专利名称：丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗皮肤病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及为丝氨酸蛋白酶的抑制剂的治疗性化合物、其药物组合物以及其在治 疗人体或动物体中的用途。更具体而言，本发明涉及用于治疗、诊断或预后皮肤病的方法， 包括向需要其的受试者给予治疗有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
背景技术：
蛋白酶或蛋白水解酶在生物体——从细菌和病毒至哺乳动物——中是必要的。蛋 白酶通过水解肽键消化和降解蛋白质。丝氨酸蛋白酶(EC. 3.4.21)的活性位点有共同的特 征，主要是有活性的丝氨酸残基。有两种主要类型的丝氨酸蛋白酶；胰凝乳蛋白酶/胰蛋 白酶/弹性蛋白酶样和枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，它们具有相同空间排列的催化性 His、Asp和Ser，但蛋白骨架完全不同。然而，超过20个家族的丝氨酸蛋白酶(S1-S27)已 被鉴定，基于结构相似性和其他功能证据将它们分成6族类SA、SB、SC、SE、SF和SG0胰凝 乳蛋白酶/胰蛋白酶/弹性蛋白酶样家族丝氨酸蛋白酶被细分成两类。“大型”类(约230 个残基)基本上包括哺乳动物酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶 和凝血酶。“小型”类(约190个残基)包括细菌酶。催化性His、Asp和Ser的侧翼是底物C末端或“主要(prime)，，侧的称为Sl ’、 S2'、S3'等以及N末端侧的称为S1、S2、S3等的底物氨基酸侧链残基结合袋。该术语 记载于 Structure and Mechanism in ProteinScience :A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding, Alan Fersht,1999(W. H. Freeman and Company)pages 40_43and Brik et al，Org. Biomol.Chem.，2003，1，5-14。胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶/弹性蛋白酶 样丝氨酸蛋白酶还可通过存在于Sl袋中的残基进一步细分，如Introduction toProtein Structure,Carl Branden and John Tooze, 1991(GarlandPublishing Inc)pages 231-241 中所述。细分物为胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Si袋中Gly-226、Ser-189和Gly-216)、 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Si中Gly-226、Asp-189和Gly-216)和弹性蛋白酶样丝氨酸蛋 白酶(Si中Val-226和Thr_216)，其中残基编号依据标准的胰凝乳蛋白酶编号进行。胰蛋 白酶样丝氨酸蛋白酶更倾向将Lys或Arg置于Sl袋中的底物。丝氨酸蛋白酶具有共同的催化机制，特征在于使用胰凝乳蛋白酶编号体系在位置 195处有一个特别有反应性的Ser残基。丝氨酸蛋白酶的实例包括胰蛋白酶、类胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、激肽释放酶、补体Cl、顶体蛋白酶、溶酶体蛋白 酶、蚕茧酶、α-水解蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶B、丝氨酸羧肽酶π、枯草杆菌蛋白酶、尿激酶 (uPA)、因子Vila、因子IXa和因子Xa。由于丝氨酸蛋白酶在调节种种生理过程中的作用， 它们多年以来已被广泛研究，并且是药物靶向研究的主要焦点。涉及丝氨酸蛋白酶的过程包括血液凝固、纤维蛋白溶解、受精、发育、恶化、神经肌 肉形成模式和发炎。公知的是，这些化合物可抑制多种血液蛋白酶，以及在组织中活化或释 放的蛋白酶。还已知的是，丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制关键的细胞过程，例如粘附、迁移、自 由基产生和凋亡。另外，动物实验表明，静脉内给药的丝氨酸蛋白酶抑制剂、变体或表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞可提供抵御组织损伤的保护。丝氨酸蛋白酶激肽释放酶(KLK)被证明在正常的皮肤生理学中起到关键作用。 KLK5 和 7 最初从角质层分离和克隆(Hansson et al. , 1994 ；Brattsand and Egelrud, 1999)，并被证明通过加工角质桥粒(corneodesmosome)(即角质锁链素(⑶SN)、桥粘素 I(DSGl)和和桥板素I(DSCl))的细胞外粘附蛋白参与皮肤脱屑(Caubet et al. ,2004 ； Descargues et al.