专利名称：用于鸡蛋溯源的微卫星引物、其试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于鸡蛋溯源的微卫星引物、其试剂盒及应用。
背景技术：
鸡蛋因其价格便宜、蛋白质含量高、品质好等特点，是人们日常生活中必不可少的食物之一。尤其是我国这样的人口大国，鸡蛋消费量非常高，但如何保障鸡蛋的安全就成了一个棘手的问题，近年来三聚氰胺蛋、假鸡蛋等事件更是给鸡蛋安全带来问题，在这种情形下，鸡蛋产品的溯源势在必行。目前鸡蛋的普遍溯源流程由鸡场、加工包装厂和销售物流3个可追溯环节组成，可追溯信息包括蛋鸡孵化信息、蛋鸡养殖过程中与安全和品质相关的信息、蛋鸡产蛋信息、鸡蛋产后粗加工处理控制信息及鸡蛋物流销售信息等。适合鸡蛋标识的主要为条形码技 术。在众多条型码中，EAN-128码应用比较广泛，EAN-128码是根据EAN/UCC-128码标准将信息表示为条码符号，具有唯一性、通用性、完整性、紧密性及高可靠度等特性。由于其字符集大，密度高，所表示的信息可包含生产过程中的一些可变信息，如生产日期、批号等，实现了信息的快速、准确获取与传输。消费者能够获知产蛋日期、养殖者、养殖基地、产品等级、检测指标等属性，但其信息的可靠性却无从验证。微卫星DNA，又被称作短串连重复或简单重复序列，每单元长度在I 6bp之间，是首尾相连组成的串联重复序列。微卫星多态性分析在畜禽遗传多样性评估，品种资源的分类、保存和利用方面发挥着重要作用。此外，还可以利用微卫星多态性进行亲子鉴定，即以多个微卫星座位在群体中的等位基因的频率为基础，计算排除概率得出。目前随着生物信息学技术的发展和应用使得基于DNA的可追溯成为可能，尤其是畜禽个体本身“遗传条形码”的优越性不可改变，是畜禽产品溯源的终极解决方案。目前，应用微卫星DNA技术对鸡蛋进行分子溯源的方法还未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鸡蛋溯源的微卫星引物。本发明另一目的是提供一种含有上述引物的检测试剂盒。本发明再一目的是提供一种鸡蛋溯源的检测方法。本发明又一目的是提供上述微卫星引物或试剂盒在判断鸡蛋或蛋鸡遗传关系中的应用。本发明提供用于鸡蛋溯源的微卫星引物，其包括为Seq No ID I和2、Seq No ID3 和 4、Seq No ID 5 和 6、Seq No ID 7 和 8、Seq No ID 9 和 10、Seq No ID 11 和 12、SeqNo ID 13 和 14、Seq No ID 15 和 16、SeqNo ID 17 和 18、Seq No ID 19 和 20 所示的核苷酸序列中的一对或几对。进一步，本发明还提供含有上述引物的试剂盒。该试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本发明利用鸡蛋和蛋鸡样品的微卫星多态分析，分析它们的遗传关系。具体包括以下步骤I)分别提取蛋鸡DNA和鸡蛋DNA ；2)利用上述微卫星引物，分别以步骤I)中的蛋鸡DNA和鸡蛋DNA为模板进行PCR扩增；3)将PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，读取胶图判定基因型之后，使用Dispan软件计算奈氏遗传距离(Ds),判断其遗传关系。其中，所述鸡蛋DNA从鸡蛋卵黄膜中提取得到，所述蛋鸡DNA为从蛋鸡血液中提取得到。 所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min ;95°C变性30s，62_65°C退火30s，72°C延伸 30s，30-35 个循环;72°C延伸 7min。本发明的有益效果I)本发明的检测方法操作简单、快捷、费用低廉、准确度高，并可实现自动化的直接检测。2)本发明方法开发检测试剂盒的检测结果可靠、稳定、准确，为突发鸡蛋安全事件的相关责任认定提供判断依据。3)本发明从卵黄膜提取基因组DNA，基因组DNA含量达到74. 91±24. OOng/μ 1，将分子生物学方法用于鉴别真假鸡蛋，并且实现从鸡蛋到蛋鸡的生物学追溯，可有效监控市售鸡蛋的质量安全。
