一种致内皮细胞损伤的抗高血压药物筛选模型的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种同型半胱氨酸联合去甲肾上腺素致人静脉内皮细胞损伤的抗高血压药物筛选模型，通过加入一定浓度的同型半胱氨酸和去甲肾上腺素到体外培养的内皮细胞中，造成细胞损伤，以此建立细胞损伤模型。利用该模型，加入不同降血压天然药物，通过丙二醛(MDA)释放水平检测细胞活力，观察NO生成量，体外筛选以修复内皮细胞损伤为机制的抗高血压天然药物。本发明开创性地构建了一种接近高血压病理条件下的损伤模型，药物作用机制明确，适合大规模降血压天然药物的筛选。
【专利说明】一种致内皮细胞损伤的抗高血压药物筛选模型的构建及应
用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学【技术领域】，有关一种内皮细胞损伤模型建立，特别是同型半胱氨酸联合去甲肾上腺素致内皮细胞损伤的抗高血压天然药物的筛选方法。
【背景技术】
[0002]同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是一种含巯基的氨基酸,是甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物，其本身不参加蛋白质的合成。同型半胱氨酸在正常人血衆中的浓度通常为5.0 μ mol.L-1~16 μ mol.L—1。高同型半胱氨酸血症是一种以血浆中HCY浓度升高为主的疾病，轻度、中度和重度高同型半胱氨酸血症的血浆浓度分别为16 μ mol.L1 ~30 μ mol.L 1 > 31 μ mo I.L1 ~100 μ mol.L1 和大于 100 μ mol.L1,少数病人血浆中的HCY浓度可达到500 μ mol -1以上，发展成为高同型半胱氨酸尿症。大量流行病学调查和临床病例研究已证实，血液中同型半胱氨酸的浓度升高是独立于其它已知危险因素的致动脉粥样硬化危险因子。
[0003]有研究发现血液中HCY浓度升高可损伤血管内皮细胞，并能诱导或抑制内皮细胞中多种基因的表达。高同型半胱氨酸血症诱发心血管疾病的主要作用机制为氧化应激机制，HCY在自身氧化过程中，可产生超氧化物阴离子、过氧化氢及羟基等活性氧物质(reactive oxygen species, R0S),其可与NO反应加速NO失活，降低NO生物利用度；HCY本身也能与NO反应，为降解HCY的重要途径之一，直接导致NO浓度降低，使内皮细胞明显受损伤；HCY还能使低密度脂蛋白自身氧化，生成氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipo-protein, 0X-LDL),而后者可被巨噬细胞摄取并转变为泡沫细胞导致血管内皮细胞功能的进一步损伤，同时可影响一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, N0S)的表达进一步使NO合成减少。
[0004]去甲肾上腺素(Nor印in印hrine，NA)是肾上腺素去掉N-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。它既是一种神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，是后者释放的主要递质；也是一种激素，由肾上腺髓质合成和分泌，但含量较少。循环血液中的去甲肾上腺素主要来自肾上腺髓质。血管内皮细胞所处的环境中，NA浓度较高，血管内皮细胞受到NA调节的同时，也能够灭活NA。血管内皮细胞摄入NA后，在儿茶酹氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)和单胺氧化酶(monoamine oxidase,ΜΑ0)的作用下分别形成间甲去甲肾上腺素(normetanephrine)和3-甲氧-4-轻扁桃醒(3, 4-dihydroxyphenylglycoaldehyde, D0PGAL),后者再经醒脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ADH)和醒还原酶(aldehyde reductase, ADR)催化形成 3_ 甲氧-4-轻扁桃酸(3-methoxy-4-hydroxymandelic acid, VMA)和 3_ 甲氧-4-轻苯乙二醇(3-methoxy-4-hydroxyphenyIethylene glycol, M0PEG)。
[0005]COMT是血管内皮细胞灭活去甲肾上腺素等儿茶酚胺类物质的主要途径，当NA等儿茶酚胺类物质在细胞中过度积累浓度过高时，儿茶酚胺类物质中含有的邻苯酚基团能够发生自养化或催化氧化过程，生成醌及半醌类物质，同时产生氧自由基，细胞内的氧自由基能够对细胞膜产生损害。在COMT的存在下，以S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-Adenosy 1-L-methionine, SAM)为甲基供体,可将儿茶酹胺中的邻苯酹基团甲基化，这是血管内皮细胞灭活儿茶酚胺类物质的始动反应，同时SAM转化为S-腺苷-L-同型半胱氨酸(S-Adenosy 1-L-homocysteine, SAH),其在水解酶的作用下水解为HCY。在高同型半胱氨酸血症等情况下，细胞内的HCY浓度较高，是水解反应向逆反应方向进行，SAH浓度升高，SAH是COMT的非竞争性抑制剂，抑制COMT对儿茶酚胺类物质的甲基化反应，从而使含邻苯酚基团的儿茶酚胺类物质积累，产生氧自由基损伤血管内皮细胞。