，2005)。KLK5被证明可切割所有3种组分，而KLK7仅能够消化CDSN和 DSCl (Caubet et al.，2004)。进一步的IHC研究支持提出的KLK7在脱屑中的作用(Sondell et al.，1995)。体外研究证明了通过涉及KLK5和14的蛋白质水解级联的KLK7的潜在活 化机制(Brattsand et al. ,2005) 同时，已经报道了在SC中有不同水平的KLK1、6、8、10、 11 和 13 (Komatsu et al. ,2005 ；Borgono et al.，2006)，KLK1、5、6 和 14 被认为通过 DSGl 加工参与皮肤脱屑(Borgono et al.，2006)。KLK14被认为在皮肤重塑中起到主要作用，原 因是它贡献了 SC层中大约一半的总胰蛋白酶样蛋白水解活性(Stefansson et al.，2006)。 KLK8被认为在皮肤脱屑加工DSGl和CDSN中起到部分相同的作用(Kishibeet al.，2006)。 已在体外(in vitro)和体内(in vivo)证明了 KLK通过调节cathelicidin肽在皮肤中有 着额外的抗微生物功能(Yamasaki et al.，2006)。已有报道称，在大量皮肤病变中存在通过基因过表达或活性失调的KLK蛋白水 解活性不平衡，所述皮肤病变包括慢性瘙痒性皮炎、脱皮综合征、银屑病、特应性皮炎和内 瑟顿综合征(Netherton syndrome) (Komatsu et al.，2005b ；Descargues et al.，2005 ； Hachem et al.，2006 ；Komatsu et al.，2006 ；Hansson et al.，2002 ；Ekholm and Egelrud, 1999)。多种KLK的表达在银屑病、特应性皮炎、B型脱皮综合征和特应性皮炎的慢性损伤 中显著上调(Komatsu et al. , 2005b ；Komatsu et al. , 2006 ；Hansson et al.,2002)o 已 经证明，患有内瑟顿综合征(一种常染色体隐性皮肤病变)的患者在编码LEKTI的SPINK5 基因中出现了阅读框偏移和无义突变(Chavanas et al. ,2000 ；Komatsu et al. ,2002 ； Chavanas et al. ,2000 ；Sprecher et al.，2001)，LEKTI 为具有对抗多种 KLK (包括KLK5、6、 7、13 和 14)的活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Borgono et al.，2006 ；Egelrud et al.，2005 ； Deraison et al.，2007)。这类基因缺陷会导致抑制结构域的缺失(Chavanas et al. ,2000 ； Sprecher et al.,2001)o还感兴趣的是，激肽释放酶可能通过活化蛋白酶活化受体(PAR)参与脱屑型病变 的皮肤炎症。PAR 1-4为G蛋白偶联受体，被包括激肽释放酶在内的多种蛋白酶活化。特别 感兴趣的是PAR2，原因是它通过胰蛋白酶切割被活化，并且与组织激肽释放酶共存于皮肤 组织中。在特应性皮炎和内瑟顿综合征患者的皮肤损伤中，PAR2受体出现过表达并且与人 组织激肽释放酶共存(Descargues et al.，2006)。这导致了这样的假设，即这类KLK-PAR 通路参与这些疾病的发病机制，并且KLK经PAR2活化可在这些皮肤病变中诱导炎症。Oikonomopoulou et al. (2006)最近的体外和体内研究已证明，PAR活性可以被活 性KLK5、6和14靶向。KLK5和KLK6被发现可活化PAR2，而KLK14被报道可失活PARI以及 活化PAR2和PAR4。其他的报道表明了 PARI或PAR2在不同细胞类型中被KLKl、2、4、5、6和 14 活化(Mize et al.，2008 ；Stefansson et al.，2008 ；Vande 11 et al. ,2008)。对皮肤学家和化妆师来说，PAR2受体是有吸引力的研究靶标，这是由于它们涉及 皮肤炎症、细胞增殖、肿瘤抑制、皮肤色素沉着和皮肤潮湿。激肽释放酶作为PAR2受体的激活剂，正受到研究上文提及的皮肤过程的研究者越来越多的关注。大豆源的天然非变性 胰蛋白酶抑制剂被用作靶向皮肤色素沉着、UV暴露和皮肤潮湿的化妆产品的成分。大豆源 的豆种子(soy seed)和豆浆分别含有大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)和包曼-毕尔克抑制剂 (Bowman-Birk inhibitor, BBI) (Paine et al.，2001)。这些产品的所需效应归因于导致 PAR2活化被阻断的胰蛋白酶抑制作用。已经证明KLK5和KLK7在UVB辐照下过表达，同时 LEKTI表达降低，这表明了这些皮肤激肽释放酶在UVB应激下在角质层脱屑中的作用(Nin M et al. ，2008)。已被提出的是，STI可减少UV光诱导的皮肤癌，原因是外用STI可停止长期暴露 UVB的小鼠中的肿瘤进展(Huang et al.