图I为四组样品的因子相关分析图，A代表来自中国农业大学实验鸡场的白来航未受精鸡蛋代表中国农业大学实验鸡场的白来航蛋鸡血样；C代表北京某祖代鸡场的白来航蛋鸡血样；D代表北京某祖代鸡场的洛岛红蛋鸡血样。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。随机选取以下待测样品A 40枚白来航未受精鸡蛋，来自中国农业大学实验鸡场；B 30份白来航蛋鸡血样，来自中国农业大学实验鸡场；C 30份白来航蛋鸡血样，北京某祖代鸡场；D 30份洛岛红蛋鸡血样，北京某祖代鸡场。实施例II、卵黄膜的分离从鸡蛋的钝端将鸡蛋磕开，用蛋清蛋黄分离器分离出蛋黄，用O. 9%的生理盐水冲洗卵黄，将卵黄放入培养皿，划开卵黄膜，再用O. 9%的生理盐水冲洗，分离出卵黄膜，之后放入一个新的培养皿中，再用O. 9%的生理盐水清洗，如此再重复，直至把蛋黄清洗干净，只剩下纯白色的卵黄膜。将处理后的卵黄膜放入2ml离心管中并在_20°C保存。2、蛋鸡血液样品的米集每只鸡翅下静脉采血1ml，置于盛有O. 3ml左右A⑶抗凝剂(I. 72%柠檬酸钠、I. 47%葡萄糖、O. 48%柠檬酸)的离心管中，混匀放入_20°C保存。3、DNA 的提取I)在装有卵黄膜或20 μ I A⑶抗凝血的离心管中加入700 μ I抗凝血裂解液(IOOmM Tris · Hcl (ΡΗ8. O), IOOmM EDTA (ΡΗ8. 0)，1%SDS)及 20 μ I 10% 蛋白酶 K，55。C水浴消化4小时。2)加入等体积的Tris饱和酚，缓慢摇匀15分钟，12000rpm离心12分钟，用枪头 吸取上清液至干净的离心管中。3)重复2)的步骤4)加入等体积的酚仿，缓慢摇匀15分钟，12000rpm离心12分钟，用枪头吸取上清
液至干净的离心管中。5)加入等体积的三氯甲烷，缓慢摇匀15分钟，12000rpm离心12分钟，用枪头吸取
上清液至干净的离心管中。6)加入1000 μ I无水乙醇，轻摇离心管，静置一段时间。7 )8000rpm离心5分钟，可见离心管底部有白色沉淀，弃上清，加600 μ I 70%乙醇，
继续离心5分钟，弃上清。8)真空干燥2分钟,加20 μ I去离子水,待室温溶解后放入_20°C保存。检测DNA浓度 60ng/ μ I ο4、PCR反应扩增10个微卫星座位分布于鸡的不同染色体上，多态性特异性强且相互之间不存在连锁关系。微卫星引物由上海生工合成。引物的序列及反应条件见表1、2。表I微卫星信息
权利要求
1.用于鸡蛋溯源的微卫星引物，其包括SeqNo ID I和2、Seq No ID 3和4、Seq NoID 5和 6、Seq No ID 7和 8、Seq No ID 9和 10、Seq No ID 11和 12、Seq No ID 13和 14、Seq No ID 15和16、Seq No ID 17和18、Seq No ID 19和20所示的核苷酸序列中的一对或几对。
2.含有权利要求I所述引物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂中的一种或几种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。
4.一种鸡蛋溯源的检测方法，包括以下步骤 1)分别提取蛋鸡DNA和鸡蛋DNA； 2)利用权利要求I所述微卫星引物，分别以步骤I)中的蛋鸡DNA和鸡蛋DNA为模板进行PCR扩增； 3)将PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析基因型，判断鸡蛋与蛋鸡的遗传关系O
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述鸡蛋DNA从鸡蛋卵黄膜中提取得到。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述蛋鸡DNA从蛋鸡血液中提取得到。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为95°C变性 30s，62-65°C退火 30s，72。。延伸 30s，30-35 个循环。
8.权利要求I所述微卫星引物、权利要求2或3所述试剂盒在判断鸡蛋和蛋鸡遗传关系中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于鸡蛋溯源的微卫星引物、其试剂盒及应用。本发明的鸡蛋溯源的微卫星引物为Seq No ID 1-20所示的核苷酸序列。本发明的检测方法操作简单、快捷、费用低廉、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明方法开发检测试剂盒的检测结果可靠、稳定、准确，为突发鸡蛋安全事件的相关责任认定提供判断依据。本发明从卵黄膜提取基因组DNA，将分子生物学方法用于鉴别真假鸡蛋，并且实现从鸡蛋到蛋鸡的生物学追溯，可有效监控市售鸡蛋的质量安全。
文档编号C12Q1/68GK102864225SQ20121035090
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者杨宁, 郑江霞 申请人:中国农业大学