[0006]MDA是细胞氧化损伤时的副产物，当细胞遭受氧自由基攻击时，生成微量的MDA，由于MDA在特定的可见光波长下有较强的吸收，所以将微量的MDA作为细胞损伤的指标。NO具有强大的血管保护作用:第一、NO与邻近的平滑肌细胞里的鸟苷酸环化酶作用，使肌肉松弛，血管扩张，增加血流量，与交感神经系统和肾素-血管紧张素系统的缩血管作用相拮抗，共同维持血管舒缩平衡;第二、NO能抑制血小板聚集和粘附，防止血栓形成。当血管受损时，血液中的血小板会凝结形成塞子凝结在血管壁，阻止过多的血流，进一步的凝结，就会使血液凝成血块，阻止血液流动，而NO能抑制血小板进一步凝结和粘结的作用；第三、NO能减少细胞间粘附因子-1、血管细胞粘附因子-1等的表达，阻止白细胞粘附到内皮或迁移到血管壁内；第四、NO能够抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移；第五、NO降低血管内皮通透性，抑制低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)氧化，并逆转异常的内皮氧化还原状态，因此被称为“内源性抗动脉粥样硬化因子”。
[0007]在已进行的HCY致血管内皮细胞损伤的实验研究中，采用的HCY浓度大多数在IOmmol.L-1以上，该浓度远远高于高同型半胱氨酸血症的病理浓度；同时还发现当低于IOmmol.L-1的HCY单独作用于血管内皮细胞时，则无明显的毒性损伤效应。据此推测上述IOmmol -L-1以上的高浓度HCY致血管内皮细胞的损伤作用可能为其本身的药理毒效应。因此，进一步研究较低浓度(≤IOmmol ^LlHCY致血管内皮细胞损伤作用，对于深入阐明HCY致AS的确切机制具有重要意义。
[0008]以体外培养的人脐静脉内皮细胞为研究对象，观察在生理浓度(10_9mol.Ι^)ΝΑ存在的情况下，较低浓度(IOymol -T1~10000 μ mol -L-1)的HCY对血管内皮细胞的损伤效应，目前并未有报道。也没有该损伤模型应用于天然降压药物筛选的先例。
【发明内容】
[0009]本发明第一个目的是构建了一种致人脐静脉内皮细胞ECV-304损伤的细胞模型，将同型半胱氨酸联合去甲肾上腺素加入细胞培养液中，两者共同作用引起细胞MDA释放增加，NO生成量减少，得到ECV-304细胞损伤模型。
[0010]本发明第二个目的是应用上述方法构建的细胞损伤模型进行降血压天然药物的筛选。根据损伤形成依赖NO信号转导途径，可以将其作为筛选降压药物的靶点。具体方法是将候选降血压药物加入构建好的细胞损伤模型中，通过检测MDA释放量，NO生成量筛选出对内皮细胞起保护作用的药物。
[0011]本发明提供了同型半胱氨酸联合去甲肾上腺素构建ECV304细胞损伤模型的降血压药物筛选方法，根据损伤机制将NO作为靶点，提高了降血压天然药物保护内皮细胞ECV-304的针对性，适合高通量的降血压天然药物筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1不同浓度HCY与生理浓度NA对MDA的影响。
[0013]图2不同浓度HCY与生理浓度NA对NO的影响。
[0014]图3不同药物对HCY与NA联合损伤的ECV-304细胞中MDA的影响。
[0015]图4不同药物对HCY与NA联合损伤的ECV-304细胞中NO的影响。
【具体实施方式】
[0016]药品与试剂
[0017]
【权利要求】
1.一种同型半胱氨酸联合去甲肾上腺素致人静脉内皮细胞损伤的抗高血压药物筛选方法，通过以下方法实现:将同型半胱氨酸和去甲肾上腺素混合后加入细胞培养基中，内皮细胞在生理环境中，NA浓度较高，如果NA在细胞中过度积累到一定浓度会产生氧自由基对细胞膜产生损害，HCY通过氧化应激机制产生活性氧(ROS)，ROS可以与NO反应，降低NO利用度，两者共同作用加剧损伤，得到细胞损伤模型，以丙二醛(MDA)释放量，NO生成量作为衡量模型损伤程度的标准。
2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸，其浓度范围在10μ mol.L—1~1000Oymol.L1致血管内皮细胞损伤作用。
3.根据权利要求1所述的去甲肾上腺素，其浓度范围在生理条件下10_9mol.L'
4.根据权利要求1所述的人静脉内皮细胞，其特征在于:所述人静脉内皮细胞为ECV-304 细胞。
5.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸联合去甲肾上腺素致人脐静脉内皮细胞损伤的抗高血压药物筛选方法应用于选择具有保护内皮细胞作用，修复内皮细胞功能的抗高血压天然药物。
【文档编号】C12N5/071GK103555650SQ201310393735
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】许激扬, 卞筱泓, 许娟, 沃龙飞, 赵刚刚 申请人:中国药科大学