，2004)。已提出，包含天然大豆提取物的产品可通 过激肽释放酶抑制来阻断PAR2活化。STI已经被证明可高效率地抑制胰蛋白酶样KLK5和 14 (Brattsandet al.，2005)。已经报道了干燥皮肤的上层SC中的KLK5和7表达降低，以 及 UV 辐射后 KLK 活性升高(Voegeli et al.，2007)。丝氨酸蛋白酶抑制剂还已被预测可能在多个临床领域疾病的治疗中具有有益用 途，所述临床领域例如肿瘤学、神经病学、血液学、肺医学、免疫学、炎症和传染性疾病。丝 氨酸蛋白酶抑制剂还可能有助于如下疾病的治疗血栓性疾病、哮喘、肺气肿、肝硬化、关 节炎、癌、黑色素瘤、再狭窄、动脉粥样硬化、创伤、休克和再灌注损伤。有用的综述参见 Expert Opin. Ther. Patents (2002)，12(8)。丝氨酸蛋白酶抑制剂公开于美国公布的专利申 请 US 2003/0100089 和 2004/0180371，以及美国专利 6，784，182,6, 656，911,6, 656，910、 6，608，175,6, 534，495 和 6，472，393。皮肤病例如接触性超敏反应、特应性皮炎、罕有遗传性皮肤病(例如内瑟顿综合 征)和银屑病的特征在于超增殖性和炎症性皮肤反应。大量人群患有这些疾病。例如，特 应性皮炎——一种遗传性慢性皮肤病——在美国影响大约8百万成年人和儿童。人们认为， 包括遗传因素、环境因素和免疫因素在内的多因素的组合可能导致皮肤病。虽然大多数皮 肤病不是致命的，但是它们大大影响了患有这些疾病的患者的生命质量。通常用于治疗皮肤病的含类固醇软膏或抗组胺剂经常会造成很大的副作用。例 如，在长期使用时，外用或口服类固醇可使皮肤层变薄，造成骨质疏松并抑制儿童生长。还 出现的情况是，类固醇应用终止后经常会出现损伤复发。因此需要开发改良的非类固醇剂，用在用于治疗皮肤病的治疗性方法、预防性方 法或诊断方法中。本发明提供了用于治疗、诊断或预防皮肤病的改良且可靠的方法，包括向 需要其的受试者给予治疗有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些目标以及从前述应明显看出的其他目标已被本发明实现。
发明内容
本发明涉及治疗或预防皮肤病的方法，包括向哺乳动物给予包含重组体丝氨酸蛋 白酶抑制剂的药物组合物。还公开了丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备用于治疗皮肤病的药剂中的用途。本发明的另一目标是治疗或预防皮肤病的试剂盒，所述试剂盒包含重组体丝氨酸 蛋白酶抑制剂的药物组合物。通过阅读后面的具体实施方式
和随附的权利要求书，其他目标和优点对本领域技
6术人员将是明显的，所述具体实施方式
参考如下示例性附图进行。
图1表示hK2蛋白酶抑制剂MD 820的DNA和蛋白序列。图2表示hK2蛋白酶抑制剂MD 62的DNA和蛋白序列。图3表示hK2蛋白酶抑制剂MD 83的DNA和蛋白序列。图4表示hK2蛋白酶抑制剂MD 67的DNA和蛋白序列。图5表示hK2蛋白酶抑制剂MD 61的DNA和蛋白序列。图6表示hK2蛋白酶抑制剂MD 518的DNA和蛋白序列。图7表示hK2蛋白酶抑制剂MDCI的DNA和蛋白序列。图8表示野生型ACT的DNA和蛋白序列。图9表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-Gl的DNA和蛋白序列。图10表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-GlG的DNA和蛋白序列。图11表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-Cll的DNA和蛋白序列。图12表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-CllG的DNA和蛋白序列。图13表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-E5的DNA和蛋白序列。图14表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-E8的DNA和蛋白序列。图15表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-Fll的DNA和蛋白序列。图16表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-F3的DNA和蛋白序列。图17表示hK14蛋白酶抑制剂ACT-G9的DNA和蛋白序列。图18表示野生型AAT的DNA和蛋白序列。图19表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-Gl的DNA和蛋白序列。图20表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-GlG的DNA和蛋白序列。