠杆菌科沙雷氏菌属细菌对某些鳞翅目、鞘翅目、直翅目和膜翅目害虫有致死作用。在嗜虫沙雷菌(serratia entomophila)杀虫蛋白的研究方面，UPADHYAYA等从嗜虫沙雷菌中鉴定出一段am_l基因组片段，它所编码的蛋白与嗜虫沙雷菌的杀虫活性密切相关(N. M. UPADHYAYA 等,Identification of a Serratia entomophilaGenetic Locus Encoding Amber Disease in New Zealand Grass Grub(Costelytrazealandica), Journal of Bacteriology, 1992，174 :1020-1028)。HURST 等在在嗜虫沙雷菌中找到了一个编码杀虫蛋白的长达115kb的大质粒pADAP，从中鉴定出了三个杀虫蛋白基因S印A，S印B，和S印C，由它们编码的三个蛋白共同作用可以引起新西兰草地蛴螬的琥拍病(MARK R. H. HURST 等，Plasmid-Located Pathogenicity Determinants of Serratiaentomophila,the Causal Agent of Amber Disease of Grass Grub, Show Similarity tothe Insecticidal Toxins of Photorhabdus luminescens, Journal of Bacteriology,2000,182 :5127-5138) 0随后，他们又从这个质粒中克隆到了一段的基因组片段amb_2，它编码的蛋白可以抑制新西兰草地蛴螬进食(MARK R. H. HURST等，Cloning Serratiaentomophila Antifeeding Genes—a Putative Defective Prophage Active against theGrass Grub Costelytra zealandica, Journal of Bacteriology，2004，186 :5116-5128)。然而，对于嗜虫沙雷菌中含有的杀虫蛋白还需要进行进一步的开发和研究，以期找到新的或更为有效杀虫物质或毒素蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的蛋白，该蛋白选自下组(a)如SEQ ID NO 2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；更佳地1_10个；更·佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(a)编码所述蛋白的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白。在另一优选例中，该多核苷酸的序列如SEQ ID N0:1所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种所述的蛋白的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的蛋白。所述的蛋白的用途，用于杀灭植物病原体。在另一优选例中，所述的植物病原体是鳞翅目害虫。在本发明的另一方面，提供一种农药组合物，它含有安全有效量(如0. 00005-10%% (w/w))的所述的蛋白、或所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物以及农药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞表达产物包括宿主细胞破碎后上清液、细胞破碎后沉淀、宿主细胞分泌产物、细胞发酵液等。在另一优选例中，所述的农药组合物pH值为6. 0-9. O ;或其温度为20_55°C。在另一优选例中，所述的农药组合物是PH值为7. 0-8. O ;更佳地其pH值为7. 5。在另一优选例中，所述的农药组合物是温度为30_45°C ;更佳地其温度值为40°C。在另一优选例中，所述的农药学上可接受的载体中包括蛋白稳定剂。在本发明的另一方面，提供一种杀灭植物病原体的方法，将所述的蛋白、或所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物、或所述的农药组合物施加于植物病原体。在另一优选例中，所述的施加包括注射、喷洒、喂食。在本发明的另一方面，提供一种提高植物抗病性的方法，包括将所述的多核苷酸转入植物中。在另一优选例中，所述的方法包括(I)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的多核苷酸；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞或组织或器官。在另一优选例中，所述方法还包括(3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。在本发明的另一方面，提供由所述的提高植物抗病性的方法获得的转基因植物。·本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I为本发明的嗜虫沙雷菌杀虫蛋白基因在大肠杆菌中的表达模式以及表达载体的构建。图2为本发明的嗜虫沙雷菌杀虫蛋白基因的DNA序列。图3为嗜虫沙雷菌杀虫蛋白的氨基酸序列。图4为本发明克隆的嗜虫沙雷菌Spro蛋白SDS-PAGE电泳分析。各泳道为M :蛋白质分子量标准；1 :空载体宿主诱导后的总蛋白；2 :重组菌诱导后总蛋白；3 :重组菌诱导后细胞裂解液上清；4 :重组菌诱导后细胞裂解液沉淀。图5为本发明的纯化的嗜虫沙雷菌Spro蛋白SDS-PAGE电泳分析。各泳道为M 蛋白质分子量标准；1 =OmM咪唑洗脱；2 20mM咪唑洗脱3 40mM咪唑洗脱；4 60mM咪唑洗脱；5 =IOOmM咪唑洗脱；6 500mM咪唑洗脱。箭头所指为目标蛋白Spro。图6为注射本发明的嗜虫沙雷菌Spro重组菌后，家蚕导致家蚕致死的照片。A，对照组，注射空载体细菌裂解液上清；B，实验组，注射重组菌裂解液上清。
具体实施例方式长期以来，本发明人一直致力于安全、有效的植物病原体防治生物制剂的开发。经过广泛的研究，首次揭示一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白。其对于棉铃虫等鳞翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用，可用于植物(作物)的虫害防治。如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，只要所述“植物”是易于被植物病原体(如鳞翅目昆虫)侵染的，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)棉花、小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、楼桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。如本文所用，所述的“植物病原体”是指可由本发明人的具有杀灭植物病原体活性的蛋白杀灭的任何病原体生物。例如鳞翅目的昆虫。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的Spro蛋白”或“分离的Spro多肽”是指Spro蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Spix)蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的蛋白(多肽)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或 不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括SpiO蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SpiO蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。任何一种Spro蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Spro蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的Spro蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长Spix)蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长Spro蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。在本发明中，术语“SpiO蛋白”指具有SpiO蛋白活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。该术语还包括具有与SpiO蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又t匕如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SpiO蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SpiO蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Spro蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Spix)蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 Spix)蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有SpiO蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供SpiO蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SpiO蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。 修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“Spro蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
氨基酸残基代表性的取代优选的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn (N)Gln ；His ；Lys ；ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys(C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro ；AlaAla
His (H)Asn ；Gln ；Lys ；ArgArg
He (I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeu
Leu (L)lie ；Val ；Met ；Ala ；Phelie
权利要求
1.一种分离的蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组 (a)如SEQID NO 2氨基酸序列的蛋白； (b)将SEQID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组 (a)编码如权利要求I所述蛋白的多核苷酸； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID N0:2所示氨基酸序列的蛋白。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体；或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种权利要求I所述的蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含 (a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞； (b)从培养物中分离出权利要求I所述的蛋白。
7.权利要求I所述的蛋白的用途，用于杀灭植物病原体。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的植物病原体是鳞翅目害虫。
9.一种农药组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求I所述的蛋白、或权利要求5所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物以及农药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的农药组合物，其特征在于，其pH值为6.0-9. O ;或其温度为20-55。。。
11.一种杀灭植物病原体的方法，其特征在于，将权利要求I所述的蛋白、或权利要求5所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物、或权利要求9或10所述的农药组合物施加于植物病原体。
12.—种提高植物抗病性的方法，包括将权利要求2所述的多核苷酸转入植物中。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法包括 (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求2-3任一所述的多核苷酸； (2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使权利要求2-3任一所述的多核苷酸转入植物细胞或组织或器官。
在另一优选例中，所述方法还包括 (3)选择出转入了权利要求2-3任一所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和 (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。
全文摘要
本发明涉及一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用。本发明的蛋白对于棉铃虫等鳞翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用，可用于植物(作物)的虫害防治。
文档编号C12N15/63GK102899304SQ201110210158
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者周志华, 孙琴, 严兴, 王钱福, 钱昌丽, 王成树 申请人:中国科学院上海生命科学研究院