图21表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-Cll的DNA和蛋白序列。图22表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-C11G的DNA和蛋白序列。图23表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-E5的DNA和蛋白序列。图24表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-E8的DNA和蛋白序列。图25表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-Fll的DNA和蛋白序列。图26表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-F3的DNA和蛋白序列。图27表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-G9的DNA和蛋白序列。图28表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-G1V的DNA和蛋白序列。图29表示hK14蛋白酶抑制剂AAT-C11D的DNA和蛋白序列。图30示出用于转基因hKLK5小鼠内瑟顿模型的皮肤损伤的分级体系。图31示出在内瑟顿综合征小鼠模型上形成的皮肤损伤大小。在外用2%羟乙基纤 维素(Natrosol)(第1组，对照)或溶于2%羟乙基纤维素中的MDPK67b (第2组)后1、15 和28天监测损伤大小和损伤级别。
具体实施例方式本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备用于治疗皮肤病的药剂中的用途。丝氨酸蛋白酶抑制剂的生物学活性片段也可用于制备所述药剂。胰凝乳蛋白酶超家族的一些丝氨酸蛋白酶(包括t-PA、纤溶酶、U-PA和血液凝固 级联的蛋白酶)是除包含丝氨酸蛋白酶催化结构域还包含部分负责调节其活性的其他结 构域的大分子(Barrett, 1986 ；Gerard et al, 1986 ；Blasi et al.，1986)。重要的丝氨酸 蛋白酶有胰蛋白酶样酶，例如胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血酶、激肽释放酶和因子Xa。丝氨酸 蛋白酶的靶标与诸如以下过程相关血液凝固、补体介导的水解、免疫应答、肾小球肾炎、疼 痛感觉、炎症、胰腺炎、癌症、调节受精、细菌感染和病毒成熟。通过抑制对具体靶标有高专 一性的丝氨酸蛋白酶，可以在体内抑制很多生物学过程，这可能对宿主有明显的作用。丝氨酸蛋白质酶抑制剂(serpin)包含多组蛋白质，这些蛋白质形成已包含超 过100个来自多种生物体(例如病毒、植物和人)的成员的超家族。丝氨酸蛋白酶抑 制剂已演化超过5亿年，在系统发生学中分成有抑制功能和非抑制功能的蛋白质(Hunt and Dayhoff，1980)。非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂如卵清蛋白缺乏蛋白酶抑制活性 (Remold-O' Donnell, 1993) 0丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员的主要功能似乎是中和过表 达的丝氨酸蛋白质酶活性(Potempa et al.，1994)。丝氨酸蛋白酶抑制剂在细胞外基质重 塑、炎症反应的调节和细胞迁移中起作用(Potempa et al.，1994)。丝氨酸蛋白酶抑制剂分成如下家族牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(Kimitz)家族，也被 称为基础蛋白酶抑制剂(Ketcham et al. , 1978) ；Kazal家族；链霉菌属枯草杆菌蛋白酶抑 制剂家族；丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族；大豆胰蛋白酶抑制剂(Kimitz)家族；马 铃薯抑制剂家族；和包曼-毕尔克(Bowman-Birk)家族(Laskowski et al.，1980 ；Readet al. , 1986 ；Laskowski et al.，1987)。属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制 剂包括纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂PAI-1、PAI-2和PAI-3 ；Cl酯酶抑制剂，α -2-抗纤 维蛋白溶素、contrapsin、α-l-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、蛋白酶连接蛋白I、α-l-抗胰 凝乳蛋白酶、蛋白C抑制剂、肝素辅助因子II和生长激素调节蛋白(Carrelletal.，1987 ； Sommeretal.，1987 ；Suzuki et al.，1987 ；Stump et al.，1986)。许多丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较宽特异性，能够抑制胰凝乳蛋白酶超家族的蛋 白酶(包括血液凝固丝氨酸蛋白酶)和链霉菌属枯草杆菌蛋白酶超家族的丝氨酸蛋白 酶(Laskowski et al.，1980)。丝氨酸蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶的抑制已被综述于 Travis et al. (1983) ,Carrelletal. (1985)和 Sprengers et al. (1987)中。可获得大量 完整抑制剂和切割形式的丝氨酸蛋白酶抑制剂α-1-抗胰蛋白酶的晶体学数据(Read et al.，1986)，所述完整抑制剂包括BPTI、Kazal、SSI、大豆胰蛋白酶和马铃薯抑制剂家族的成 员。虽然这些丝氨酸蛋白酶抑制剂是具有不同大小和序列的蛋白质，但是迄今为止研究的 完整抑制剂都共同具有从所述分子表面伸出的特征环，称为反应位点环，该环包含所述同 源丝氨酸蛋白酶的活性位点的识别序列(Levin et al.，1983)。不同丝氨酸蛋白酶抑制剂 中环的结构相似性是惊人的(Papamokos et al.，1982)。每种抑制剂的特异性被认为主要 是由紧邻丝氨酸蛋白酶对抑制剂的可能的切割位点氨基末端的氨基酸的特性确定。该氨基 酸被称为Pi位点残基，被认为可与丝氨酸蛋白酶活性位点的丝氨酸形成酰键(Laskowski et al.，1980)。丝氨酸蛋白酶抑制剂是否拥有抑制功能强烈依赖于位于编码区羧基末端附 近的反应位点环的铰链区中的共有序列。在所述反应位点环外部，不同家族的丝氨酸蛋白 酶抑制剂一般是结构上不相关的，但Kazal家族和链霉菌属枯草杆菌蛋白酶家族的抑制剂呈现出一些结构和序列的相似性。提供在本文中使用的如下定义，目的是使对本发明的理解更容易。“a (—个)”或“an ( —种)”是指“至少一种”或“一种或多种”。术语“包含”通常用于表示包括的意思，就是说允许存在一个或多个特征或组分。本文使用的术语“蛋白”、“多肽”、“多肽的”、“肽”和“肽的”或“肽链”在本文中可以 互换使用，用于表示通过相邻残基的α"氨基和羧基之间的肽键连接的一串氨基酸残基。丝氨酸蛋白酶抑制剂优选为重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂并选自SEQID No 2、4、6、 8、10、12和14，或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。所述重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂还优选选自SEQ ID No 39_59或者其具有丝氨酸 蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。“氨基酸残基”是指本领域技术人员已知的任何氨基酸残基。这涵盖天然出现的氨 基酸(包括例如，使用三字母代码表示的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、 Leu、Lys, Met、Phe, Pro、Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)以及稀有和/或合成氨基酸及其衍生物 (包括例如 Aad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu> Des、Dpm> Hyl、McLys、McVal、Nva 等)。所述氨基酸残基或其衍生物可以是任意异构体，特别是任意手性异构体，例如 L-型或D-型。氨基酸衍生物在此是指本领域中已知的任意氨基酸衍生物。例如，氨基酸衍生物 包括可衍生自天然氨基酸的携带额外侧链(例如烷基侧链)和/或杂原子取代的的残基。“生物学活性片段”是指与各自的底物活性位点序列在长度上共享至少40%氨基 酸的序列。可以使用这些序列的条件是它们呈现与它们的天然来源序列相同的性质。这些 序列优选与各自的底物活性位点序列在长度上共享超过70 %，优选超过80 %，特别是超过 90%氨基酸。本发明还包括丝氨酸蛋白酶抑制剂序列的变体。术语“变体”是指具有在一定程 度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列是通过以下方式成为不同 于所述天然序列的氨基酸序列保守氨基酸置换，藉此一个或多个氨基酸被具有相同特征 和构象作用的另一氨基酸置换。所述氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的 某些位置处具有置换、缺失和/或插入。保守氨基酸置换在本文中定义为如下5组的一组 中的置换I.小的脂肪族、非极性或弱极性残基Ala、Ser, Thr、Pro、GlyII.极性、带正电荷残基His、Arg、LysIII.极性、带负电荷残基及其酰胺Asp、Asn、Glu、GlnIV.大的芳族残基Phe、Tyr、TrpV.大的脂肪族非极性残基Met、Leu、lie、VaUCys0本发明中应用的“给药”是指药物的、治疗的、诊断的药剂或组合物与受试者(优 选人)的接触。术语“激肽释放酶”涉及腺体或组织激肽释放酶。腺体或组织激肽释放酶是丝 氨酸蛋白酶亚家族，具有高度的底物特异性，并且在多种组织和生物流体中的表达不同。 术语“激肽释放酶”在20世纪30年代第一次出现于文献中，当时在胰(胰在希腊语中是 “Kallikreas”)分离物中发现了大量蛋白酶(Kraut et al. 1930，Werle 1934)。如今，激肽释放酶被分成两组，血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶，这两组激肽释放酶的分子量、底 物特异性、免疫学特征、基因结构和所释放激肽的类型显著不同。激肽释放酶包含15种 25_30kDa的同源单链的分泌型丝氨酸内肽酶的家族，有 直系同源物存在于来自至少6个哺乳动物目的物种中。这些激肽释放酶是hK2、hK3、hK2、 hK5、hK6、hK7、hK8、hK9、hK10、hKll、hK12、hK13、hK14 和 hK15。拟被抑制的激肽释放酶优 选选自 hK2、hK5、hK7 和 hK14。本文中使用的“疾病”是指多种原因(例如感染、遗传缺陷或环境应激)引起的生 物体部位、器官或系统的病理状态，并且其特征在于可辨认的一组体征或症状。表皮已被证明可表达多种丝氨酸蛋白酶，包括激肽释放酶、尿激酶、纤溶酶、 typtase样酶和中性粒细胞弹性蛋白酶。这些丝氨酸蛋白酶参与皮肤中的多种活动，包括表 皮细胞增殖、细胞分化、皮肤和脂质屏障平衡以及组织重塑。最重要的是，在最外皮肤层脱 落(称为脱屑)之前，丝氨酸蛋白酶和其他酶对角质层(SC)角质桥粒的蛋白水解是至关重 要的事件。再者，包括激肽释放酶、纤溶酶和尿激酶在内的蛋白酶活性增加参与到皮肤的炎 症反应。炎性皮肤病的列表示于表XX。还观测到蛋白酶活性增加，形式为对包括如紫外线辐照暴露和温度变化的环境因 子的多种刺激的应激反应，或者形式为对不同表面活性剂的反应。多种激肽释放酶(特别是hK5、hK7和hK14)是导致皮肤脱屑中的蛋白质水解级联 的原因。通过复杂的抑制和活化过程对这些蛋白水解过程进行控制，并且其去调控可以造 成严重的皮肤症。罕有遗传性疾病(内瑟顿综合征、脱皮综合征)以及较常见皮肤病如特 应性皮炎或银屑病的特征在于至少部分地由激肽释放酶活性增加造成的皮肤脱屑增加。本发明还涉及丝氨酸蛋白酶在制备用于治疗或改善不良皮肤病症的化妆品或药 妆品中的用途。丝氨酸蛋白酶抑制剂的生物学活性片段也可用于所述化妆品或药妆品中的 制备。“不良皮肤病症”在本发明中是指感染皮肤或皮肤外观的可能通常不将其看作是 疾病的问题。本文使用的“化妆品”是用于提升或保护人皮肤外观的组合物。化妆品包括皮肤 养护乳膏、洗齐 、粉齐 、香水、唇膏、指甲和趾甲上光齐 、眼睛和面部化妆品、烫发齐 、染发齐U、 头发喷雾剂和凝胶剂、除臭剂、婴儿产品、沐浴油、泡沫剂、沐浴盐、黄油和许多其它类型的
女口
广 PFt ο“药妆品”是被认为具有类似药物益处的化妆品产品。一般标记为药妆品的产品实 例包括抗衰老乳膏和保湿剂。药妆品可含声称的活性成分，例如维生素、植物化学品、酶、抗 氧剂和精油。本文使用的“皮肤病”涉及感染皮肤的病症。所述皮肤病通常选自表XX。本发明 优选适合于治疗皮肤病，例如特应性皮炎、接触性皮炎(变应性)、接触性皮炎(刺激性)、 湿疹、银屑病、痤疮、表皮过度角化、棘层肥厚、表皮炎症、真皮炎症或搔痒症、酒渣鼻、内瑟 顿综合征、A型和B型脱皮综合征、遗传性鱼鳞病、化脓性汗腺炎和红皮病(全身性剥脱性 皮炎)。所述皮肤病最优选选自内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病和脱皮综合征。内瑟顿综合征(NS)是由SPINK5(LEKTI)(皮肤激肽释放酶级联的一种主要抑制 剂)中的突变造成的罕有常染色体隐性遗传性皮肤病。激肽释放酶活性增加已经被证明是其临床症状的成因。NS (—种多系统鱼鳞病综合征)的特征在于鱼鳞病、红皮病、毛干缺陷 和异位性特征。由皮肤的屏障功能严重受损引起的多发性感染非常常见。NS非常罕见，但可获得的关于频率的数据很少，这可能部分地由于难以鉴定NS。 如今，每百万人诊断出不超过10例。可选的治疗方法十分有限且是非治愈性的。它们主要集中在处理各种皮肤感染以 及减少瘙痒和疼痛(例如皮质醇)。激肽释放酶(hK5、hK7、hK14)活性过大被证明是皮肤病变的症状的成因。天然激 肽释放酶抑制剂(LEKTI)活性的降低可以由其他激肽释放酶抑制剂代替。令人惊奇的是，申请人已证明(例如在实施例4中)，应用包括MD67 (SEQ ID N。8) 的丝氨酸蛋白酶抑制剂在小鼠模型(原位hK5过表达)中显著降低了症状的严重度，所述 症状出现于未处理的皮肤病(例如NS)模型中。所述症状的特征在于皮肤的严重脱皮，这 一点归因于由成熟前桥粒蛋白的降解导致的角质桥粒的分裂和角质层脱离。这一点会造成 皮肤屏障功能的严重丧失，导致严重的脱水、红斑和强擦伤。特应性皮炎(AD)是病因不详的瘙痒性疾病，它通常在婴儿早期开始并且以瘙痒、 湿疹损伤和皮肤干厚为特征。AD与其他特应性病(例如约30%的患者中的哮喘、变态反 应)相关，并且常见有皮肤感染。对AD的病理生理学了解很少。似乎有遗传成分。涉及TH2细胞异常的免疫缺陷被 提出，并且蛋白酶活性的失调被发现参与该疾病。该失调被认为可造成角质层中屏障功能 损坏，导致抗原进入，这会致使多种炎症细胞因子产生。在美国，儿童的患病率为10-12%， 成人为0.9%。在其他发达国家中，患病率高达18%且还在增加，特别是在发达国家中。该 疾病是慢性的，但大多数患者从童年期到成年期会有所好转。仍无治愈性疗法。根据症状严重程度，通常开出局部用类固醇、抗组胺剂和免疫调 节剂或者抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂的处方。银屑病是一种慢性病，它是非接触传染的并且通常呈现为发炎的皮肤水肿损伤， 但也出现于口腔粘膜上。10%患者的关节也受到影响(关节炎)。红肿块与多种全身和环境 因素包括应激事件或感染有关。银屑病有遗传倾向，并且有越来越多的自身免疫病变迹象 的证据。蛋白酶(例如激肽释放酶)活性增加参与到典型的皮肤脱屑过多。在美国，2-3% 的人群患病，每年出现超过200，000新病例。每年大约150万患有银屑病关节炎的人就医， 每年4万人死于银屑病相关原因。银屑病在其他国家的发病率类似，但取决于气候和人群 的遗传情况(genetic heritage) 0它不常见于热带和深肤色人中。目前，没有治愈性的疗法。根据症状严重程度可开出局部用皮质醇、煤焦油、角质 软化剂或类视色素的处方。用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农 场动物以及动物园动物、体育动物或宠物，例如狗、马、猫、奶牛、猴子等。哺乳动物优选是 人。“治疗”是指治疗性治疗和预防或防备措施。需要治疗者包括已经患有所述病变的 治疗者，以及待防备所述病变的治疗者。因此，待治疗的哺乳动物在本文中可以被诊断为患 有所述病变，或者可以对所述病变有倾向或易感。术语“受试者”是指人或其他哺乳动物患者，包括希望使用本发明的方法检查或治
11疗的任何个体。然而，应理解“患者”不是自动地表示存在症状或疾病。短语“可药用的”是指这样的分子实体和组合物，即它们是生理耐受的，并且在被 给予人时一般不产生变应性反应或类似的不良反应，例如反胃、头晕等。本文使用的术语“蛋白酶”是指一类识别分子并在所述分子中切割活化序列的酶。 所述蛋白酶可以是切割内部肽键的内肽酶。或者，所述蛋白酶可以是从多肽或蛋白分子的N 末端或C末端水解肽键的外肽酶。所述蛋白酶折叠成一种构象，以形成接受并切割所述活 化序列的催化位点。“抑制剂”是指优选通过结合激肽释放酶或丝氨酸蛋白酶来特异性抑制所述激肽 释放酶或丝氨酸蛋白酶的多肽或化合物。“反应性丝氨酸蛋白酶抑制剂环”、“反应位点环”或RSL是指出现于丝氨酸蛋白酶 抑制剂中并参与与可能的靶蛋白酶相互作用的暴露的柔性反应位点环。从易切断键的氨基 侧的残基开始离开所述键往外，残基通常称为PI、P2、P3等。所述易切断键后的残基称为 P1，、P2，、P3，等。RSL通常由6-12个氨基酸残基组成。本发明的“丝氨酸蛋白酶抑制剂”或丝氨酸蛋白酶抑制剂可选自α-1抗胰凝乳 蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制剂(PCI)、α-1抗蛋白质酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相关蛋 白前体(ATR)、α-2-纤溶酶抑制剂(ΑΑΡ)、人抗凝血酶-III前体(ATIII)、蛋白酶抑制剂 IO(PIlO)、人胶原结合蛋白2前体(CBP2)、蛋白酶抑制剂7(ΡΙ7)、蛋白酶抑制剂肝素辅因 子(leUSerpin)2(HLS2)、人血浆蛋白酶Cl抑制剂(ClINH)、单核细胞/中性粒细胞弹性蛋 白酶抑制剂(M/NEI)、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂_3(PAI3)、蛋白酶抑制剂4(PI4)、蛋白 酶抑制剂5(PI5)、蛋白酶抑制剂12(PI12)、人纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1前体内皮 型(PAI-I)、人纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-2胎盘型(PAI2)、人色素上皮衍生因子前体 (PEDF)、蛋白酶抑制剂6(PI6)、蛋白酶抑制剂8(PI8)、蛋白酶抑制剂9 (PI9)、人鳞状细胞癌 抗原1 (SCCA-I)、人鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、T4_结合球蛋白(TBG)、MegSin、蛋白酶抑制 剂14(PI14)、它们的片段、它们的分子嵌合体、它们的组合和/或它们的变体。由于大多数这些丝氨酸蛋白酶抑制剂具有不同的名称，本申请人给出了下表I，总 结它们的详细说明表 I
权利要求
丝氨酸蛋白酶抑制剂或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段在制备用于治疗皮肤病的药剂中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是重组体抑制剂蛋白。
3.权利要求1-2的用途，其中所述丝氨酸蛋白酶选自激肽释放酶、纤溶酶、胰凝乳蛋白 酶(Chtr)、尿激酶(uPA)、类胰蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、以及/或者它们的结 合物。
4.权利要求3的用途，其中所述激肽释放酶选自hK2、hK5、hK7和hK14、和/或它们的结合物。
5.权利要求1-4的用途，其中所述皮肤病选自内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病和脱 皮综合征。
6.权利要求5的用途，其中所述皮肤病为内瑟顿综合征。
7.权利要求1-6的用途，其中所述重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂选自SEQID No 2、4、6、 8、10、12和14、或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。
8.权利要求1-6的用途，其中所述重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂选自SEQID No 39-59， 或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。
9.一种用于在哺乳动物中治疗或预防皮肤病的方法，包括向所述哺乳动物给予包含重 组体丝氨酸蛋白酶抑制剂或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段的药物 组合物。
10.权利要求9的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶选自激肽释放酶、纤溶酶、胰凝乳蛋白 酶(Chtr)、尿激酶(uPA)、类胰蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、以及/或者它们的结 合物。
11.权利要求10的方法，其中所述激肽释放酶选自hK2、hK5、hK7和hK14、和/或它们的结合物。
12.权利要求11的方法，其中所述皮肤病选自内瑟顿综合征、特应性皮炎、银屑病和脱 皮综合征。
13.权利要求12的方法，其中所述皮肤病为内瑟顿综合征。
14.权利要求9-13的方法，其中所述重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂选自SEQID No 2、4、 6、8、10、12和14，或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。
15.权利要求9-13的方法，其中所述重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂选自SEQID No 39-59，或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。
16.一种用于治疗或预防皮肤病的试剂盒，所述试剂盒包含重组体丝氨酸蛋白酶，以及 任选的试剂和/或使用说明书。
17.一种用于改善不利皮肤病症的化妆品组合物，包含药物有效量的重组体丝氨酸蛋 白酶抑制剂或者其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的生物学活性片段。
18.权利要求17的化妆品组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为重组体抑制剂蛋白。
19.权利要求18的化妆品组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶选自激肽释放酶、纤溶酶、胰 凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)、类胰蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、以及/或者 它们的结合物。
20.权利要求21的化妆品组合物，其中所述激肽释放酶选自hK2、hK5、hK7*hK14、* /或它们的结合物。
21.丝氨酸蛋白酶抑制剂或其生物学活性片段在制备用于改善不利皮肤病症的化妆品 组合物中的用途。
22.一种用于在组织样品中诊断或预后皮肤病的检测测定法，包括将所述组织样品与 具有检测标记的重组体丝氨酸蛋白酶抑制剂相接触，确定并测量所述检测标记的量，并且 将该量与所述组织样品中存在或不存在疾病相关联。
全文摘要
本发明涉及为丝氨酸蛋白酶抑制剂的治疗性化合物，涉及其药物组合物并且涉及它们在治疗人体或动物体中的用途。更具体而言，本发明涉及用于治疗、诊断或预后皮肤病的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
文档编号A61K8/64GK101977626SQ200980109973
公开日2011年2月16日 申请日期2009年1月21日 优先权日2008年1月21日
发明者A·霍夫纳尼安, C·德雷松, C·昆丁, D·德佩尔特 申请人:德莫迪斯公司;国立健康与医学研究所